一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其制備方法和應用，在本發(fā)明的一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗中，其有效成分為經(jīng)本發(fā)明發(fā)明人自行分離且經(jīng)傳代致弱培養(yǎng)后獲得的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒，其保藏編號為CCTCC?NO：V201406。攻毒保護試驗結果顯示，本發(fā)明所制備的ORFV細胞弱毒疫苗安全，且能夠產(chǎn)生有效的免疫保護力。因此，本發(fā)明對于研制安全高效的弱毒疫苗以及用本發(fā)明公開的弱毒株規(guī)模化生產(chǎn)羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗來防控羊傳染性膿皰病具有重要的現(xiàn)實意義。
【專利說明】一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其制備方法和應用【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種弱毒疫苗及其制備方法和應用，特別涉及一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其制備方法和應用，本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品領域。
【背景技術】
[0002]羊傳染性膿皰病(Contagious ecthyma, CE)又名羊傳染性膿皰性皮炎(Contagious pustular dermatitis),俗稱“羊口瘡(Orf) ”,是由是由副痘病毒成員羊傳染性膿皰病毒(Orf virus, 0RFV)感染引起山羊、綿羊和人的一種急性、接觸性和嗜上皮性的的人獸共患傳染病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外陰等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀厚痂為特征。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為需申報類動物疾病，我國將其列為一類動物疫病。
[0003]該病最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，目前，幾乎在所有養(yǎng)羊國家和地區(qū)均存在。自然情況下主要侵害綿羊和山羊，山羊較為多發(fā)。此外，駱駝、牛、鹿、麝牛、貓、幼犬、猴和人均有易感性。本病常呈群發(fā)性流行的趨勢，3~6月齡羔羊最易感染，常引起群體發(fā)病，尤其是飼養(yǎng)密集的羊群。范春玲等報道了我國2006年在北京市亞福動物養(yǎng)殖中心暴發(fā)該病，該病傳播速度快，發(fā)病率高達95.4%。近年來隨著肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和羊頻繁流動，該病時有發(fā)生，甚至在一些大型種羊場都有該病的流行，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。更為嚴重的是，此病可以通過傷口感染飼養(yǎng)人員，感染者表現(xiàn)為手背、指間和前臂部皰疹和破潰。例如2005年8月福建省永安市有8名羊場養(yǎng)殖工人因感染羊傳染性膿皰病毒而發(fā)病?？梢?，羊傳染性膿皰不但嚴重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，而且威脅人類的身體健康，是一種危害較為嚴 重的人畜共患傳染病。
[0004]目前，羊口瘡流行地區(qū)尚無有效的治療方法，所以，免疫接種成為了防控該病唯一有效的方法。爆發(fā)該病時許多基層養(yǎng)殖人員直接取病羊的痂皮研磨后與鹽水混合制成自家疫苗對未感染羊只進行接種；雖然該方法能在一定程度上控制病情的發(fā)，展，但是卻具有散布強毒的危險。目前疫苗的發(fā)展和應用主要集中在常規(guī)疫苗，如滅活疫苗和細胞弱毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亞單位疫苗、核酸疫苗和重組疫苗上。但是目前，ORFV新型疫苗的研制還處于試驗階段，且新型疫苗往往制備過程繁瑣、技術要求高，應用于臨床還有很長一段路要走。滅活疫苗雖然國內(nèi)外學者均有研究，但其免疫效果有限，從未真正應用于臨床。目前，在臨床上應用較為廣泛的仍然是ORFV弱毒疫苗，因為它具有用量少，能誘導機體產(chǎn)生較強的細胞免疫和體液免疫能力，且產(chǎn)生免疫保護力的時間持久的特點。在國內(nèi)，雖然羊口瘡弱毒疫苗在青海省畜牧獸醫(yī)科學院獸醫(yī)研究所和甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所均有研制，但其弱毒都是上世紀80年代前后的毒株，目前國內(nèi)流行毒可能發(fā)生變異，很難保證其免疫的有效性。
[0005]本發(fā)明選用分離獲得的ORFV湖北通山縣分離毒株作為疫苗研制的候選毒株，利用牛睪丸支持細胞系傳代致弱，培育出符合“獸用新生物制品質(zhì)量標準”的ORFV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐熱凍干保護劑制備凍干弱毒疫苗，攻毒保護試驗結果顯示所制備的ORFV細胞弱毒疫苗能夠產(chǎn)生有效的免疫保護力。因此，本發(fā)明利用ORFV流行毒株研制安全高效的弱毒疫苗對于該病的防治具有重要的現(xiàn)實意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]針對現(xiàn)有羊傳染性膿皰弱毒疫苗的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其制備方法，以實現(xiàn)用簡單實用的制備方法生產(chǎn)出產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、成本低、并且安全可靠的疫苗。
[0007]本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的:
[0008]2009年11月中旬，湖北省通山縣某羊場有300多只I月~3月齡黑山羊羔羊發(fā)病，發(fā)病率達80%，主要表現(xiàn)為典型的口瘡癥狀，經(jīng)多種抗生素和驅(qū)蟲藥治療無效，I周后有40多只病羊死亡。本發(fā)明發(fā)明人通過對該病料進行病例復制、病毒分離，最終得到一株病毒株，經(jīng)病毒理化特性鑒定、針對羊傳染性膿皰病毒B2L基因的特異性PCR檢測及測序證明分尚得到的病毒株該病原為羊傳染性膿皰病毒病毒(王光祥等，湖北省羊口瘡病毒的分離鑒定，動物醫(yī)學進展，2012，33 (11):37 — 40)，并將該病毒命名為Orf Virus HB-TS09株，簡稱 0RFV/HB/09 株。
[0009]用MDBK細胞系對湖北株羊口瘡病料進行適應分離的Orf Virus HB-TS09株病毒傳代至17代，再將該細胞毒接種新生牛睪丸原代細胞進行傳代致弱，傳代至55代時進行本動物安全試驗發(fā)現(xiàn)，該細胞毒已致弱。然后繼續(xù)傳代至85代，每隔五代取病毒(滴度TCID5tl不低于IO6_°/0.1mL)的細胞毒進行本動物安全試驗，證實該毒株傳代至55代后對綿羊羔羊、成年綿羊以及山羊羔羊以及成年山羊均安全。故取75~85代之間的傳代毒作為制苗毒種。其中，選擇Orf Virus HB-TS09第65代細胞傳代致弱毒作為羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗株，命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，分類命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒，并于2014年3月19日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCC NO:V201406，保藏地址在武漢大學。
[0010]進一步的，本發(fā)明還提出了所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒在制備羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗中的應用。
[0011]本發(fā)明的一種羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗，其特征在于其有效成分為本發(fā)明所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒。
[0012]此外，本發(fā)明還提供了一種制備羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0013](I)病毒抗原的制備
[0014]選生長良好布滿單層的新生牛睪丸原代細胞(BT)，傾去營養(yǎng)液，按原營養(yǎng)液體積的1-10%接種羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65或其傳代毒的病毒液，吸附5-15分鐘后加DMEM維持液，調(diào)PH至7.0~7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37°C、5% C02濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)40~72h，細胞病變(CPE)達到75%以上時收獲病毒，置-20°C冰箱反復凍融兩次，然后進行無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗合格達到《中華人民共和國獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標準》中規(guī)定的各項指標，且病毒滴度(TCID5(i/0.1ml)不低于106/0.1mL時,作為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原,備用。[0015](2)疫苗的配制和凍干
[0016]將步驟(1)制備的各項指標都合格的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原與耐熱凍干保護劑以1:1的比例混勻后，以2mL/瓶無菌條件下封裝于鏈瓶內(nèi)，在低溫冷凍干燥機內(nèi)進行凍干，即為成品弱毒疫苗，將其在2~8°C下保存。
[0017]在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，按原營養(yǎng)液體積的5%接種羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65的病毒液吸附10分鐘后加DMEM維持液，調(diào)PH至7.0~
7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37°C、5% C02濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0018]在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述耐熱凍干保護劑中含有海藻糖30~70g/L，脫脂奶粉10~30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10~30g/L,明膠5~15g/L，精氨酸0.5~4g/L，維生素Cl~5g/L，剩余成分為超純水，更優(yōu)選的，所述耐熱凍干保護劑中含有海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C2.5g/L，剩余成分為超純水。
[0019]所述的耐熱凍干保護劑的制備方法包括:(I)對可高壓滅菌的物質(zhì):海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脫脂奶粉、明膠按各自比例溶于超純水中，加熱至50~60°C溶解后，116°C滅菌30分鐘；(2)將不耐高溫的物質(zhì)精氨酸、維生素C也按各自比例溶于超純水中，用孔徑為0.22 μ m濾膜過濾除菌:各組分別將(I)、(2)兩組份混合，得到所述的耐熱凍干保護劑。
[0020]相較于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0021]1、選用流行毒株的細胞傳代致弱毒來制備疫苗，保證了疫苗的免疫保護力；
[0022]2、利用本實驗室研制的針對ORFV病毒的耐熱凍干保護劑，解決了羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗僅能在-15°C條件下保存和運輸?shù)钠款i技術，使該疫苗儲存、運輸更方便。
[0023]本發(fā)明將為臨床上針對羊傳染性膿皰病的防控以及羊傳染性膿皰病毒在羊群中的清除提供了重要的物質(zhì)基礎和技術支撐，具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨具體實施例的描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不多本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明精神和范圍下可以對本發(fā)明的技術方案和細節(jié)形式和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。
[0025]實施例1羊傳染性膿皰病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的分離和致弱
[0026]1.1羊傳染性膿皰病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的分離鑒定
[0027]2009年11月中旬，湖北省通山縣某羊場有300多只I月~3月齡黑山羊羔羊發(fā)病，發(fā)病率達80%，主要表現(xiàn)為典型的口瘡癥狀，經(jīng)多種抗生素和驅(qū)蟲藥治療無效，I周后有40多只病羊死亡。本發(fā)明發(fā)明人對該病料進行病例復制，病毒分尚，最終得到一株病毒株，該病毒株經(jīng)病毒理化特性鑒定、針對羊傳染性膿皰病毒B2L基因的特異性PCR檢測及測序證明該病毒株為羊傳染性膿皰病毒病毒(王光祥等，湖北省羊口瘡病毒的分尚鑒定，動物醫(yī)學進展，2012，33 (11):37 — 40)，命名為 Orf Virus HB-TS09 株，簡稱 0RFV/HB/09 株。
[0028]1.2羊傳染性膿皰病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的致弱[0029]用MDBK細胞系對湖北株羊口瘡病料進行適應分離的Orf Virus HB-TS09株病毒傳代至17代，病毒TCID5tl達到105 4/0.lmL。利用牛睪丸原代(BT)細胞進行傳代致弱。傳代至55代(每代次細胞毒致細胞病變(CPE)良好)，毒價均在IO6_°/0.1mL以上，回歸本動物進行本動物安全試驗發(fā)現(xiàn)，該細胞毒已致弱。然后繼續(xù)傳代至85代，進行進一步的試驗。
[0030]1.3毒種純凈性檢驗
[0031]分別取傳代致弱毒55代、60代、65代、70代、75代、80代、85代7代次細胞毒，按現(xiàn)行《中國獸藥典》，2010版，附錄42頁進行無菌檢驗。各代次細胞毒無菌落生長；按現(xiàn)行《中國獸藥典》，2010版，附錄49頁進行支原體檢驗。各代次細胞毒無支原體生長；按現(xiàn)行《中國獸藥典》，2010版，附錄40頁進行外源病毒檢驗。各代次細胞毒無外源病毒污染；證明各代次致弱細胞毒純凈、無污染。
[0032]1.2致弱毒 株安全性檢驗
[0033]分別取傳代致弱毒55代、60代、65代、70代、75代、80代、85代(各代次細胞病
毒TCID5tl不小于106_°/0.1mL)，每代次細胞毒，以Iml的接種劑量(羊口腔黏膜劃線接種0.4mL、股內(nèi)側皮內(nèi)接種0.6mL)接種I年齡左右健康易感綿羊(從未患過羊傳染性膿皰病毒病、也未注射過羊傳染性膿皰病疫苗的健康易感綿羊)3只；以Iml的接種劑量(羊口腔黏膜劃線接種0.4mL、股內(nèi)側皮內(nèi)接種0.6mL)分別接種I年齡左右健康易感山羊(從未患過羊傳染性膿皰病毒病、也未注射過羊傳染性膿皰病疫苗的健康易感山羊)3只，共接種8組。隨機挑選綿羊、山羊各一只以ImL劑量接種生理鹽水(羊口腔黏膜劃線接種0.4mL、股內(nèi)側皮內(nèi)接種0.6ml)做對照?？谇徽衬澗€接種后每日測定接種羊和對照羊的體溫和口腔粘膜的病變情況，觀察15日，進行致弱毒株安全性評價。
[0034]結果:
[0035]接種各代次Orf Virus HB-TS09株致弱毒株的羊只組在觀察期內(nèi)，各試驗組羊只，在口腔粘膜均出現(xiàn)紅點，在接種后3天自行消失。對照羊正常。證明致弱毒株Orf VirusHB-TS09株對綿羊、山羊均安全、無致病性,是一株安全的疫苗弱毒株。
[0036]選擇Orf Virus HB-TS09第65代致弱毒株作為羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗株，命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65,并于2014年3月19日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCC NO:V201406，保藏地址在武漢大學。
[0037]實施例2羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗的制備
[0038]2.1羊傳染性膿皰弱毒抗原的制備
[0039]選生長良好布滿單層的新生牛睪丸原代細胞(BT)，傾去營養(yǎng)液，按原營養(yǎng)液體積的5%接種羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65的病毒液(CCTCC NO:V201406)，吸附10分鐘后加DMEM維持液，調(diào)PH至7.0，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37°〇、5%0)2濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)4811，細胞病變(CPE)達到80%時收獲，置_20°C冰箱反復凍融兩次，然后進行無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗合格達到《中華人民共和國獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標準》中規(guī)定的各項指標，Reed-Muench法測定Orf Virus HB-TS09F65的病毒滴度(TCID5(i/0.1ml)為106 5/0.1ml。共制備羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒病毒液5000ml作為制備疫苗的病毒抗原。
[0040]2.2.疫苗的配制和凍干
[0041]將2.1制備的各項指標都合格的羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒抗原與耐熱凍干保護劑(海藻糖5g/L、脫脂奶2g/L、聚乙烯吡咯烷酮2g/L、明膠lg/L、精氨酸0.15g/L、Vc0.25g/L、剩余成分為超純水，經(jīng)無菌處理得到的保護劑。)以體積比1:1的比例混勻后，以2mL/瓶無菌條件下封裝于鏈瓶內(nèi)，在低溫冷凍干燥機內(nèi)進行凍干，即為成品弱毒疫苗，并將其在2°C-8°C溫度下保存。共制備弱毒凍干疫苗三批每批1700瓶，批號為:20130526、20130822,20130829ο
[0042]實施例3羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗成品檢驗
[0043]3.1物理性狀
[0044]產(chǎn)品為微黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
[0045]3.2無菌檢驗
[0046]從制備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中每批苗隨機取三瓶，按現(xiàn)行《中國獸藥典》，2010版，附錄42頁進行，疫苗成品無細菌生長。
[0047]3.3支原體檢驗
[0048]從制備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中
每批苗隨機取三瓶，按現(xiàn)行《中國獸藥典》，2010版，附錄49頁進行支原體檢驗。各代次細胞毒無支原體生長；
[0049]3.4外源病毒檢驗
[0050]從制備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中
每批苗隨機取三瓶，按現(xiàn)行《中國獸藥典》，2010版，附錄40頁進行外源病毒檢驗。各代次細胞毒無外源病毒污染；證明各代次致弱細胞毒純凈、無污染。
[0051 ] 3.5凍干弱毒疫苗安全性檢驗
[0052]選健康羊傳染性膿皰病病史的成年綿羊(I年齡)和成年山羊(I年齡)各4只。進行疫苗安全檢驗。具體方法同1.2。
[0053]試驗結果表明，試驗羊只均未發(fā)現(xiàn)明顯的體溫變化和口腔病變。說明該弱毒疫苗對綿羊和山羊安全、無致病性。安全檢測合格。
[0054]3.6凍干羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗剩余水分測定
[0055]從制備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中每批苗隨機取三瓶，按現(xiàn)行《中國獸藥典》，2010版，附錄38頁進行測定，三批疫苗均符合規(guī)定。
[0056]3.7凍干羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗真空度測定
[0057]從制備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中
每批苗隨機取三瓶，按現(xiàn)行《中國獸藥典》，2010版，附錄48頁進行測定，三批疫苗均符合規(guī)定。
[0058]實施例4凍干弱毒疫苗效力檢驗
[0059]4.1從制備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫
苗中每批苗隨機取三瓶，按原量稀釋混合，用犢牛睪丸原代細胞測定半數(shù)感染量(TCID5tl)，要求羊口瘡凍干疫苗TCID5tl不低于106/0.lmL。
[0060]4.2每批疫苗用6月齡健康羔羊4只，于口腔下唇粘膜劃痕接種疫苗0.2mL,另用同樣條件的健康羔羊作對照，21~25天用強毒Orf Virus HB-TS09株攻擊(100ID5(i/0.2mL)。觀察10~15天，結果如表1所示。說明使用本發(fā)明的羊傳染性膿皰細胞弱毒株Orf Virus HB-TS09F65株所制備的凍干弱毒疫苗對綿羊和山羊免疫保護力好，可用臨床免疫預防羊羊傳染性膿皰病.[0061]表1凍干弱毒疫苗效力檢驗
[0062]
【權利要求】
1.羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒，命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒OrfVirus HB-TS09F65株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間為2014年3月19日，保藏編號為 CCTCC NO:V201406。
2.權利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒在制備羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗中的應用。
3.一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗，其特征在于有效成分為權利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒或其傳代毒。
4.一種制備權利要求3所述的羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)病毒抗原的制備 選生長良好布滿單層的新生牛睪丸原代細胞，傾去營養(yǎng)液，按原營養(yǎng)液體積的1-10%接種權利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒或其傳代毒的病毒液，吸附5-15分鐘后加DMEM維持液，調(diào)PH至7.0~7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37°C、5% C02濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)40~72h，細胞病變達到75%以上時收獲病毒，置-20°C冰箱反復凍融兩次，然后進行無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗，達到《中華人民共和國獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標準》中規(guī)定的各項指標，且病毒滴度不低于IO6TCID5tlA).1ml時，作為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原，備用； (2)疫苗的配制和凍干 將步驟(1)制備的各 項指標都合格的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原與耐熱凍干保護劑以體積比1:1的比例混勻后，以2mL/瓶無菌條件下封裝于鏈瓶內(nèi)，在低溫冷凍干燥機內(nèi)進行凍干，即為成品弱毒疫苗，將其在2°C _8°C下保存。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，按原營養(yǎng)液體積的5%接種權利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒的病毒液，吸附10分鐘后加DMEM維持液，調(diào)PH至7.0~7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37°C、5% C02濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述耐熱凍干保護劑中含有海藻糖30~70g/L，脫脂奶粉10~30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10~30g/L,明膠5~15g/L，精氨酸0.5~4g/L,維生素Cl~5g/L,剩余成分為超純水。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述耐熱凍干保護劑中含有海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C2.5g/L，剩余成分為超純水。
【文檔編號】A61K39/275GK104017776SQ201410160855
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權日:2014年4月21日
【發(fā)明者】劉湘濤, 王光祥, 尚佑軍, 張志東, 王艷華, 黎攝兒, 田宏, 吳錦艷, 陳妍, 逯忠新 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所