重組Exendin-4鼻腔噴霧劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種重組Exendin-4鼻腔噴霧劑及其制備方法，每100ml制劑中含：10-100mg重組Exendin-4、1mg粘膜滲透強(qiáng)化劑、0.01mg防腐劑、加緩沖液至100ml、所述的緩沖液組成為20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。血漿中重組Exendin-4濃度在給藥后1小時(shí)內(nèi)比肌肉注射高約20%，2-6小時(shí)內(nèi)是注射的2-70倍，鼻噴霧劑的生物利用度達(dá)40%以上，鼻噴霧劑藥效長。而且鼻噴霧劑給藥血漿中Exendin-4濃度高峰比肌肉注射提前45分鐘，說明使用粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖更利于重組Exendin-4進(jìn)入血液。重組Exendin-4鼻噴劑生物利用度高，說明2-型糖尿病治療除了肌肉注射外，可以利用更加簡(jiǎn)便有效的鼻腔噴霧的給藥物方式；進(jìn)入血液比注射快，使其作為藥物使用時(shí)能快速有效降低糖尿病患者的餐后血糖含量。
【專利說明】重組Exend i n-4鼻腔噴霧劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及重組Exendin-4鼻腔噴霧劑配方及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種世界性疾病，全球患者達(dá)3.66億，目前中國已超9200萬，其中90%為2-型糖尿病。Exendin-4是從希臘毒蜥中分離一種含39氨基酸殘基的多肽，與腸促胰島素GLP-1有53%的同源性。它通過葡萄糖依賴的促胰島素分泌、改善胰島細(xì)胞質(zhì)量、抑制胰高血糖素分泌、減緩胃排空等機(jī)制維持血糖濃度。2004年美國Amylin公司首先申請(qǐng)了化學(xué)合成Exendin-4的專利,商品名exenatide ;其注射液于2005年在美國上市,2009年5月在我國上市，商品名百泌達(dá)。目前百泌達(dá)醫(yī)生處方已超過740萬張，它能有效降低2-型糖尿病患者空腹及餐后血糖濃度、糖化血紅蛋白含量、改善脂代謝，同時(shí)減少低血糖發(fā)生及體重增加的風(fēng)險(xiǎn)，減少心血管病發(fā)生。作為一種治療2-型糖尿的新藥，Exendin-4將給使用口服降糖藥不能取得良好效果的患者帶來福音。
[0003]目前Exendin-4主要采用化學(xué)合成,市價(jià)高達(dá)7000元/mg。本實(shí)驗(yàn)室不僅選育了重組Exendin-4高產(chǎn)工程菌(發(fā)明專利:ZL 200810049811.5)，探索了重組Exendin-4中試技術(shù)，還優(yōu)化了重組 Exendin-4 純化工藝(ZL 200810049810.0, ZL 200910172667.9)，使重組Exendin-4成本降至每毫克2.6元。目前臨床上Exendin-4采用皮下注射給藥,給病人帶來了很多不便和痛苦，為了簡(jiǎn)化其給藥方式，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)重組Exendin-4的鼻腔給藥途徑進(jìn)行了研究。
[0004]蛋白質(zhì)及多肽藥物鼻腔給藥限制因素很多，首先是蛋白質(zhì)及多肽在藥劑體系中的穩(wěn)定性，即在使用狀態(tài)下蛋白質(zhì)及多肽在一定的時(shí)間如10-15天內(nèi)不降解；其次是蛋白質(zhì)及多肽藥物的生物利用度，鼻腔粘膜對(duì)進(jìn)出膜的分子具有選擇性，這些大分子不容易透過鼻腔粘膜；第三是給藥的準(zhǔn)確性及對(duì)鼻腔粘膜的安全性。由于上述因素的限制，目前鼻腔給藥成功的蛋白質(zhì)及多肽藥物，全球只有一種，即鮭魚降鈣素(含32個(gè)氨基酸殘基的多肽)，有3家公司的鮭魚降鈣素鼻噴霧劑上市，生物利用度達(dá)50%。
[0005]鼻腔給藥進(jìn)入血液中的劑量因個(gè)體差異，沒有注射的藥物精確，但Exendin-4是依賴于血糖濃度起作用，進(jìn)入藥量不準(zhǔn)確，如多一點(diǎn)不會(huì)出現(xiàn)低血糖情況，少一點(diǎn)可以加大劑量，非常安全。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供重組Exendin-4鼻噴霧劑的配方及使用方法，用該配方能獲得藥物穩(wěn)定性好、生物利用度高的重組Exendin-4鼻噴霧劑。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑,每100 ml制劑中含:
10-100 mg 重組 Exendin-4
I mg粘膜滲透強(qiáng)化劑0.01 mg防腐劑 加緩沖液至100 ml,
所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80?
[0008]所述的粘膜滲透強(qiáng)化劑為殼聚糖。
[0009]所述的防腐劑為苯扎氯銨。
[0010]本發(fā)明的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑的制備方法，包括如下步驟:
(1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室溫配制，滅囷后保存；
(2)將防腐劑加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ；
(3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)pH為4，然后加入上述緩沖液至終質(zhì)量體積濃度1% ；
(4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度10-50mg/ml,然后用緩沖液定容,原藥濃度為0.1-lmg/ml ο
[0011]配好的重組Exendin-4鼻噴霧制劑置于4°C保存。
[0012]本發(fā)明的有益效果:含1%殼聚糖，鼻噴劑量是注射的5倍時(shí)，血漿中重組Exendin-4濃度在給藥后I小時(shí)內(nèi)比肌肉注射高約20%，2_6小時(shí)內(nèi)是注射的2_70倍，鼻噴霧劑的生物利用度達(dá)40%以上，鼻噴霧劑藥效長。而且鼻噴霧劑給藥血漿中Exendin-4濃度高峰比肌肉注射提前45分鐘，說明使用粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖更利于重組Exendin-4進(jìn)入血液。重組Exendin-4鼻噴劑生物利用度高，說明2-型糖尿病治療除了肌肉注射外，可以利用更加簡(jiǎn)便有效的鼻腔噴霧的給藥物方式；進(jìn)入血液比注射快，使其作為藥物使用時(shí)能快速有效降低糖尿病患者的餐后血糖含量。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1用于臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
本實(shí)施例的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑，用于臨床前動(dòng)物(如兔子，體重2 Kg)實(shí)驗(yàn)，每100 ml制劑中含:
10 mg 重組 Exendin-4
I mg粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖
0.01 mg防腐劑苯扎氯銨
加緩沖液至100 ml,
所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0014]其制備制備方法，包括如下步驟:
(1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室溫配制，滅囷后保存；
(2)將防腐劑苯扎氯銨加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ；
(3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)PH為4，然后加入上述緩沖液至質(zhì)量體積濃度1% ；
(4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度10mg/ml,然后用緩沖液定容，原藥濃度為0.lmg/ml。[0015]實(shí)施例2用于臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
本實(shí)施例的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑，用于臨床前動(dòng)物(如兔子，體重2 Kg)實(shí)驗(yàn)，每100 ml制劑中含:
20 mg 重組 Exendin-4
I mg粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖
0.01 mg防腐劑苯扎氯銨
加緩沖液至100 ml,
所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0016]其制備制備方法，包括如下步驟:
(1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室溫配制，滅囷后保存； (2)將防腐劑苯扎氯銨加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ；
(3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)PH為4，然后加入上述緩沖液至質(zhì)量體積濃度1% ；
(4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度10mg/ml,然后用緩沖液定容，原藥濃度為0.2 mg/ml。
[0017]實(shí)施例3用于臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
本實(shí)施例的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑，用于臨床前動(dòng)物(如兔子，體重2 Kg)實(shí)驗(yàn)，每100 ml制劑中含:
30 mg 重組 Exendin-4
I mg粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖
0.01 mg防腐劑苯扎氯銨
加緩沖液至100 ml,
所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0018]其制備制備方法，包括如下步驟:
(1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室溫配制，滅囷后保存；
(2)將防腐劑苯扎氯銨加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ；
(3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)PH為4，然后加入上述緩沖液至質(zhì)量體積濃度1% ；
(4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度10mg/ml,然后用緩沖液定容，原藥濃度為0.3 mg/ml。
[0019]實(shí)施例4用于臨床
本實(shí)施例的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑,用于臨床研究(60-80kg體重,每100 ml制劑中含:
40 mg 重組 Exendin-4
I mg粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖
0.01 mg防腐劑苯扎氯銨 加緩沖液至100 ml,所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0020]其制備方法包括如下步驟:
(1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室溫配制，滅囷后保存；
(2)將防腐劑苯扎氯銨加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ；
(3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)PH為4，然后加入上述緩沖液至質(zhì)量體積濃度1% ；
(4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度50mg/ml,然后用緩沖液定容，原藥濃度為0.4 mg/ml。
[0021](5)使用時(shí)采用在4°C保存15天的小包裝如50ml，每次每個(gè)鼻孔噴100 μ I。
[0022]實(shí)施例5用于臨床
本實(shí)施例的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑,用于臨床研究(60-80kg體重,每100 ml制劑中含:
60 mg 重組 Exendin-4
I mg粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖 0.01 mg防腐劑苯扎氯銨 加緩沖液至100 ml,
所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0023]其制備方法包括如下步驟:
(1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室溫配制，滅囷后保存；
(2)將防腐劑苯扎氯銨加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ；
(3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)PH為4，然后加入上述緩沖液至質(zhì)量體積濃度1% ；
(4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度50mg/ml,然后用緩沖液定容，原藥濃度為0.6 mg/ml ο
[0024](5)使用時(shí)采用在4°C保存15天的小包裝如50ml，每次每個(gè)鼻孔噴100 μ I。
[0025]實(shí)施例6用于臨床
本實(shí)施例的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑,用于臨床研究(60-80kg體重,每100 ml制劑中含:
80 mg 重組 Exendin-4
I mg粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖
0.01 mg防腐劑苯扎氯銨 加緩沖液至100 ml,
所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0026]其制備方法包括如下步驟:
(1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室溫配制，滅囷后保存；
(2)將防腐劑苯扎氯銨加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ；(3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)PH為4，然后加入上述緩沖液至質(zhì)量體積濃度1% ；
(4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度50mg/ml,然后用緩沖液定容，原藥濃度為0.8 mg/ml。
[0027](5)使用時(shí)采用在4°C保存15天的小包裝如50ml，每次每個(gè)鼻孔噴100 μ I。
[0028]實(shí)施例7用于臨床
本實(shí)施例的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑,用于臨床研究(60-80kg體重,每100 ml制劑中含:
40 mg 重組 Exendin-4
I mg粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖
0.01 mg防腐劑苯扎氯銨 加緩沖液至100 ml,
所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0029]其制備方法 包括如下步驟:
(1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80,室溫配制，滅囷后保存；
(2)將防腐劑苯扎氯銨加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ；
(3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑殼聚糖溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)PH為4，然后加入上述緩沖液至質(zhì)量體積濃度1% ；
(4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度50mg/ml,然后用緩沖液定容，原藥濃度為0.4 mg/ml。
[0030](5)使用時(shí)采用在4°C保存15天的小包裝如50ml，每次每個(gè)鼻孔噴100 μ I。
[0031]本發(fā)明重組Exendin-4鼻噴霧制劑的穩(wěn)定性及生物利用度鑒定。
[0032](I)穩(wěn)定性鑒定:依據(jù)蛋白質(zhì)鼻噴霧制劑的使用方法，一般保存在冰箱的4°C冷藏室。我們對(duì)PH5.0至7.0的一系列鼻噴霧制劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了鑒定。每隔3天從不同pH值得鼻噴霧制劑取20 μ I樣品，變性后，利用Ticin-SDS-PAGE鑒定重組Exendin-4的降解程度。發(fā)現(xiàn)pH6的鼻噴霧制劑穩(wěn)定性最好,在4°C保存15天時(shí),重組Exendin-4約為對(duì)照的60% (見圖1)。而且每天噴26ug(200ul)，連續(xù)I個(gè)月對(duì)日本大耳白兔鼻噴實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該鼻噴霧制劑對(duì)兔子鼻腔無刺激性，兔子生長正常。
[0033](2)生物利用度測(cè)定:
本研究利用3月齡日本大耳白兔子進(jìn)行了重組Exendin-4鼻噴霧制劑生物利用度測(cè)定。兔子皮下注射重組Exendin-4劑量為2.6 μ g/Kg,給藥200 μ I。鼻噴重組Exendin-4劑量為13μ g/Kg，每個(gè)鼻孔各噴100 μ I。耳緣靜脈取血每次抽0.2ml，血樣于4°C、3200rpm離心10min,上清于-80°C保存?zhèn)溆?。利用Exendin-4 EIA試劑盒(型號(hào):s_1297, Bachem)及Multiskan GO型酶標(biāo)儀測(cè)定血衆(zhòng)中重組Exendin-4濃度。利用0rigin8.0軟件來處理數(shù)據(jù)，利用SPSS 18.0分析血漿中重組Exendin-4濃度，利用DAS 2.0軟件分析藥代動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果表明含1%殼聚糖的重組Exendin-4鼻噴霧制劑于給藥后25min血衆(zhòng)Exendin-4中重組達(dá)到高峰，皮下注射于給藥后Ihr達(dá)到高峰；鼻腔給藥比皮下注射藥效快。其次，含1%殼聚糖的重組Exendin-4鼻噴霧制劑可以較長時(shí)間在血液中維持一定的濃度，生物利用度高達(dá)40%以上(見圖2)。[0034] 本實(shí)驗(yàn)室在大量實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了重組Exendin-4鼻噴霧劑緩沖成分、pH值、吸收促進(jìn)劑，給藥體積、給藥劑量，與注射方法相比，重組Exendin-4鼻噴霧劑的生物利用度達(dá)40%以上，而且血漿中Exendin-4高峰比注射提前45分鐘。
【權(quán)利要求】
1.一種重組Exendin-4鼻腔噴霧劑,其特征在于每100 ml制劑中含: 10-100 mg 重組 Exendin-4 1mg粘膜滲透強(qiáng)化劑 0.01 mg防腐劑 加緩沖液至100 ml, 所述的緩沖液組成為20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80?
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑，其特征在于:所述的粘膜滲透強(qiáng)化劑為殼聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑，其特征在于:所述的防腐劑為苯扎氯銨。
4.權(quán)利要求1所述的重組Exendin-4鼻腔噴霧劑的制備方法,其特征在于包括如下步驟: (1)基本緩沖液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室溫配制，滅囷后保存； (2)將防腐劑加入上述緩沖液，質(zhì)量體積濃度為0.01% ； (3)將粘膜滲透強(qiáng)化劑溶于0.5%的鹽酸溶液中使其質(zhì)量體積濃度為4%，然后調(diào)節(jié)pH為4，然后加入上述緩沖液至終質(zhì)量體積濃度1% ； (4)原藥濃度:將冷凍干燥的重組Exendin-4用去離子水稀釋至儲(chǔ)液濃度10-50mg/ml,然后用緩沖液定容,原藥濃度為0.1-lmg/ml。
【文檔編號(hào)】A61K9/12GK103948544SQ201410137752
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】王小純, 楊光, 徐良, 楊好冬 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)