一種高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體，采用鼠腦懸液JEV（SA14）免疫BALB/c×昆明鼠子一代，制備了一組小鼠抗JEV?mAbs。本發(fā)明克隆了高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因和氨基酸序列，序列分析證實(shí)了該抗體序列的惟一性。將本發(fā)明的2F2mAb重鏈可變區(qū)基因的CDR區(qū)移植到人源可變區(qū)的FR中，形成CDR移植抗體也稱重構(gòu)抗體或人源化抗體。利用CDR移植技術(shù)改造抗體，可獲得保持鼠源性親本mAb的特異性，而又更加接近人抗體的新型抗體，用于制備對(duì)流行性乙型腦炎有治療作用的人源化抗體，為構(gòu)建高親和力的抗流行性乙型腦炎病毒基因工程抗體打下基礎(chǔ)。
【專利說明】一種高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)。
【背景技術(shù)】
[0002]日本腦炎(我國(guó)又稱流行性乙型腦炎)是由日本腦炎病毒(Japaneseencephalitis virus, JEV)引起的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,是一種人畜共患傳染病,流行于我國(guó)廣大地區(qū)，臨床以高熱、驚厥、意識(shí)障礙及腦膜刺激癥為主，病死率達(dá)10~20%，幸存者后遺癥可達(dá)15~50%，是衛(wèi)生部公布的死亡人數(shù)最多的六種傳染病之一，仍然嚴(yán)重威脅人民生命健康。此外， 近年來日本腦炎的流行地域有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，已成為熱帶、亞熱帶地區(qū)一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，更可作為潛在的生物戰(zhàn)劑使用，其重要性不容忽視。
[0003]目前，JEV致病機(jī)理認(rèn)為:病毒經(jīng)帶毒蚊子叮咬進(jìn)入人體，先在皮膚毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核局部淋巴結(jié)等處增殖，經(jīng)毛細(xì)血管和淋巴管進(jìn)入血流，引起第一次毒血癥。隨后，病毒隨血流播散到肝、脾等處的單核巨噬細(xì)胞中繼續(xù)大量增殖后，再次入血，引起第二次病毒血癥，臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、寒戰(zhàn)、全身不適等流感樣癥狀。絕大多數(shù)感染者病情不再繼續(xù)發(fā)展，成為隱性感染。少數(shù)免疫力不強(qiáng)的病人，病毒可突破血腦屏障侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)增殖，引起腦實(shí)質(zhì)和腦膜炎癥，出現(xiàn)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)為高熱、頭痛、嘔吐、驚厥、抽搐、腦膜刺激征等，進(jìn)一步可發(fā)展為昏迷、中樞性呼吸衰竭或腦疝而導(dǎo)致死亡。乙腦感染后免疫力穩(wěn)定而持久,其中體液免疫起到主要作用，感染后機(jī)體和產(chǎn)生具有中和作用的特異性IgM、IgG抗體和/或血凝抑制抗體。因此能夠盡早從患者體內(nèi)清除病毒，對(duì)于組織JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞、在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)增殖以及隨后的病理?yè)p傷、病情發(fā)展有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，獲得高中和活性小鼠抗JEV單克隆抗體的可變區(qū)基因的核苷酸序列以及該基因編碼的氨基酸序列。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0006]一種高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體，包括重鏈和輕鏈，所述輕鏈的可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)序列為:
[0007]CDRl:Gln-Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Gly-Tyr-Ser-Tyr ；
[0008]CDR2 =Leu-Val-Ser ；
[0009]CDR3:Gln-His_Ile-Arg-Glu-Leu-Thr-Arg ；
[0010]所述重鏈的可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)序列為:
[0011 ] CDRl:Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Ala ；[0012]CDR2:1le-Asn-Thr-Ala-Thr-Gly-Glu-Pro ；
[0013]CDR3:Ala-Ser-Asp-Gly-Arg-Tyr-Trp-Tyr-Phe-Gly-Val。
[0014]所述的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015]編碼單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID N0.3所示，編碼單克隆抗體重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID N0.4所示。
[0016]高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體在制備以流行性乙型腦炎病毒為靶點(diǎn)的基因工程抗體或疫苗的應(yīng)用。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0018]1、本發(fā)明采用鼠腦懸液JEV (SA14)免疫BALB/cX昆明鼠子一代，制備了一組小鼠抗JEV mAbs。用ELISA篩選出分泌JEV雜交瘤細(xì)胞。在微量阻止培養(yǎng)中和實(shí)驗(yàn)中，測(cè)得抗體效價(jià)為320000，在小鼠的被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)得抗體的效價(jià)為3，200，000。編碼2F2mAb可變區(qū)基因序列在構(gòu)建對(duì)流行性乙型腦炎有治療作用的嵌合抗體和人源化抗體等方面有巨大潛力。
[0019]2、本發(fā)明克隆了高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因和氨基酸序列，序列分析證實(shí)了該抗體序列的惟一性。
[0020]3、本發(fā)明通過ELISA試驗(yàn)，說明純化的抗日本腦炎病毒單克隆抗體重鏈可變區(qū)能與乙型腦炎病毒特異性結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)該序列的有效性。
[0021]4、分別分析并獲得了輕鏈和重鏈可變區(qū)的⑶R，將本發(fā)明的2F2mAb重鏈可變區(qū)基因的CDR區(qū)移植到人源可變區(qū)的FR中，形成CDR移植抗體也稱重構(gòu)抗體或人源化抗體。利用CDR移植技術(shù)改造抗體，可獲得保持鼠源性親本mAb的特異性，而又更加接近人抗體的新型抗體，用于制備對(duì)流行性乙型腦炎有治療作用的人源化抗體，為構(gòu)建高親和力的抗流行性乙型腦炎病毒基因工程抗體打下基礎(chǔ)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明的單抗輕鏈可變區(qū)基因的同源性分析結(jié)果；
[0023]圖2為本發(fā)明的單抗重鏈可變區(qū)基因的同源性分析結(jié)果；
[0024]圖3為本發(fā)明的單抗輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的同源性分析結(jié)果；
[0025]圖4為本發(fā)明的單抗重鏈可變區(qū)氨基酸序列的同源性分析結(jié)果；
[0026]圖5為本發(fā)明的2F2VH基因的原核表達(dá)活性ELISA鑒定結(jié)果分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明提供一種抗日本腦炎病毒單克隆抗體，用鼠腦懸液JEV (SA14)免疫BALB/c和昆明鼠雜交的子一代鼠，制備了一組小鼠抗JEV的單克隆抗體，從中篩選出高中和活性的2F2雜交瘤細(xì)胞株，該株雜交瘤細(xì)胞，具有穩(wěn)定分泌抗體的能力，然后制備腹水獲得高親和力抗JEVmAb ;并確認(rèn)該基因序列和相應(yīng)蛋白序列的惟一性及其CDR序列；為抗日本腦炎病毒嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。
[0028]下面結(jié)合具體單克隆抗體的制備方法、抗體活性檢測(cè)，以及序列的檢測(cè)和唯一性的確定對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。[0029]I小鼠抗JEV高中和活性單克隆抗體的制備
[0030]1.1單克隆抗體的制備、純化
[0031]用鼠腦懸液JEV (SA14)免疫BALB/cX昆明鼠子一代，制備一組小鼠抗JEV單克隆抗體。從中篩選出高效價(jià)的2F2mAb，制備腹水，采用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法和離子交換層析純化。純化產(chǎn)物_20°C保存。
[0032]1.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)
[0033]JEV感染鼠腦，經(jīng)蔗糖密度梯度法提純病毒，按間接法檢測(cè)JEV特異抗體。步驟如下，用提純病毒包被ELISA孔板，一抗加2F2單克隆抗體，二抗加HRP-兔抗鼠IgG，顯色液顯色。測(cè)得抗體稀釋倍數(shù)為10Λ
[0034]1.3微量組織培養(yǎng)中和試驗(yàn)
[0035]雜交瘤腹水經(jīng)56°C 30分鐘滅活后按常規(guī)固定病毒、稀釋抗體，測(cè)得中和效價(jià)為1:320,000ο
[0036]1.4感染動(dòng)物被動(dòng)保護(hù)試驗(yàn)
[0037]小鼠雜交瘤腹水56°C 30分鐘滅活后，用Hanks液倍比稀釋，皮下注入3周齡LACA幼鼠。每個(gè)稀釋度4只，每只0.2ml。24小時(shí)候經(jīng)腹腔注射1，OOOLD50的JEV病毒懸液，連續(xù)觀察18天。能保護(hù)50%小鼠存活的樣品最高稀釋度即抗體的效價(jià)為3，200，000。
[0038]12天齡3.5公斤左右的雄性幼山羊，顱內(nèi)注射108。5LD50的SA14鼠腦懸液0.2ml/只。2F2單克隆抗體經(jīng)Hank液作1:2稀釋，于感染第48小時(shí)由腹腔加椎管三種方式注射一次，2ml/只。每天測(cè)量體溫，觀察兩個(gè)月以上，計(jì)算保護(hù)率為100%。
`[0039]3歲4公斤雌性恒河猴，病毒感染猴體溫升到超過39°C以后的第二天，通過靜脈、肌肉、椎管加肌肉途徑注射2F2單克隆抗體(5mg/只)，病毒對(duì)照組注射生理鹽水5ml。每天測(cè)量體溫并觀察，對(duì)照組恒河猴20天后因呼吸及循環(huán)衰竭而死亡，經(jīng)不同途徑注射2F2單克隆抗體的恒河猴存活率達(dá)100%。
[0040]用上述方法在不同水平的鑒定結(jié)果表明，2F2單抗具有良好的中和活性。
[0041]2、輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆
[0042]2.1雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
[0043]按常規(guī)方法復(fù)蘇2F2細(xì)胞，用含10 %小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37°C，5%C02孵箱培養(yǎng)。
[0044]2.2總RNA的提取和cDNA鏈的合成
[0045]用TRIZOL Reagent(購(gòu)自TakaRa公司)，按說明書提取總RNA ；cDNA合成試劑購(gòu)自TakaRa公司，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0046]2.3PCR 法擴(kuò)增 2F2VH 基因
[0047]PCR法擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自Takara公司，分別以VlBACK和VlFOR、VhBACK和VhFOR引物，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體積50 μ 1，反應(yīng)條件為:95°C 5min，95°C 30s ；57°C 45s ；72°C 45s ;循環(huán)34次，72°C IOmin ;VL、VH的正、反向引物核苷酸序列分別為:
[0048]VlBACK:5，-ACGTCGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3，；
[0049]VlFOR:5’-GACATTGTGCTGACCCAGTCTCCA-3’ ；
[0050]VhBACK:5’ -GTGAATTCATGCAGGTGCAGTTGATGGAGTCAGG-3’ ；
[0051 ] VhFOR: 5，-GGCCTCGAGTTATGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3，。[0052]2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和篩選
[0053]PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(購(gòu)自Axgen公司)回收所需片段，用DNA連接試劑盒(購(gòu)自TakaRa公司)將該片段按說明書插入pMD18_T載體(購(gòu)自TakaRa公司)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a (購(gòu)自TakaRa公司)，用EcoR I和Xhol I限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自TakaRa公司)篩選重組陽(yáng)性克隆。用雙脫氧核酸末端終止法測(cè)定基因序列，由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司完成，測(cè)定結(jié)果如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0054]2.5VH基因的原核表達(dá)及鑒定
[0055]EcoR I和Xho I雙酶切測(cè)序正確的重鏈可變區(qū)基因和原核表達(dá)載體pRSET A。Solution I連接酶連接，構(gòu)建VH-pRSET A轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21 (DE3)，加入IPTG，鎳離子親和層吸柱(N1-NTA)純化蛋白，純化后產(chǎn)物PBS透析。表達(dá)產(chǎn)物的ELISA分析鑒定活性，ELESA結(jié)果顯示，純化的抗日本腦炎病毒單克隆抗體重鏈可變區(qū)能與乙型腦炎病毒特異性結(jié)合。[0056]32F2mAb重鏈可變區(qū)基因分析
[0057]確定測(cè)序無誤后，鑒定基因的同源性。
[0058]3.1在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。分析結(jié)果表明，2F2mAb輕鏈可變區(qū)基因鼠源輕鏈可變區(qū)基因同源性最高，同源性為286/294(97%)，如圖1，(重鏈可變區(qū)基因與鼠抗-⑶8mAb重鏈可變區(qū)基因同源性最高，同源性為 318/353 (90%)，如圖 2。
[0059]3.2將可變區(qū)基因翻譯成氨基酸序列，如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0060]在non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。
[0061]分析結(jié)果表明，2F2mAb輕鏈氨基酸序列與鼠抗-Staphylococcalenterotoxin輕鏈可變區(qū)同源性最高，同源性為105/107 (98%)，如圖3所示重鏈氨基酸序列鼠重鏈可變區(qū)同源性最高，同源性為93/118 (79%)，如圖4所示。
[0062]編碼抗日本腦炎病毒單單抗的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析結(jié)果表明未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相同的基因和蛋白質(zhì)序列。
[0063]3.3利用MGT/V-QUEST分析可變區(qū)結(jié)構(gòu)，確定⑶R區(qū)。
[0064]將測(cè)序所得高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，在IMGT/V-QUEST 網(wǎng)站(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest)分析，得出其 CDR 區(qū)。
[0065]高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體輕鏈⑶R區(qū):
[0066]CDRl:Gln-Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Gly-Tyr-Ser-Tyr ；
[0067]CDR2 =Leu-Val-Ser ；
[0068]CDR3:Gln-His_Ile-Arg-Glu-Leu-Thr-Arg ；
[0069]高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體重鏈⑶R區(qū):
[0070]CDRl:Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Ala ；
[0071]CDR2:1le-Asn-Thr-Ala-Thr-Gly-Glu-Pro ；
[0072]CDR3:Ala-Ser-Asp-Gly-Arg-Tyr-Trp-Tyr-Phe-Gly-Val。
[0073]3.4原核表達(dá)抗體重鏈可變區(qū)
[0074]EcoR I和Xho I雙酶切測(cè)序正確的重鏈可變區(qū)基因和原核表達(dá)載體pRSET A。Solution I連接酶連接，構(gòu)建VH-pRSET A轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21 (DE3)，加入IPTG，鎳離子親和層吸柱(N1-NTA)純化蛋白，純化后產(chǎn)物PBS透析。表達(dá)產(chǎn)物的ELISA分析鑒定活性，ELESA結(jié)果顯示，純化的抗日本腦炎病毒單克隆抗體重鏈可變區(qū)能與乙型腦炎病毒特異性結(jié)合，參見圖5。
[0075]4、基因工程抗體設(shè)計(jì)
[0076]基于抗人CRT單克隆抗體FMMU-CRT-10的表達(dá)、純化以及序列分析，設(shè)計(jì)構(gòu)建以下生物制品
[0077](I)抗抗日本腦炎病毒單克隆抗體的構(gòu)建
[0078]將本發(fā)明的2F2mAb重鏈可變區(qū)基因插入嵌合抗體的表達(dá)載體中，獲得嵌合基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，用于制備對(duì)流行性乙型腦炎有治療作用的嵌合抗體。
[0079](2)人源化抗體的構(gòu)建
[0080]將本發(fā)明的2F2mAb重鏈可變區(qū)基因的CDR區(qū)移植到人源可變區(qū)的FR中，形成CDR移植抗體也稱重構(gòu)抗體或人源化抗體。利用CDR移植技術(shù)改造抗體，可獲得保持鼠源性親本mAb的特異性，而又更加接近人抗體的新型抗體，用于制備對(duì)流行性乙型腦炎有治療作用的人源化抗體。
[0081](3)根據(jù)本發(fā)明的基因序列及其編碼的氨基酸序列，制備針對(duì)JEV的抗體、疫苗或其他生物 制品。
【權(quán)利要求】
1.一種高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體，包括重鏈和輕鏈，其特征在于，所述輕鏈的可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)序列為:
CDRl:Gln-Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Gly-Tyr-Ser-Tyr ；
CDR2 =Leu-Val-Ser ；
CDR3:Gln-His_IIe-Arg-Glu-Leu-Thr-Arg ； 所述重鏈的可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)序列為:
CDRl:Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Ala ；
CDR2:1le-Asn-Thr-Ala-Thr-Gly-Glu-Pro ；
CDR3:Ala-Ser-Asp-Gly-Arg-Tyr-Trp-Tyr-Phe-Gly-Val。
2.如權(quán)利要求1所述的高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQID N0.2 所示。
3.如權(quán)利要求1所述的高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體，其特征在于，編碼單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID N0.3所示，編碼單克隆抗體重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID N0.4所示。
4.如權(quán)利要求1所述的高中和活性抗日本腦炎病毒單克隆抗體在制備以流行性乙型腦炎病毒為祀點(diǎn)的基因工程抗`體或疫苗的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103864925SQ201410077184
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】丁天兵, 寇甜甜 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)