一種滴眼液及其制備方法

一種滴眼液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種滴眼液及其制備方法，該治療角膜病滴眼液的配方按體積百分比包括：牛血清0.1%～5%，增稠劑5%～15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%～5%，抗生素0.5%～2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%～20%，余為平衡鹽溶液；該治療角膜病滴眼液的制備方法包括以下步驟：通過按滴眼液的配方，將增稠劑、牛血清、抗生素和重組Nodinhibit-1蛋白加到平衡鹽溶液中混合均勻，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)pH值為7.2～7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350mOsm/L～380mOsm/L，經(jīng)膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。本發(fā)明方法簡單、可靠，且易于實施；成分簡單，成本相對較低，配制方便。本發(fā)明沒有添加激素類成分，可長期使用，大大減少用藥期間并發(fā)癥和后遺癥的發(fā)生；加入了牛血清，可以顯著減少使用其他血清的不良反應(yīng)。
【專利說明】一種滴眼液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于角膜病治療【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種滴眼液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜病是我國的主要致盲眼病之一，是引起視力喪失的第二位主要病因，每年因角膜炎、角膜損傷等造成的新增角膜盲為150~200萬，嚴重威脅著患者的健康。而在角膜病中，感染性角膜炎占有重要地位，初步保守估計全球每年50萬人發(fā)生感染性角膜炎。因角膜位置靠前，受損傷感染的機會較大，所以當角膜受到外傷或病原微生物的侵襲時，極容易發(fā)生感染性炎癥。角膜在正常生理狀態(tài)下透明無血管，而角膜緣血供豐富，及角膜周邊部存在許多免疫相關(guān)的細胞和活性分子，所以當角膜遭遇細菌等病原微生物入侵時，角膜上皮作為抵御病原微生物侵襲角膜的第一道屏障，或通過調(diào)動角膜周邊部的體液及細胞免疫等防御機制，來抑制致病因子對角膜的侵襲，以阻止角膜的進一步損害。隨著角膜炎的病理變化過程的推進，若角膜炎癥持續(xù)時間較短，角膜炎癥反應(yīng)程度逐漸減輕，并伴隨著新生血管進入角膜，最終角膜各層組織修復，遺留厚薄不等的瘢痕。但是任何性質(zhì)的角膜炎，若炎癥持續(xù)時間長，都可引起角膜新生血管導致角膜失去透明性從而引起視力不同程度的下降，所以角膜病最主要的致盲原因是角膜持續(xù)長時間的炎癥狀態(tài)導致的角膜新生血管化，同時治療藥物的作用局限也是一個關(guān)鍵問題。目前，由于參與角膜新生血管形成及角膜炎癥的因素較多，有關(guān)其發(fā)生機制、病理過程、以及有效治療手段等諸多方面的問題還尚未完全闡明。所以對于角膜新生血管及角膜炎癥的藥物研究，有望解決角膜創(chuàng)口愈合困難和術(shù)后免疫排斥反應(yīng)二大關(guān)鍵問題，是目前治療角膜盲的新途徑。因此，如何尋找新的藥物治療這兩類主要角膜疾病已經(jīng)成為當前眼科界研究的一個熱點和難點。
[0003]天然免 疫系統(tǒng)存在于所有多細胞動物中，當機體接觸致病微生物后迅速對病原體進行識別并產(chǎn)生抵抗病原體入侵的反應(yīng)，發(fā)揮這一功能的主要是天然免疫細胞，這些細胞表達模式識別受體(pattern-recognition receptors, PRRs),而PRRs可識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecularpatterns, PAMPs)。現(xiàn)已證實，哺乳動物具有兩個微生物識別系統(tǒng)，一個識別系統(tǒng)是由Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)的膜結(jié)合受體家族組成，TLR在天然免疫及獲得性免疫中起著關(guān)鍵作用，這一家族中具有代表性的是TLR4 ;另一個識別系統(tǒng)是苷酸結(jié)合寡聚域(nucleotide-binding oligomerzationdomain, NOD)的蛋白質(zhì)家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多個成員，其中最具有代表性的是N0D-1和N0D2，此兩種蛋白屬于胞漿蛋白，N0D-1廣泛表達于成人組織細胞；N0D-2主要表達于髓源性細胞，腸上皮細胞，它們通過識別細菌細胞壁成分-肽聚糖(PGN)的降解產(chǎn)物而起到抗細菌感染等作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，鼠類，犬類及人類的角膜上皮細胞胞漿中有N0D-1和N0D-2蛋白的表達。它們可作為一種胞內(nèi)PRRs參與角膜炎癥反應(yīng)，并且與角膜新生血管的形成有著密切關(guān)系。Kim等學者在研究鼠角膜堿燒傷模型誘導角膜新生血管形成的過程中發(fā)現(xiàn)，Nodinhibit-1信號通路在角膜新生血管的形成中具有促進作用。該研究結(jié)果顯示:Nodinhibit-1蛋白受體激動劑使血管性生成因子(VEGF、b_FGE、TGF-BI)的表達量上升從而促進角膜新生血管的形成，而且還通過作用于下游信號通路分子RICK/Rip2等，最終激活NF-kB,促進促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄而介導天然免疫反應(yīng)；為進一步闡明Nodinhibit-1信號通路在角膜新生血管形成中的作用，用Nodinhibit-1蛋白受體激動劑治療RICK基因敲出的角膜新生血管鼠模型，結(jié)果顯示角膜新生血管數(shù)量明顯減少，這說明Nod-1信號通路在介導角膜新生血管的形成及角膜炎癥狀態(tài)有著密切聯(lián)系，這就為研發(fā)新的抗角膜新生血管及抗炎藥提供新的治療靶點。
[0004]臨床上應(yīng)用的大多數(shù)抗炎滴眼液產(chǎn)品多含有激素類成分，長期使用不但嚴重影響患者的眼表微環(huán)境，還增加患者患白內(nèi)障，青光眼的風險，部分抗炎藥物還有相關(guān)的并發(fā)癥如氯霉素滴眼液大劑量用藥可致眼瞼、角膜水腫，眼球運動受限及視盤萎縮，長期應(yīng)用可致再生障礙性貧血等；抗新生血管藥物，如青蒿琥酯滴眼液，成分比較復雜，效果尚不夠肯定，且沒有抗炎作用；強力霉素滴眼劑是目前治療炎癥的有效藥物，但目前我國尚無正式商品化的制劑。目前我們通過查閱國內(nèi)外大量相關(guān)文獻，得知Nodinhibit-1胞漿蛋白受體與病原微生物的病原體相關(guān)分子模式識別結(jié)合后啟動天然免疫反應(yīng)，以抗細胞內(nèi)病原菌感染。最新國外研究表明NOD-1蛋白受體刺激物激活NOD-1蛋白信號通路，促進角膜新生血管的形成及角膜炎性因子的表達。研究Nodinhibit-1蛋白滴眼液在抗角膜新生血管及角膜炎癥中的作用及效果，可能會對角膜疾病的防治開辟一條嶄新的思路。
[0005]迄今為止對于角膜炎及角膜炎繼發(fā)角膜新生血管的治療，仍然是所有眼科醫(yī)師治療過程中一個棘手的難題，角膜炎的預(yù)后仍然不容樂觀，其治療原則是控制感染、減輕炎癥反應(yīng)、促進愈合、減少瘢痕形成，但在實際臨床治療當中，各種類型的抗炎，抗感染及促進角膜愈合的滴眼液產(chǎn)品藥效不一，所以臨床上多采用聯(lián)合用藥的方法以提高療效，而且用于治療的滴眼液中主要以抗炎，促進角膜愈合為主，而對于具有抗角膜新生血管及抗炎雙重藥效的滴眼液產(chǎn)品，目前市面上尚無此類藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明實施例的目`的在于提供一種滴眼液及其制備方法，旨在解決現(xiàn)有缺少具有抗角膜新生血管及抗炎雙重藥效的滴眼液產(chǎn)品的問題。
[0007]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種滴眼液，該治療角膜病滴眼液的配方按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組 Nodinhibit-1 蛋白(Nodl 抑制劑，ML130:1midazol-2-amine) 5% ~20%,余為平衡鹽溶液。
[0008]進一步，該治療角膜病滴眼液按體積百分比的最佳比例為:牛血清0.5%~2.5%，增稠劑9.5%~11.5%、酸堿調(diào)節(jié)液2%~3%，抗生素1%~1.5%,重組Nodinhibit-1蛋白10%~15%，余為平衡鹽溶液。
[0009]進一步于，平衡鹽溶液采用PBS溶液；牛血清采用胎牛血清，增稠劑為硫酸軟骨素、右旋糖酐、透明質(zhì)酸鈉、羧丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆或殼聚糖。
[0010]進一步，牛血清尤其選擇特級胎牛血清，特級胎牛血清是在無菌條件下通過心臟穿刺的方式采血取到，經(jīng)過40nm正壓氣流過濾的胎牛血清，毒素含量不大于10EU/ml，血紅蛋白含量不大于Omg/dl，按體積百分比，牛血清的濃度為1%~15%，最好為10%。[0011]進一步，酸堿調(diào)節(jié)劑選自碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖對、磷酸氫鈉一磷酸二氫鈉緩沖對、HEPES羥乙基哌嗪乙硫磺酸、硼酸一硼砂緩沖中的一種，滲透壓緩沖劑選自氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一種，抗生素選自慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素中的一種。
[0012]進一步,酸堿調(diào)節(jié)劑最好選用HEPES輕乙基哌嗪乙硫磺酸；抗生素最好采用妥布
霉素O
[0013]本發(fā)明實施例的另一目的在于提供一種滴眼液的制備方法，該治療角膜病滴眼液的制備方法包括以下步驟:
[0014]步驟一，按滴眼液的配方，按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液，準備材料；
[0015]步驟二，將增稠劑、牛血清、抗生素和重組Nodinhibit-1蛋白加到平衡鹽溶液中混合均勻，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)PH值為7.2~7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350m0sm/L~380m0sm/L,經(jīng)膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0016]進一步,步驟二還可以將重組Nodinhibit-1蛋白制成無菌微粉,將牛血清溶解于平衡鹽溶液中，酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)PH值為7.2~7.4，膜過濾除菌，然后將重組Nodinhibit-1粉末溶于該溶液中，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0017]進一步，該滴眼液的制備方法步驟為:
[0018]按滴眼液的配方，按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液，準備材料；以IOml滴眼液計，以7.4mlPBS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐100 μ 1、HEPES200 μ I，妥布霉素 100 μ I,重組 Nodinhibit-1 蛋白 2ml，pH 值為 7.2-7.4，滲透壓為 350m0sm/L ~380m0sm/L ；
[0019]將100 μ g重組Nodinhibit-1蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2mlPBS溶液中，然后和200 μ I胎牛血清，1MHEPES200 μ I及10%妥布霉素100 μ I混合均勻，補加PBS溶液于10ml，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，滲透壓為350m0sm/L~380m0sm/L,經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0020]進一步，該滴眼液的制備方法步驟為:
[0021]按滴眼液的配方，按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液，準備材料；以IOml滴眼液計，以7.4mlPBS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐100 μ 1、HEPES200 μ I，妥布霉素 100 μ I,重組 Nodinhibit-1 蛋白 2ml，pH 值為 7.2-7.4，滲透壓為 350m0sm/L ~380m0sm/L ；
[0022]將10(^8如也1^1^-1制成無菌微粉，將10(^8低分子右旋糖酐、20(^1胎牛血清、lMHEPES200y 1、10% 妥布霉素 100 μ I 及 9.4mlPBS，調(diào)節(jié) PH 值為 7.2-7.4，經(jīng) 0.2 μ m 膜過濾除菌，然后將Nodinhibit-1粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350m0sm/L~380m0sm/L,即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0023]本發(fā)明提供的滴眼液及其制備方法，通過按滴眼液的配方，將增稠劑、牛血清、抗生素和重組Nodinhibit-1蛋白加到平衡鹽溶液中混合均勻，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)pH值為7.2~7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350m0sm/L~380m0sm/L，經(jīng)膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液；或按滴眼液的配方,將重組Nodinhibit-1蛋白制成無菌微粉,將牛血清溶解于平衡鹽溶液中，酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)PH值為7.2~7.4，膜過濾除菌，然后將重組Nodinhibit-1粉末溶于該溶液中，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0024]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0025](I)制作流程簡單、可靠，且易于實施；
[0026](2)滴眼液成分簡單，成本相對較低，配制方便；
[0027](3)本發(fā)明沒有添加激素類成分，可以可長期使用，大大減少用藥期間并發(fā)癥和后遺癥的發(fā)生;
[0028](4)本發(fā)明添加抗生素后無污染，病原菌培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)此滴眼液能較長時間保存(3個月)，應(yīng)用于大鼠角膜堿燒傷模型后發(fā)現(xiàn)不僅可以預(yù)防和治療角膜新生血管的發(fā)生，而且對控制角膜炎癥也發(fā)揮了一定的作用；
[0029](5)本發(fā)明加入了牛血清，無病原微生物，低內(nèi)毒素，低補體，可以顯著減少使用其他血清的不良反應(yīng)；
[0030](6)本發(fā)明加入了一定劑量的增稠劑，可明顯提高藥物的舒適度；
[0031](7)同時本發(fā)明可方便臨床醫(yī)生工作，為術(shù)前控制和穩(wěn)定角膜新生血管及角膜炎癥性疾病患者的病情提供更 合理的手術(shù)時機；
[0032](8)本發(fā)明不僅可以用于抗角膜新生血管及角膜炎癥性疾病，同時將為其作用機制的進一步研究提供重要的線索和技術(shù)支持。
[0033]本發(fā)明的Nodinhibit-1滴眼液不僅可以預(yù)防和治療角膜新生血管發(fā)生，而且能控制角膜炎癥，為將來用于各種炎癥或相關(guān)新生血管性疾病的藥物治療奠定了基礎(chǔ)，并能被廣大患者接受而應(yīng)用于臨床。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為Nodinhibit-1滴眼液制備流程框圖。
[0035]圖2為不同濃度N0D-1重組蛋白上調(diào)巨噬細胞培養(yǎng)液中NO情況。
[0036]圖3為不同濃度N0D-1重組蛋白上調(diào)巨噬細胞培養(yǎng)液中TNF- α情況。
[0037]圖4為不同濃度N0D-1重組蛋白上調(diào)巨噬細胞培養(yǎng)液中IL_6情況。
[0038]圖5為不同濃度N0D-1重組蛋白上調(diào)巨噬細胞培養(yǎng)液中IL-1 β情況。
[0039]圖6為巨噬細胞在PBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h的細胞凋亡情況。
[0040]圖7為巨噬細胞在含10.0 μ g/ml重組Nod-1蛋白培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h的細胞凋亡情況。
[0041]圖8為不同濃度Nod-1重組蛋白連續(xù)作用24，48，72小時，HUVEC在細胞增殖實驗中的情況。
[0042]圖9為10.0 μ g/mlNOD-1蛋白抑制HUVEC的粘附情況。
[0043]圖10為10.0 μ g/mlNOD-1蛋白促進HUVEC侵襲情況。
[0044]圖11為大鼠角膜堿燒傷后應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天角膜裂隙燈的情況，
[0045]圖12為大鼠角膜堿燒傷后應(yīng)用PBS滴眼液14天在角膜裂隙燈的情況，[0046]圖13為大鼠角膜堿燒傷后給予濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液連續(xù)點眼1，4，7，14天角膜炎癥指數(shù)情況。
[0047]圖14為大鼠角膜堿燒傷后給予濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液連續(xù)點眼1，4，7，14天角膜新生血管長度情況。
[0048]圖15為大鼠角膜堿燒傷后給予濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液連續(xù)點眼1，4，7，14天角膜新生血管面積情況。
[0049]圖16為大鼠角膜堿燒傷后給予濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液連續(xù)點眼1，4，7，14天角膜上皮修復面積情況。
[0050]圖17為在大鼠角膜堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜VEGF的變化情況，
[0051]圖18為在大鼠角膜堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜PEDF的變化情況，
[0052]圖19為在大鼠角膜堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天VEGF的變化情況，
[0053]圖20為在大鼠角膜堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天PEDF的變化情況，
[0054]圖21為在大鼠角膜堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜TNF- α的變化情況，
[0055]圖22為在大鼠角 膜堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜⑶31的變化情況，
[0056]圖23為在大鼠角膜堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天TNF- α的變化情況，
[0057]圖24為在大鼠角膜堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天⑶31的變化情況，
[0058]圖25為大鼠角膜堿燒傷10天后應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天角膜裂隙燈的情況，
[0059]圖26為大鼠角膜堿燒傷10天后應(yīng)用PBS滴眼液14天在角膜裂隙燈的情況，
[0060]圖27為在大鼠角膜堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜VEGF的變化情況，
[0061]圖28為在大鼠角膜堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜PEDF的變化情況，
[0062]圖29為在大鼠角膜堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天VEGF的變化情況，
[0063]圖30為在大鼠角膜堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天PEDF的變化情況，
[0064]圖31為在大鼠角膜堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜TNF- α的變化情況，
[0065]圖32為在大鼠角膜堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜⑶31的變化情況，
[0066]圖33為在大鼠角膜堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天TNF- α的變化情況，
[0067]圖34為在大鼠角膜堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天⑶31的變化情況，【具體實施方式】
[0068]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0069]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0070]本發(fā)明實施例的治療角膜病滴眼液的配方:按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液；最好為牛血清0.5%~2.5%，增稠劑9.5%~11.5%、酸堿調(diào)節(jié)液2%~3%，抗生素1%~1.5%，重組Nodinhibit-1蛋白10%~15%，余為平衡鹽溶液；
[0071]平衡鹽溶液最好采用PBS溶液，PBS溶液是最常用的平衡鹽溶液，也是抗炎藥物的基礎(chǔ)溶液，其成分包含了部分離子成分，可以滿足用藥期間陰陽離子平衡和滲透壓的需要；
[0072]牛血清最好采用胎牛血清，尤其是特級胎牛血清，特級胎牛血清是在無菌條件下通過心臟穿刺的方式采血取到，經(jīng)過40nm正壓氣流過濾的胎牛血清，具有極佳的促細胞生長作用及產(chǎn)品穩(wěn)定性，內(nèi)毒素含量≤10EU/ml，血紅蛋白含量≤10mg/dl，按體積百分比，牛血清的濃度為1%~15%，最好為10% ；
[0073]增稠劑最好選自硫酸軟骨素、右旋糖酐、透明質(zhì)酸鈉、羧丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、殼聚糖等中的至少一種；
[0074]酸堿調(diào)節(jié)劑選自碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖對、磷酸氫鈉一磷酸二氫鈉緩沖對、HEPES羥乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式為C8H18N204S)、硼酸一硼砂緩沖對等中的一種，最好選用作用較強的HEPES ；
[0075]滲透壓緩沖劑最好選自氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖等中的一種，滲透壓緩沖劑的用量參照眼科制劑標準；
[0076]抗生素選自慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素等中的一種，最好米用妥布霉素；滴眼液:以IOml計，含有重組Nodinhibit-1蛋白10 μ g, PH值為7.2~7.4。
[0077]如圖1所示，本發(fā)明的治療角膜病滴眼液的制備方法包括以下步驟:
[0078]SlOl:按滴眼液的配方，按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液，準備材料；
[0079]S102:將增稠劑、牛血清、抗生素和重組Nodinhibit-1蛋白加到平衡鹽溶液中混合均勻，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)pH值為7.2~7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350m0sm/L~380m0sm/L,經(jīng)膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液；
[0080]步驟S102還可以為將重組Nodinhibit-1蛋白制成無菌微粉，將牛血清溶解于平衡鹽溶液中，酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)PH值為7.2~7.4，膜過濾除菌，然后將重組Nodinhibit-1粉末溶于該溶液中，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0081]結(jié)合本發(fā)明的具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明:
[0082]按滴眼液的配方，按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液，準備材料；以IOml滴眼液計，以7.4mlPBS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐100 μ 1、HEPES200 μ I，妥布霉素 100 μ I,重組 Nodinhibit-1 蛋白 2ml，pH 值為 7.2-7.4，滲透壓為 350m0sm/L ~380m0sm/L (圖1)。[0083]實施例1
[0084]以IOml滴眼液計，以7.4mlPBS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐 100 μ 1、HEPES200 μ I，妥布霉素 100 μ I,重組 Nodinhibit-1 蛋白 2ml，pH 值為 7.2-7.4，滲透壓為350~380m0sm/L。
[0085]制備方法1:將100 μ g重組Nodinhibit-1蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2mlPBS溶液中，然后和200 μ I胎牛血清，1MHEPES200 μ I及10%妥布霉素100 μ I混合均勻，補加PBS溶液于10ml，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，滲透壓為350~380m0sm/L，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0086]制備方法2:將100 μ gNodinhibit-1制成無菌微粉,將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ I 胎牛血清、1MHEPES200 μ 1、10%妥布霉素 100 μ I 及 9.4mlPBS,調(diào)節(jié)PH值為 7.2-7.4，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，然后將Nodinhibit-1粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350~380m0sm/L,即得 Nodinhibit-1 滴眼液.[0087]實施例2
[0088]以IOml滴眼液計，以7.4mlHBSS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐 100 μ 1、HEPES200 μ I，妥布霉素 100 μ I,重組 Nodinhibit-1 蛋白 2ml，pH 值為 7.2-7.4，滲透壓為350~380m0sm/L。
[0089]制備方法1:將100 μ g重組Nodinhibit-1蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2mlHBSS溶液中，然后和200 μ I胎牛血清，1MHEPES200 μ I及10%妥布霉素100 μ I混合均勻，補加HBSS溶液于IOml，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，滲透壓為350~380m0sm/L,經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0090]制備方法 2:將100 μ gNodinhibit-l制成無菌微粉，將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ I胎牛血清、lMHEPES200y 1、10%妥布霉素100 μ I及9.4mlHBSS,調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，然后將Nodinhibit-1粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 ~380m0sm/L,即得 Nodinhibit-1 滴眼液.[0091]實施例3
[0092]以IOml滴眼液計，以7.4ml生理鹽水為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐100 μ 1、HEPES200y 1，妥布霉素100 μ 1，重組Nodinhibit-1蛋白2ml，pH值為7.2-7.4，滲透壓為 350 ~380m0sm/L。
[0093]制備方法1:將100 μ g重組Nodinhibit-1蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml生理鹽水溶液中，然后和200 μ I胎牛血清，1MHEPES200 μ I及10%妥布霉素100 μ I混合均勻，補加生理鹽水溶液于10ml，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，滲透壓為350~380m0sm/L，經(jīng)
0.2 μ m膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0094]制備方法2:將100 μ gNodinhibit-l制成無菌微粉,將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ I胎牛血清、lMHEPES200y 1、10%妥布霉素100 μ I及9.4ml生理鹽水，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，然后將Nodinhibit-1粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 ~380m0sm/L,即得 Nodinhibit-1 滴眼液.[0095]實施例4
[0096]以IOml滴眼液計，以7.4ml林格氏液為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐100 μ 1、HEPES200y 1，妥布霉素100 μ 1，重組Nodinhibit-1蛋白2ml，pH值為7.2-7.4，滲透壓為 350 ~380m0sm/L。
[0097]制備方法1:將100 μ g重組Nodinhibit-1蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml林格氏液中，然后和200 μ I胎牛血清，1MHEPES200 μ I及10%妥布霉素100 μ I混合均勻，補加林格氏液于10ml，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，滲透壓為350~380m0sm/L，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0098]制備方法2:將100 μ gNodinhibit-1制成無菌微粉,將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ I胎牛血清、lMHEPES200y 1、10%妥布霉素100 μ I及9.4ml林格氏液，調(diào)節(jié)PH值為
7.2-7.4，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，然后將Nodinhibit-1粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 ~380m0sm/L,即得 Nodinhibit-1 滴眼液.[0099]實施例5
[0100]以IOml滴眼液計，以7.4mlHanks溶液為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐100 μ 1、HEPES200 μ 1，妥布霉素100 μ 1，重組Nodinhibit-Ι蛋白2ml，pH值為
7.2-7.4，滲透壓為 350 ~380m0sm/L。
[0101]制備方法1:將100 μ g重組Nodinhibit-1蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2mlHanks溶液中，然后和200 μ I胎牛血清，1MHEPES200 μ I及10%妥布霉素100 μ I混合均勻，補加Hanks溶液于10ml，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，滲透壓為350~380m0sm/L，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
[0102]制備方法2:將100 μ gNodinhibit-1制成無菌微粉,將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ I胎牛血清、lMHEPES200y 1、10%妥布霉素100 μ I及9.4mlHanks溶液，調(diào)節(jié)PH值為
7.2-7.4，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，然后將Nodinhibit-1粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 ~380m0sm/L,即得 N odinhibit-1 滴眼液.[0103]實施例6
[0104]以下給出一種優(yōu)化的Nod-1滴眼液在體外影響巨噬細胞功能的初步實驗研究:
[0105]目的:了解不同濃度重組Nod-1蛋白在體外對巨噬細胞分泌和凋亡的影響。
[0106]方法:采用巨噬細胞RAW264.7進行細胞培養(yǎng)，然后在培養(yǎng)液中分別加入PBS，1%BSA, L O μ g/ml, 10.0 μ g/ml 和 50.0 μ g/ml 重組 Nod-1 蛋白，利用 Elisa 觀察各組培養(yǎng)液中TNF- α、IL-6、IL-1 β及NO變化情況，Dead和Live試驗觀察巨噬細胞凋亡情況。
[0107]結(jié)果:Elisa實驗顯不了 1.0 μ g/ml, 10.0 μ g/ml 和 50.0 μ g/ml 重組 Nod-Ι 蛋白能促進巨噬細胞分泌促炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1 β及NO，而且呈濃度依賴性；Dead和Live試驗顯示10.0 μ g/ml重組Nod-1蛋白能抑制巨噬細胞凋亡(P值均< 0.05)。
[0108]結(jié)論:10 μ g/mlNOD-1促進巨噬細胞分泌促炎癥介質(zhì)TNF- α、IL-6, IL-1 β及NO，抑制巨噬細胞凋亡。
[0109]參見圖2-5，巨噬細胞RAW264.7在相同密度接種后，分別給予1.0 μ g/ml, 10.0 μ g/ml和50.0 μ g/ml重組Nod-1蛋白，連續(xù)處理48h情況，Elisa實驗顯示不同濃度N0D-1重組蛋白能上調(diào)巨噬細胞培養(yǎng)液中N0(圖2)、TNF-α (圖3)、IL_6(圖4)、IL-1 β (圖5)促炎性因子的表達。Dead和Live試驗顯示加入PBS組巨噬細胞凋亡明顯(圖6)，而10.0 μ g/ml重組Nod-1蛋白組巨噬細胞凋亡減少(圖7)。
[0110]實施例7
[0111]以下給出一種優(yōu)化的Nod-1蛋白在體外影響人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC功能的初步實驗研究:
[0112]目的:了解不同濃度重組Nod-1蛋白在體外對HUVEC細胞增殖、粘附、侵襲的影響。
[0113]方法:采用HUVEC進行細胞培養(yǎng)，然后在培養(yǎng)液中分別加入PBS，1%BSA，0.5μ g/ml, 1.0 μ g/ml, 5.0 μ g/ml, 10.0 μ g/ml 和 50.0 μ g/ml 重組 Nod-1 蛋白，利用 CCK8 實驗、細胞粘附試驗、細胞侵襲試驗、流式細胞檢測HUVEC細胞增殖、粘附、及侵襲情況。
[0114]結(jié)果:CCK8實驗結(jié)果顯示PBS組，1%BSA組明顯高于重組Nod-Ι蛋白各組(P值均
<0.05)，重組Nod-1蛋白濃度在0.5μ g/ml-ΙΟμ g/ml時，重組Nod-1蛋白組HUVEC細胞在36h，48h，72h增殖速度明顯與重組Nod-1蛋白濃度呈正相關(guān)，各組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P值均< 0.05)，但Nod-1蛋白Nod-1蛋白細胞在10 μ g/ml與50 μ g/ml重組Nod_l蛋白組在各時間的增殖速度比較差異無統(tǒng)計學意義(P值均> 0.05)。細胞粘附試驗顯示10.0 μ g/mlNOD-1蛋白能抑制HUVEC的粘附功能；細胞侵襲試驗結(jié)果說明10.0 μ g/mlNOD-1能促進HUVEC侵襲。
[0115]結(jié)論:0.5 μ g/ml, 1.0 μ g/ml, 5.0 μ g/ml, 10 μ g/ml 重組 Nod-1 蛋白和 50 μ g/ml重組Nod-1蛋白在體外對HUVEC的增殖均有抑制作用。試驗顯示10.0 μ g/mlNOD-1蛋白能抑制HUVEC的粘附，促進HUVEC侵襲。
[0116]參見圖8，CCK8實驗結(jié)果顯示PBS組HUVEC細胞在36h，48h，72h增殖速度較快，而濃度為 0.5 μ g/ml, 1.0 μ g/ml, 5.0 μ g/ml, 10 μ g/ml 重組 Nod-1 蛋白和 50 μ g/ml 重組Nod-1蛋白增殖速度明顯偏慢，兩者比較在各時間點均存在有統(tǒng)計學意義(P值均< 0.05)，說明HUVEC細胞的增殖明顯受到濃度為10μ g/ml重組Nod-1蛋白的限制。細胞粘附試驗顯示10.0 μ g/m lNOD-Ι蛋白能抑制HUVEC的粘附功能(圖9);細胞侵襲試驗結(jié)果說明
10.0 μ g/mlNOD-1能促進HUVEC侵襲(圖10)。在圖8中，橫坐標為作用時間，縱坐標為在酶標儀下，HUVEC細胞增殖過程中測得450nm波長的OD值。
[0117]實施例8
[0118]以下給出一種優(yōu)化的Nodinhibit-1滴眼液抑制大鼠角膜新生血管和炎癥的初步實驗研究
[0119]目的:了解10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液對大鼠角膜堿燒傷模型中新生血管和炎癥反應(yīng)的影響。
[0120]方法:先將32只Wistar大鼠用l%NaOH制作角膜堿燒傷模型，然后將模型動物平均分為兩組，一組給予PBS滴眼液,另一組給予10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液,連續(xù)點眼14天后，觀察兩組大鼠角膜新生血管生長和炎癥指數(shù)情況。取點藥14天后角膜，采用免疫熒光染色和免疫組織化學對比兩組TNF-α、VEGF、PEDF以及⑶31表達情況。先將32只Wistar大鼠用l%NaOH制作角膜堿燒傷模型，然后將模型動物平均分為兩組，一組給予PBS滴眼液，另一組給予?ο μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液,連續(xù)點眼14天后,觀察兩組大鼠角膜新生血管生長和炎癥指數(shù)情況。取點藥14天后角膜，采用免疫熒光染色和免疫組織化學對比兩組TNF- α、VEGF、PEDF以及CD31表達情況。
[0121]結(jié)果:在連續(xù)用藥14天后，10 μ g/ml Nodinhibit-1組的角膜炎癥指數(shù)分別為0.31±0.16，明顯優(yōu)于PBS滴眼液組的0.43±0.12，新生血管長度和面積分別為32±3.26mm2 和 1.15±0.18mm,明顯小于 PBS 滴眼液組的 65±4.32mm2 和 2.85±0.22mm，免疫熒光染色結(jié)果顯示VEGF、及TNF-α在10 μ g/mlNodinhibit_l組明顯下調(diào)，PEDF在10 μ g/ml Nodinhibit-1組明顯上調(diào)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P值均< 0.05)，免疫組織化學結(jié)果顯示⑶31在10 μ g/mlNodinhibit-1組明顯下調(diào)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P值
<0.05)。[0122]結(jié)論:10yg/ml Nodinhibit-1滴眼液能顯著抑制大鼠堿燒傷角膜的新生血管形成和炎癥反應(yīng)發(fā)生。
[0123]參見圖11-24，大鼠角膜堿燒傷模型制作后，給予濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液連續(xù)點眼14天，大鼠角膜新生血管和炎癥反應(yīng)的改變情況.圖11，12為濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液(圖11)和PBS滴眼液(圖12)在堿燒傷后14天角膜裂隙燈的情況，圖13-16為堿燒傷后1，4，7，14天角膜炎癥指數(shù)(圖13)、角膜新生血管長度(圖14)和面積(圖15)、角膜上皮修復面積(圖16)的變化情況，結(jié)果顯示濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1炎癥指數(shù)、角膜新生血管長度和面積明顯少于PBS滴眼液組，角膜上皮面積多于PBS滴眼液組，兩者比較在各時間點均存在有統(tǒng)計學意義(P值< 0.05)，說明濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液能有效控制炎癥，促進角膜上皮修復，抑制大鼠堿燒傷角膜的新生血管形成.圖17，18為在堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜VEGF (圖17)和PEDF (圖18)的變化情況，圖19，20為PBS滴眼液應(yīng)用14天后角膜VEGF (圖19)和PEDF (圖20)的變化情況，顯示濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1組VEGF明顯下調(diào)而PEDF明顯上調(diào)，兩者比較存在有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)，說明了濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液是通過使VEGF表達下降而使PEDF表達升高而抑制大鼠堿燒傷角膜新生血管形成的.圖21，22為在堿燒傷后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/mlNodinhibit-1滴眼液14天時角膜TNF-α (圖21)和CD31 (圖22)的變化情況，圖23，24為PBS滴眼液應(yīng)用后角膜TNF-α (圖23)和⑶31 (圖24)的變化情況，，結(jié)果顯示濃度為10yg/ml Nodinhibit-1組TNF-α和CD31明顯下調(diào)，兩者比較存在有統(tǒng)計學意義(P
<0.05)，說明了濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液也通過使TNF-α和CD31表達下降而抑制大鼠堿燒傷角膜新生血管形成的.[0124]實施例9
[0125]以下給出一種優(yōu)化的Nodinhibit-1滴眼液在大鼠角膜新生血管回退中的初步作用研究
[0126]目的:了解10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液對大鼠角膜新生血管形成后的影響。
[0127]方法:先將32只Wistar大鼠用l%NaOH制作角膜堿燒傷模型，待新生血管形成10天后，將這些大鼠平均分為兩組，一組給予PBS滴眼液，另一組給予10 μ g/mlNodinhibit-1滴眼液，分別連續(xù)點眼14天后，觀察兩組大鼠角膜新生血管生長和情況。取點藥14天后角膜，采用免疫熒光染色和Westernblot技術(shù)對比兩組TNF-a ,VEGF以及PEDF表達情況。
[0128]結(jié)果:新生血管形成10天后連續(xù)用藥14天顯示，免疫熒光染色結(jié)果顯示VEGF、及TNF- α 在 10 μ g/mlNodinhibit-l 組明顯下調(diào),PEDF 在 10 μ g/ml Nodinhibit-1 組明顯上調(diào)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P值均< 0.05)。
[0129]結(jié)論:10yg/ml Nodinhibit-1滴眼液能使大鼠堿燒傷模型中已經(jīng)形成的角膜新
生血管回退。
[0130]參見圖25-34，大鼠角膜堿燒傷模型制作10天后，給予濃度為10 μ g/mlNodinhibit-1和PBS滴眼液連續(xù)點眼14天，大鼠角膜新生血管的改變情況.圖25，26為濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液(圖25)和PBS滴眼液(圖26)在堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用14天角膜裂隙燈的情況，圖27，28為在堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/mlNodinhibit-1滴眼液14天時角膜VEGF (圖27)和PEDF (圖28)的變化情況，圖29，30為在堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用PBS滴眼液14天時角膜VEGF (圖29)和PEDF (圖30)的變化情況，結(jié)果顯示濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1組VEGF明顯下調(diào)而PEDF明顯上調(diào)，兩者比較存在有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)，說明了濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液是通過使VEGF表達下降而使PEDF表達升高而抑制大鼠堿燒傷角膜新生血管形成的.圖31，32為在堿燒傷10天后連續(xù)應(yīng)用濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1滴眼液14天時角膜TNF- α (圖31)和⑶31 (圖32)的變化情況，圖33，34為PBS滴眼液應(yīng)用后角膜TNF-α (圖33)和CD31 (圖34)的變化情況，結(jié)果顯示濃度為10 μ g/ml Nodinhibit-1組TNF-α和CD31明顯下調(diào)，兩者比較存在有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)，說明了濃度為lOyg/ml Nodinhibit-1滴眼液也通過使TNF- α和⑶31表達下降而抑制大鼠堿燒傷角膜新生血管形成的.[0131]本發(fā)明不僅可以預(yù)防和治療角膜新生血管發(fā)生，而且能控制角膜炎癥，將來可能會用于各種炎癥或相關(guān)新生血管性疾病的藥物治療，并能被廣大患者接受而應(yīng)用于臨床。
[0132]以上所述僅 為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種滴眼液，其特征在于，該滴眼液的配方按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的滴眼液，其特征在于，該滴眼液的配方按體積百分比的最佳比例為:牛血清0.5%~2.5%,增稠劑9.5%~11.5%、酸堿調(diào)節(jié)液2%~3%,抗生素1%~1.5%,重組Nodinhibit-1蛋白10%~15%，余為平衡鹽溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的滴眼液，其特征在于，平衡鹽溶液采用PBS溶液；牛血清采用胎牛血清，增稠劑為硫酸軟骨素、右旋糖酐、透明質(zhì)酸鈉、羧丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆或殼聚糖。
4.如權(quán)利要求3所述的滴眼液，其特征在于，牛血清尤其選擇特級胎牛血清，特級胎牛血清是在無菌條件下通過心臟穿刺的方式采血取到，經(jīng)過40nm正壓氣流過濾的胎牛血清，毒素含量不大于10EU/ml，血紅蛋白含量不大于Omg/dl，按體積百分比，牛血清的濃度為1%~15%，最好為10%ο
5.如權(quán)利要求1所述的滴眼液，其特征在于，酸堿調(diào)節(jié)劑選自碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖對、磷酸氫鈉一磷酸二氫鈉緩沖對、HEPES羥乙基哌嗪乙硫磺酸、硼酸一硼砂緩沖中的一種，滲透壓緩沖劑選自氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一種，抗生素選自慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素中的一種。
6.如權(quán)利要求5所述的滴眼液，其特征在于，酸堿調(diào)節(jié)劑最好選用HEPES羥乙基哌嗪乙硫磺酸；抗生素最好采用妥布霉素。
7.—種滴眼液的制備方法，其特征在于，該滴眼液的制備方法包括以下步驟: 步驟一，按滴眼液的配方，按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液，準備材料； 步驟二，將增稠劑、牛血清、抗生素和重組Nodinhibit-1蛋白加到平衡鹽溶液中混合均勻，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)PH值為7.2~7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350m0sm/L~380m0sm/L,經(jīng)膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法,其特征在于,步驟二還可以將重組Nodinhibit-1蛋白制成無菌微粉，將牛血清溶解于平衡鹽溶液中，酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)PH值為7.2~7.4，膜過濾除菌，然后將重組Nodinhibit-1粉末溶于該溶液中，即得Nodinhibit-1滴眼液。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，該治療角膜病滴眼液的制備方法步驟為: 按滴眼液的配方，按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液，準備材料；以IOml滴眼液計，以7.4mlPBS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐.100 μ 1、HEPES200 μ I，妥布霉素 100 μ I,重組 Nodinhibit-1 蛋白 2ml，pH 值為 7.2-7.4，滲透壓為 350m0sm/L ~380m0sm/L ； 將IOOyg重組Nodinhibit-1蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2mlPBS溶液中，然后和200 μ I胎牛血清，1MHEPES200 μ I及10%妥布霉素100 μ I混合均勻，補加PBS溶液于10ml，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.4，滲透壓為350m0sm/L~380m0sm/L，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，即得Nodinhibit-1滴眼液。
10.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，該治療角膜病滴眼液的制備方法步驟為: 按滴眼液的配方，按體積百分比包括:牛血清0.1%~5%，增稠劑5%~15%、酸堿調(diào)節(jié)液1%~5%，抗生素0.5%~2%，重組Nodinhibit-1蛋白5%~20%，余為平衡鹽溶液，準備材料；以1Oml滴眼液計，以7.4mlPBS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖酐.100 μ 1、HEPES200 μ 1，妥布霉素 100 μ 1,重組 Nodinhibit-1 蛋白 2ml，pH 值為 7.2-7.4，滲透壓為 350m0sm/L ~380m0sm/L ； 將1OOy gNodinhibit-Ι制成無菌微粉，將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ I胎牛血清、1MHEPES200 μ 1、10%妥布霉素 100 μ I 及 9.4mlPBS，調(diào)節(jié) PH值為 7.2-7.4，經(jīng) 0.2 μ m膜過濾除菌，然后將Nodinhibit-1粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350m0sm/L~380m0sm/L，即得 Nodinhibit-1 滴眼液。
【文檔編號】A61K31/7036GK103800892SQ201410035160
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】邵毅, 李程, 韓云, 裴重剛, 高桂平 申請人:南昌大學第一附屬醫(yī)院, 邵毅