痰熱清在制備抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了痰熱清在制備抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的一種新用途。本發(fā)明提供了痰熱清在制備抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)痰熱清在制備抑制細(xì)菌自溶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)痰熱清在制備通過抑制細(xì)菌自溶而抑制所述細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了痰熱清具有抑制細(xì)菌自溶、抑制細(xì)菌分裂的作用，即痰熱清是通過抑制細(xì)菌自溶而抑制所述細(xì)菌分裂，并且本發(fā)明證明了細(xì)菌分裂可以作為抗細(xì)菌藥物的新靶點(diǎn)。本發(fā)明對于抗細(xì)菌以及抗細(xì)菌藥物的研發(fā)具有重大價(jià)值。
【專利說明】痰熱清在制備抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及痰熱清在制備抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的一種新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，越來越多的致病菌對現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生了耐藥性，開發(fā)新靶點(diǎn)的抗生素迫在眉睫。細(xì)胞分裂是細(xì)菌繁殖的基本過程，可以作為一個(gè)具有潛力的藥物作用全新靶點(diǎn)。 [0003]痰熱清注射液是由上海凱寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)、具有獨(dú)家知識產(chǎn)權(quán)的國家中藥二類新藥，由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹等科學(xué)組方，嚴(yán)格按照中藥指紋圖譜生產(chǎn)而成，有清熱解毒、化痰、解痙、抑茵、抗病毒、解熱、免疫調(diào)節(jié)等作用。臨床主要可用于肺炎、支氣管炎、肝炎、病毒性腦炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥等多種痰病的治療。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供痰熱清在制備抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的一種新用途。
[0005]本發(fā)明提供了痰熱清在制備抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述細(xì)菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC9 Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0006]本發(fā)明還保護(hù)痰熱清在制備抑制細(xì)菌自溶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述細(xì)菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATOT Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0007]本發(fā)明還保護(hù)痰熱清在制備通過抑制細(xì)菌自溶而抑制所述細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述細(xì)菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC11 Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0008]本發(fā)明還保護(hù)一種抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。所述細(xì)菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCCs Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0009]本發(fā)明還保護(hù)一種抑制細(xì)菌自溶的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。所述細(xì)菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC16Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0010]本發(fā)明還保護(hù)一種通過抑制細(xì)菌自溶而抑制所述細(xì)菌分裂的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。所述細(xì)菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC151 Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0011]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了痰熱清具有抑制細(xì)菌自溶、抑制細(xì)菌分裂的作用，即痰熱清是通過抑制細(xì)菌自溶而抑制所述細(xì)菌分裂，并且本發(fā)明證明了細(xì)菌分裂可以作為抗細(xì)菌藥物的新靶點(diǎn)。本發(fā)明對于抗細(xì)菌以及抗細(xì)菌藥物的研發(fā)具有重大價(jià)值。本發(fā)明對于公共健康事業(yè)具有重大價(jià)值。
【專利附圖】
【附圖說明】[0012]圖1為實(shí)施例1的結(jié)果。
[0013]圖2為實(shí)施例2的結(jié)果。
[0014]圖3為實(shí)施例3的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。掃描電子顯微鏡:HITACHI，S3400N。透射電子鏡顯微鏡:HITACHI，H-7650。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus): ATCCT Number:為 25923。
[0016]LB培養(yǎng)基:取胰蛋白胨IOg(英國OXOID公司)、酵母提取物5g(英國OXOID公司)、NaCllOg (北京市慶盛達(dá)化工技術(shù)有限公司)，溶于去離子水并用去離子水定容至1L?；A(chǔ)培養(yǎng)液為含0.25g/100mL葡萄糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)的LB培養(yǎng)基。
[0017]痰熱清注射液(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司):為由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹五味中藥提取物，國藥準(zhǔn)字Z20030054 ;使用時(shí)，將痰熱清注射液冷凍干燥得到干粉；實(shí)施例中將干粉溶于基礎(chǔ)培養(yǎng)液，痰熱清濃度以每毫升培養(yǎng)液中含有的干粉微克數(shù)計(jì)。
[0018]青霉素鈉注射液，又稱注射用青霉素鈉:華北制藥股份有限公司，批號X1108105 ；使用時(shí)，將青霉素鈉注射液冷凍干燥得到干粉；實(shí)施例中將干粉溶于基礎(chǔ)培養(yǎng)液，青霉素鈉濃度以每毫升培養(yǎng)液中含有的干粉微克數(shù)計(jì)。
[0019]實(shí)施例1、通過掃描電鏡觀察痰熱清對細(xì)菌分裂的影響
[0020]取6孔板，每個(gè)孔內(nèi)加入一個(gè)洗凈消毒的玻璃片(0.5X0.5cm)，本實(shí)施例中對玻璃片進(jìn)行的操作都是在六孔板的各孔中進(jìn)行的，依次進(jìn)行如下步驟:
[0021]1、將玻璃片浸入OD6tltol=0.05金黃色葡萄球菌菌液，37°C靜置24h (在玻璃片的上表面生成成熟的細(xì)菌生物膜)。
[0022]2、將玻璃片分成3組，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)處理，分別進(jìn)行如下處理:
[0023]第一組(對照組):浸入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，37°C靜置24h ；
[0024]第二組(青霉素鈉組):浸入含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，37°C靜置24h ；
[0025]第三組(痰熱清組):浸入含2063 μ g/ml痰熱清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，37°C靜置24h。
[0026]4、前固定:將玻璃片浸入4%戊二醛溶液，4°C固定l_2h，然后用PBS緩沖液漂洗1-3 次(5min/次)。[0027]5、后固定:將玻璃片浸入1%鋨酸溶液，4°C固定l_2h，然后用PBS緩沖液漂洗1_3次(5min/ 次)。
[0028]6、脫水:取玻璃片，依次用30%乙醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗滌I次(15-20min/次)，然后用乙醇洗滌2次(15_20min/次)。
[0029]7、叔丁醇置換:將玻璃片浸入叔丁醇，_20°C靜置30min。
[0030]8、冷凍干燥:取玻璃片，用真空冷凍干燥儀冷凍干燥3_4h。
[0031]9、噴金:取玻璃片，用導(dǎo)電膠粘在樣品臺(tái)上，噴金后用掃描電鏡觀察并拍照。
[0032]步驟2至步驟9中，均保持細(xì)菌生物膜向上。
[0033]照片見圖1 (右圖為左圖方框內(nèi)部分的放大圖)。對照組的細(xì)菌生物膜中，細(xì)菌飽滿、大小均勻、表面平滑，細(xì)菌分裂完好，細(xì)菌相互聚結(jié)、疏密有秩。青霉素鈉組的細(xì)菌生物膜中，細(xì)菌形狀各異、大小不一，與對照組相比細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)較稀疏、基質(zhì)表層粗糙、但依然分裂完好。與對照組相比，痰熱清組的細(xì)菌生物膜中，細(xì)菌表面較為平滑、大小不均，很多細(xì)菌不能完成正常的分裂過程，出現(xiàn)兩、三個(gè)甚至四個(gè)子細(xì)胞團(tuán)(如圖中箭頭所示)。各組中，5個(gè)重復(fù)處理的結(jié)果一致。結(jié)果表明，痰熱清能夠阻止細(xì)菌的分裂。
[0034]實(shí)施例2、通過透射電鏡觀察痰熱清對細(xì)菌分裂的影響
[0035]1、分組處理如下(每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)處理):
[0036]第一組(對照 組):取離心管，加入10毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 107CFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0037]第二組(青霉素鈉組):取離心管，加入10毫升含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0038]第三組(痰熱清組):取離心管，加入10毫升含2063 μ g/ml痰熱清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0039]2、完成步驟I后，3000rpm離心IOmin,棄上清。
[0040]3、前固定:完成步驟2后，加入4%戊二醛溶液并4°C固定l_2h，然后用PBS緩沖液漂洗1-3次(5min/次)。
[0041]4、后固定:完成步驟3后，加入1%鋨酸溶液并4°C固定l_2h，然后用PBS緩沖液漂洗 1-3 次(5min/次)。
[0042]5、脫水:完成步驟4后，依次用30%乙醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗滌I次(15-20min/次)，然后用乙醇洗滌2次(15_20min/次)。
[0043]6、浸透
[0044]完成步驟5后，按如下步驟進(jìn)行浸透:
[0045]①丙酮:包埋劑=2:1 (體積比)，室溫、2h ；
[0046]②丙酮:包埋劑=1:1 (體積比)，室溫、2h ；
[0047]③包埋劑，室溫、2h。
[0048]7、包埋
[0049]取步驟6得到的組織塊，包埋在多孔橡膠包埋模板中每孔頂端，置烤箱(370C 12h — 45°C 12h — 60°C 24h)，形成包埋塊。
[0050]8、取步驟7得到的包埋塊，用超薄切片機(jī)切片。
[0051]9、取步驟8得到的切片，先用醋酸鈾室溫染色20min，然后去離子水漂洗4次(每次Is),然后用檸檬酸鉛室溫染色20min，然后去離子水漂洗4次(每次Is)，晾干后用透射電鏡觀察并拍照。
[0052]照片見圖2。對照組中，細(xì)菌形態(tài)完整，處于分裂期，細(xì)胞壁層次分明，外表面平整，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁密度差較大，分界清晰，細(xì)菌內(nèi)二分裂處細(xì)胞壁界限分明，細(xì)菌與細(xì)菌之間有顆粒物質(zhì)分布。青霉素鈉組中，細(xì)菌處于分裂期，細(xì)胞壁表面平整，與對照組相比細(xì)胞壁層次較不清晰且局部界限不清，有顆粒物質(zhì)分布于細(xì)胞壁上及細(xì)菌之間。痰熱清組中，細(xì)菌處于分裂期，形態(tài)完整，舊細(xì)胞壁表面較為光滑，表面無顆粒物，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的電子密度大致相同且明顯小于對照組，細(xì)胞質(zhì)電子密度較為均一，新生細(xì)胞壁不成形、層次不清晰，兩個(gè)子細(xì)胞之間沒有明顯的界限。各組中，5個(gè)重復(fù)處理的結(jié)果一致。結(jié)果表明，痰熱清能夠阻止細(xì)菌的分裂。
[0053]實(shí)施例3、自溶曲線的測定
[0054]本實(shí)施例中，用triton x_100誘導(dǎo)細(xì)菌自溶，通過測定OD值，檢測了痰熱清對細(xì)菌數(shù)量的影響。
[0055]1、分組處理如下(每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)處理):
[0056]第一組(對照組):取離心管，加入10毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 107CFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0057]第二組(青霉素鈉組):取離心管，加入10毫升含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0058]第三組(痰熱清組):取離心管，加入10毫升含2063 μ g/ml痰熱清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0059]第四組(痰熱清組):取離心管，加入10毫升含4125 μ g/ml痰熱清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0060]2、完成步驟I后，3000rpm離心IOmin,棄上清,每個(gè)重復(fù)處理得到的沉淀用5毫升含0.05% (體積比)triton χ-100的PBS緩沖液重懸。
[0061]3、取步驟2得到的菌液，吸取200 μ I到微孔板中，采用酶標(biāo)儀測595nm的初始吸光度(初始OD值)，每小時(shí)測定595nm的OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、以相對OD值(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值與初始OD值的比)為縱坐標(biāo)做自溶曲線。
[0062]自溶曲線見圖3。青霉素鈉組、兩個(gè)痰熱清組的相對OD值均大于對照組，即自溶率均小于對照組。各 組中，5個(gè)重復(fù)處理的結(jié)果一致。結(jié)果表明，痰熱清能抑制細(xì)菌自溶。
[0063]綜合實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3的結(jié)果，可以得出如下結(jié)論:痰熱清抑制了細(xì)菌自溶素的分泌或阻止了自溶素和細(xì)胞壁的結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)菌的自溶率下降，細(xì)菌無法進(jìn)行正常的二分裂，出現(xiàn)兩、三個(gè)甚至四個(gè)子細(xì)胞團(tuán)；因此可以推斷，痰熱清是蛋白抑制類藥物。
【權(quán)利要求】
1.痰熱清在制備抑制細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.痰熱清在制備抑制細(xì)菌自溶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.痰熱清在制備通過抑制細(xì)菌自溶而抑制所述細(xì)菌分裂的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。
5.如權(quán)利要求1至5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述痰熱清為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。
6.一種抑制 菌分裂的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。
7.一種抑制細(xì)菌自溶的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。
8.—種通過抑制細(xì)菌自溶而抑制所述細(xì)菌分裂的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。
9.如權(quán)利要求6至8中任一所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。
10.如權(quán)利要求6至9中任一所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述痰熱清為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。
【文檔編號】A61K35/32GK103690611SQ201410005141
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】王毅, 劉沖, 劉紹勇, 劉宜善, 王國明, 王藝竹, 于友華, 李連達(dá) 申請人:上海凱寶藥業(yè)股份有限公司