流感疫苗的制作方法

流感疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于針對(duì)流感疾病進(jìn)行免疫的流感疫苗組合物和疫苗接種方案，具體而言它涉及包含來自第一流感病毒毒株的抗原或抗原制劑和水包油乳狀液佐劑的免疫原性組合物，其用于誘導(dǎo)針對(duì)至少一種第二流感病毒毒株的免疫應(yīng)答，其中所述第二流感病毒毒株來自與所述第一流感病毒毒株不同的類型或不同的亞型。
【專利說明】流感疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及流感疫苗組合物和疫苗接種方案，其用于針對(duì)流感疾病進(jìn)行免疫，尤 其是用于誘導(dǎo)針對(duì)不包括在疫苗組合物中的流感病毒毒株的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答，并以持 續(xù)方式優(yōu)選至少數(shù)月維持那些應(yīng)答。
[0002] 發(fā)明背景 流感病毒是世界上存在的最普遍的病毒之一，同時(shí)影響人類和家畜。流感顯著導(dǎo)致經(jīng) 濟(jì)負(fù)擔(dān)、發(fā)病及甚至死亡。存在三種類型的流感：甲型、乙型和丙型。
[0003] 流感病毒是有包膜病毒，主要由內(nèi)部的核衣殼或與核蛋白結(jié)合的核糖核酸（RNA) 的核(其由具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的病毒包膜和外部的糖蛋白所包圍)組成。病毒包膜的內(nèi)層主 要由基質(zhì)蛋白質(zhì)構(gòu)成，并且外層主要為源自宿主的脂質(zhì)物質(zhì)。流感病毒含有兩類表面抗原， 糖蛋白神經(jīng)氨酸酶（NA)及血細(xì)胞凝集素（HA)，其作為刺突出現(xiàn)在顆粒表面。正是這些表面 蛋白，特別是HA決定了流感亞型的抗原特異性。
[0004] 病毒毒株根據(jù)起源的宿主物種、地理位置和分離年份、序號(hào)進(jìn)行分類，并且對(duì)于 甲型流感，通過HA和NA的亞型的血清學(xué)特性進(jìn)行分類。甲型流感病毒的16種HA亞型 (H1-H16)和 9 種NA亞型（N1-N9)已經(jīng)被鑒定[WebsterRG等人Evolutionandecology ofinfluenzaAviruses.Microbiol.Rev.1992; 56: 152-179;FouchierRA等人· CharacterizationofaNovelInfluenzaAVirusHemagglutininSubtype(H16) ObtainedfromBlack-HeadedGulls. 7；KiroA2005;79:2814-2822)。所有HA和NA亞 型的病毒均已從水禽中獲得，但是只有3種HA亞型（H1、H2和H3)以及2種NA亞型（NI和 N2)自1918年已在人群中建立了穩(wěn)定系。只有1種HA亞型和1種NA亞型識(shí)別為乙型流感 病毒。
[0005] 甲型流感病毒進(jìn)化并不斷經(jīng)受抗原變異[WileyD,SkehelJ.Thestructure andthefunctionofthehemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirus. Aw.TfeK沿ocAe?. 1987;56:365-394]。缺乏通過病毒RNA聚合酶的有效校對(duì)導(dǎo)致高比 例的轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤，這可導(dǎo)致表面糖蛋白中的氨基酸取代。這被稱為"抗原漂移"。分段的病毒 基因組允許第二種類型的抗原變異。如果兩種流感病毒同時(shí)感染宿主細(xì)胞，稱為"抗原轉(zhuǎn) 變"的基因重排列可能會(huì)產(chǎn)生具有新的表面或內(nèi)部蛋白質(zhì)的新型病毒。由抗原轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的 流感病毒毒株，特別地，可能導(dǎo)致大流行病。
[0006] 疫苗接種在控制流感大流行病中扮演重要的角色。目前可用的流感疫苗為滅活 或減毒活流感疫苗。滅活流感疫苗由3種可能形式的抗原制劑構(gòu)成：滅活完整病毒、其中 純化的病毒顆粒用去污劑或其他試劑溶解脂質(zhì)包膜進(jìn)行破壞的亞病毒粒子(稱為"裂解"疫 苗）或純化的HA和NA(亞單位疫苗)。這些滅活疫苗通常肌內(nèi)（i.m.)、皮下（s.c)或鼻內(nèi) (i.η·)給予。
[0007] 所有種類的用于大流行病間使用（interpandemicuse)的流感疫苗(也稱為季節(jié) 性的)，通常為三價(jià)疫苗。它們通常含有源自兩種甲型流感病毒毒株和一種乙型流感病毒毒 株的抗原。標(biāo)準(zhǔn)的0.5ml可注射劑量在大部分情況下含有各毒株(至少）15μg的HA，如 通過單向福射狀免疫擴(kuò)散（SRD)所測(cè)量的（J.M.Wood等人：Animprovedsingleradial immunodiffusiontechniquefortheassayofinfluenzahaemagglutininantigen: adaptationforpotencydeterminationofinactivatedwholevirusandsubunit vaccines.J.Biol.Stand. 5 (1977) 237-247;J.M.Wood等人，International collaborativestudyofsingleradialdiffusionandImmunoelectrophoresis techniquesfortheassayofhaemagglutininantigenofinfluenzavirus.J.Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)。通常，那些疫苗是未佐劑化的。
[0008] 近期已經(jīng)開發(fā)了具有交叉保護(hù)效力的新疫苗，其可以被用做大流行前疫苗或儲(chǔ) 存疫苗來在宣告大流行病之前或宣告大流行病時(shí)引發(fā)免疫上未接種的人群以對(duì)抗大流 行毒株。此類疫苗與有效的佐劑一同配制以加強(qiáng)對(duì)亞病毒粒子抗原的免疫應(yīng)答。例如， W02008/009309 或Leroux-Roels等人（PLosONE, 2008. 3(2): 1-5)公開了包含與大流 行病相關(guān)的流感抗原與包含水包油乳狀液的佐劑的組合的疫苗。特別地，觀察到接種含有 進(jìn)化枝1的H5N1流感病毒毒株的含水包油佐劑化的免疫原性組合物產(chǎn)生了針對(duì)進(jìn)化枝2 的H5N1流感病毒毒株的交叉反應(yīng)性。另一研究已報(bào)道施用用水包油乳狀液佐劑化的大流 行疫苗，隨后施用下一季節(jié)性的三價(jià)疫苗（Gilca等人，Vaccine. 2011，30(1): 35-41)。
[0009] 另一研究已報(bào)道兩次劑量的用MF59佐劑化的H5N3流感疫苗在已引發(fā)的人群中 加強(qiáng)了對(duì)流感H5N1 的免疫（St印henson等人，Vaccine2003，21，1687-1693)。進(jìn) 一步的研究已報(bào)道在三次劑量的特定水包油乳狀液佐劑化的流感H5N3疫苗后獲得了對(duì) H5N1病毒的交叉反應(yīng)性抗體應(yīng)答（Stephenson等人，J.Infect.Diseases2005，191， 1210-1215)。
[0010] 然而，仍存在對(duì)這樣的疫苗組合物和疫苗接種策略的需求，所述疫苗組合物和疫 苗接種策略能夠提供更廣泛的交叉保護(hù)，特別是關(guān)于不同亞型的流感病毒的交叉保護(hù)，和 關(guān)于不同類型的流感病毒、可能多種不同毒株的交叉保護(hù)，以及隨時(shí)間持續(xù)的更廣泛的交 叉保護(hù)。
[0011] 發(fā)明概沭 在本發(fā)明的第一方面中，提供包含來自第一流感病毒毒株的抗原或抗原制劑和水包油 乳狀液佐劑的免疫原性組合物，其用于誘導(dǎo)針對(duì)來自與所述第一流感病毒毒株不同的類型 或不同的亞型的至少一種第二流感病毒毒株的免疫應(yīng)答。
[0012] 在本發(fā)明第二方面中，提供包含來自至少一種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑的 第二免疫原性組合物，其用于根據(jù)一次劑量方案在兒童主體中使用，所述兒童主體之前已 接種有包含來自至少一種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑和水包油乳狀液佐劑的第一免 疫原性組合物。
[0013] 在第三方面中，提供包含來自第一流感病毒毒株的抗原或抗原制劑和水包油乳狀 液佐劑的免疫原性組合物，其用于治療或預(yù)防由第二流感病毒毒株引起的疾病，其中所述 第二流感病毒毒株來自與所述第一流感病毒毒株不同的亞型或不同的類型。
[0014] 在第四方面中，提供預(yù)防和/或治療流感疾病的方法，其中首先施用包含來自至 少一種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑連同水包油乳狀液佐劑的第一免疫原性組合物，和 施用包含來自至少一種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑的第二免疫原性組合物。
[0015] 附圖簡(jiǎn)沭 圖1.在臨床前的引發(fā)-加強(qiáng)（prime-boost)疫苗接種的小鼠模型中的HlNl引發(fā)。 用Pandemrix?引發(fā)隨后為Fluarix?加強(qiáng)相比于一次施用Fluarix?產(chǎn)生了針對(duì)A/H3N2/ Victoria和B/Brisbane(和A/HINl/California)更高的HI滴度。參見實(shí)施例 3。N= 12只小鼠/條件。GMT=幾何平均滴度。
[0016] 發(fā)明詳沭 本發(fā)明發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，相比于只接種第二免疫原性組合物的主體群體中所獲得的，接 種有含有來自第一流感病毒毒株的流感抗原連同水包油乳狀液佐劑的免疫原性組合物的 主體群體，展示出響應(yīng)于用含有來自同樣流感病毒毒株的流感抗原的第二免疫原性組合物 接種的改進(jìn)的免疫應(yīng)答。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相比于只接種第二免疫原性組合物的主體群體 中所獲得的，這樣的在先的疫苗接種允許實(shí)現(xiàn)響應(yīng)于用含有來自不同的亞型或不同的類型 的第二流感病毒毒株的流感抗原的第二次免疫原性組合物接種的改進(jìn)的免疫應(yīng)答。這顯示 出用水包油乳狀液佐劑佐劑化的流感制劑可以有利地用于誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答，即針 對(duì)變體毒株或針對(duì)一定范圍的相關(guān)毒株的可檢測(cè)的免疫(體液的和/或細(xì)胞的)。它們也可 以有利地用于誘導(dǎo)交叉引發(fā)（cross-priming)策略，即誘導(dǎo)利于用同樣的流感病毒毒株和 /或不同毒株再次疫苗接種(一次劑量）時(shí)應(yīng)答的"引發(fā)的（primed) "免疫記憶。
[0017] 特別地，本發(fā)明人驚訝地觀察到，在先接種含有甲型流感病毒毒株連同水包油乳 狀液佐劑的免疫原性組合物導(dǎo)致響應(yīng)于接種含有乙型流感病毒毒株的免疫原性組合物的 改進(jìn)的免疫應(yīng)答，表明交叉引發(fā)策略不局限于密切相關(guān)的流感病毒毒株。
[0018] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供預(yù)防和/或治療流感疾病的方法，其中合適地根據(jù)一 次劑量方案，含有來自至少一種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑連同水包油乳狀液佐劑的 第一免疫原性組合物首先施用，并且合適地根據(jù)一次劑量方案，含有來自流感病毒毒株的 抗原或抗原制劑的第二免疫原性組合物隨后施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一免疫原性組合 物的至少一種流感病毒毒株和第二免疫原性組合物的至少一種流感病毒毒株是不同的類 型或不同的亞型的。合適地第一免疫原性組合物在宣告大流行病時(shí)施用，并且第二免疫原 性組合物隨后施用。可選地，施用第一免疫原性組合物是大流行前策略的一部分，并在宣告 大流行病之前進(jìn)行，作為引發(fā)策略，因此允許免疫系統(tǒng)被引發(fā)，隨后進(jìn)行進(jìn)一步的/加強(qiáng)的 免疫原性組合物的施用。通常，第二免疫原性組合物在第一免疫原性組合物之后至少4個(gè) 月，合適地在之后6或8至14個(gè)月，合適地在之后約10至12個(gè)月，例如12個(gè)月，或之后甚 至更長施用。合適地于一年后或甚至多于一年后施用第二免疫原性組合物，能夠加強(qiáng)抗體 和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。這非常重要，因?yàn)檫M(jìn)一步的感染可能發(fā)生于第一次大流行病爆發(fā)之 后數(shù)月。根據(jù)需要，第二免疫原性組合物的施用可能會(huì)多于一次，例如兩次。在一個(gè)實(shí)施方 案中，提供預(yù)防和/或治療流感疾病的方法，其中含有來自至少一種流感病毒毒株的抗原 或抗原制劑連同水包油乳狀液佐劑的第一免疫原性組合物首先施用，并且含有來自流感病 毒毒株的抗原或抗原制劑的第二免疫原性組合物在至少6個(gè)月后，例如一年之后施用。
[0019] 令人驚訝地，在僅一次劑量的第一免疫原性組合物和僅一次劑量的含有源自第二 流感病毒毒株的流感抗原的第二免疫原性組合物后，觀察到了當(dāng)用含有來自第一流感病毒 毒株的流感抗原連同水包油乳狀液佐劑的第一免疫原性組合物首先接種主體群體時(shí)所達(dá) 到的改進(jìn)的免疫應(yīng)答。
[0020] 本發(fā)明人此外觀察到用于本發(fā)明的免疫原性組合物，不但可以誘導(dǎo)，還可以維持 針對(duì)不只存在于第一免疫原性組合物中的流感病毒毒株而且還針對(duì)不同類型或不同亞型 的流感病毒毒株的隨時(shí)間的顯著水平的免疫應(yīng)答。因此，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性組合 物，有能力確保針對(duì)由流感病毒毒株引起的流感疾病的持續(xù)的免疫應(yīng)答，所述流感病毒毒 株為與包括在第一免疫原性組合物中的毒株（i)相同、（ii)不同的類型、或（iii)不同的 亞型。特別地，持續(xù)性意味著在接種疫苗后至少3個(gè)月后，合適地至少6個(gè)月后，更合適地 至少12個(gè)月后能達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的抗體應(yīng)答。特別地，根據(jù)本發(fā)明使用的要求保護(hù)的組合物 能夠誘導(dǎo)在至少3個(gè)月后在>50%、合適地>60%的個(gè)體>70%的個(gè)體、合適地>80%的個(gè)體或 合適地>90%的個(gè)體中對(duì)疫苗中存在的流感病毒毒株的保護(hù)性水平的抗體，如同通過保護(hù) 率所測(cè)量的(見表1 )。在一個(gè)具體的方面中，至少接種疫苗6個(gè)月后對(duì)疫苗組合物的流感病 毒毒株獲得了 >90%的保護(hù)性水平的抗體。
[0021] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供流感免疫原性組合物，例如疫苗，和用于對(duì)流感 疾病進(jìn)行免疫的疫苗接種方案，特別用于誘導(dǎo)針對(duì)不包括在免疫原性組合物中的流感病毒 毒株的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答，并以持續(xù)的方式維持這些應(yīng)答，合適地至少數(shù)月。
[0022] 流感病毒毒株和抗原 在一種實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所使用的流感病毒或其抗原制劑可以為裂解的流感病 毒或其裂解的病毒抗原制劑。在可選的實(shí)施方案中，流感的制劑可能含有另一類型的滅活 的流感抗原，例如滅活的完整病毒或重組的和/或純化的HA和NA(亞單位疫苗)，或流感病 毒體（virisome)。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，流感病毒可能為活減毒流感制劑。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原制劑合適地為滅活病毒制劑， 其中病毒顆粒用去污劑或其他試劑破壞以溶解脂質(zhì)包膜。裂解病毒或其裂解病毒抗原制 劑合適地通過完整流感病毒(有傳染性的或滅活的）的片段化進(jìn)行制備，其使用溶解濃度的 有機(jī)溶劑或去污劑，并隨后去除所有的或大部分的溶解試劑和一些或大部分的病毒脂質(zhì)物 質(zhì)。其裂解病毒抗原制劑意味著這樣的裂解病毒制劑，其相比于裂解病毒可以經(jīng)歷過一定 程度的純化，同時(shí)保留有裂解病毒組分的大部分的抗原特性。例如，當(dāng)在蛋中產(chǎn)生時(shí)，可以 從裂解病毒中去除蛋污染蛋白，或者當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生時(shí)，可以從裂解病毒中去除宿 主細(xì)胞污染物。裂解病毒的抗原制劑可能含有多于一種病毒毒株的裂解病毒抗原組分。含 有裂解病毒的(稱為"流感裂解疫苗"）或裂解病毒抗原制劑的疫苗，通常含有殘留的基質(zhì)蛋 白和核蛋白并有時(shí)含有脂質(zhì)，以及膜包膜蛋白。這樣的裂解病毒疫苗通常將含有大部分或 全部的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，雖然其不需要以如它們存在于完整病毒中的相同比例。
[0024] 可選地，流感病毒可能以完整病毒疫苗的形式。在大流行病情況下這可能會(huì)證明 相對(duì)于裂解病毒疫苗具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗苊饬耸欠衲艹晒Φ禺a(chǎn)生流感病毒的新毒株的裂解 病毒疫苗的不確定性。對(duì)于一些毒株，用于產(chǎn)生裂解病毒的常規(guī)去污劑可以破壞病毒并使 其無法使用。除了用完整病毒方法的更高程度的確定性，還存在相比于裂解病毒更大的疫 苗生產(chǎn)能力，這是因?yàn)樵谥苽浜线m的裂解疫苗所需要的額外的純化步驟過程中喪失了相當(dāng) 數(shù)量的抗原。
[0025] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，流感病毒的制備是以純化的亞單位流感疫苗的形式。亞單 位流感疫苗通常含有兩種主要的包膜蛋白，HA和NA，并且可能相對(duì)于完整病毒粒（virion) 疫苗具有額外的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兺ǔ檩^低反應(yīng)原性的，特別是在年輕的疫苗接種者中。亞 單位疫苗可以通過重組或從破壞的病毒顆粒中純化進(jìn)行生產(chǎn)。
[0026] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，流感病毒制劑是以病毒體的形式。病毒體是球形的單層脂 質(zhì)體（unilamellarvesicle),其保持有以真實(shí)的構(gòu)象的有功能的病毒包膜糖蛋白HA和 NA，所述糖蛋白插入于病毒體的磷脂雙層膜中。
[0027] 所述流感病毒或其抗原制劑可以是源自蛋或源自細(xì)胞培養(yǎng)物。它們也可以在其他 系統(tǒng)如昆蟲細(xì)胞、植物、酵母或細(xì)菌中生產(chǎn)和/或通過重組生產(chǎn)。
[0028] 例如，根據(jù)本發(fā)明的流感病毒抗原或其抗原制劑可以來源于常規(guī)的胚胎蛋方法 (embryonatedeggmethod),通過在蛋中生長流感病毒并純化收集的尿囊液。蛋可以在短 的通知時(shí)間內(nèi)大量積累?？蛇x地，它們可以來源于使用組織培養(yǎng)來生長病毒或表達(dá)重組流 感病毒表面抗體的任何新的產(chǎn)生方法。合適的用于病毒生長的細(xì)胞基底（cellsubstrate) 包括例如狗腎細(xì)胞如MDCK或來自MDCK克隆的細(xì)胞、MDCK樣細(xì)胞、猴腎細(xì)胞如AGMK細(xì)胞包 括Vero細(xì)胞、合適的豬細(xì)胞系，或任何其他適用于生產(chǎn)疫苗目的的流感病毒的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞類型。合適的細(xì)胞基底也包括人細(xì)胞如MRC-5或Per-C6細(xì)胞。合適的細(xì)胞基底不限于 細(xì)胞系；例如原代細(xì)胞如雞胚胎成纖維細(xì)胞和禽細(xì)胞系，例如EB66細(xì)胞，同樣包含在內(nèi)。
[0029] 流感病毒抗原或其抗原制劑可以由大量商業(yè)可應(yīng)用方法的任一種進(jìn)行生產(chǎn)，例如 專利號(hào)DD300 833和DD211 444中所描述的裂解流感方法，其通過引用并入本文。傳 統(tǒng)的裂解流感使用溶劑/去污劑處理來生產(chǎn)，如三-正丁基磷酸酯，或乙醚與Tween?組合 (稱為"Tween-ether〃裂解)，并且該方法仍在一些生產(chǎn)設(shè)備中使用。其他目前使用的裂解 試劑包括去污劑或蛋白質(zhì)水解酶或膽汁鹽，例如專利號(hào)DD155 875描述的脫氧膽酸鈉，其 通過引用并入本文。可以被用作裂解試劑的去污劑包括陽離子去污劑，例如十六烷基三甲 基溴化銨（CTAB)，其他離子去污劑，例如十二烷基硫酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽，或非離子去污 劑例如上文描述的那些包括TritonX-100 (例如在Lina等人，2000，Biologicals28， 95-103中描述的方法）和TritonN-101，或任何兩種或更多種去污劑的組合。
[0030] 裂解疫苗的制備方法可能包括多個(gè)不同的過濾和/或其他分離步驟諸如以多種 組合的超速離心、超濾、區(qū)帶離心和層析(例如離子交換）步驟，以及任選滅活步驟例如熱、 甲醛或β-丙內(nèi)酯或U.V.，其可以在裂解之前或之后進(jìn)行。裂解方法可以以分批、連續(xù)或 半連續(xù)方法進(jìn)行。合適的用于裂解免疫原性組合物的裂解和純化方法描述于WO02/097072 中。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的合適的裂解流感疫苗抗原制劑包含生產(chǎn)方法中留下的殘余量的 Tween80和/或TritonΧ-100,雖然這些在制備裂解抗原后可能被加入或調(diào)節(jié)其濃度。這 些非離子表面活性劑在疫苗劑量中的終濃度的合適范圍為： Tween80 :0· 01至1%，合適地約0· 1% (v/v) TritonX-100 :0· 001 至 0·I(%w/v)，合適地 0· 005 至 0· 02% (w/v)。
[0032] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，Tween80的終濃度范圍為0· 045%-0· 09%w/v。在 另一具體的實(shí)施方案中，提供抗原為兩倍濃縮的混合物，其具有Tween80濃度范圍為 0. 045%-0. 2% (w/v)，并需要根據(jù)含佐劑(或?qū)φ罩苿┑木彌_液）的最終制劑稀釋兩次。
[0033] 在另一具體的實(shí)施方案中，TritonX-100的終濃度范圍為0· 005%-0· 017%w/v。在 另一具體的實(shí)施方案中，提供抗原為兩倍濃縮的混合物，其具有TritonX-100濃度范圍為 0. 005%-0. 034% (w/v)，并需要根據(jù)含佐劑(或?qū)φ罩苿┑木彌_液）的最終制劑稀釋兩次。 [0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的流感制劑是在低水平的防腐劑特別是硫柳汞的 存在下，或者合適地在不存在硫柳汞的情況下制備。
[0035] 如之前所描述的，流感病毒可以分為3個(gè)類型：甲型、乙型和丙型。因此，在本發(fā)明 的意義中，術(shù)語"流感類型"應(yīng)理解為甲型、乙型或丙型。
[0036] 基于其HA(16種亞型，Hl至H16)和NA蛋白（9種亞型，Nl至N9)，甲型流感病毒 可以進(jìn)一步分類為不同的亞型，而乙型流感病毒已知僅由一種HA和一種NA亞型構(gòu)成。因 此，在本發(fā)明的意義中，術(shù)語"流感亞型"應(yīng)理解為具有給定H亞型和給定N亞型的甲型流 感病毒毒株，并且術(shù)語"不同亞型"指的是不具有相同H亞型和/或相同N亞型的流感病毒 毒株。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性組合物含有來自第一流感病毒毒 株的抗原或抗原制劑，并用于誘導(dǎo)針對(duì)至少一種具有不同于第一流感病毒毒株的H(HA亞 型）的H(HA)亞型的第二流感病毒毒株的免疫應(yīng)答。
[0038] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性組合物含有來自第一流感 病毒毒株的抗原或抗原制劑，并用于誘導(dǎo)針對(duì)至少一種具有相同N(NA)亞型但具有與第一 流感病毒毒株的H(HA亞型）不同的H(HA)亞型的第二流感病毒毒株的免疫應(yīng)答。
[0039] 如上文所述，甲型流感病毒不斷地進(jìn)化并經(jīng)歷抗原變異。缺乏通過病毒RNA聚合 酶進(jìn)行的有效的校正，會(huì)引起高比例的轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤，其可以導(dǎo)致表面糖蛋白例如HA和NA蛋白 中的氨基酸取代。這被稱為"抗原漂移"。分段的病毒基因組允許第二類型的抗原變異。如 果兩種流感病毒同時(shí)感染宿主細(xì)胞，稱為"抗原轉(zhuǎn)變"的基因重排列可能產(chǎn)生具有新的表面 或內(nèi)部蛋白的新型病毒。這些抗原改變"漂移"和"轉(zhuǎn)變"都是不可預(yù)測(cè)的，并且從免疫學(xué) 觀點(diǎn)的角度上可能具有重大影響，因?yàn)樗鼈冏罱K導(dǎo)致新的流感病毒毒株的出現(xiàn)，并且其使 得病毒逃脫免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致熟知的、幾乎每年的流行病。這兩種基因改變已產(chǎn)生導(dǎo)致人中的 大流行病的新的病毒變體。
[0040] 因此，在本發(fā)明的意義中，術(shù)語"變體毒株"應(yīng)理解為不相同的，但對(duì)于參考毒株經(jīng) 歷抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)變的毒株。
[0041] 本發(fā)明中使用的含有水包油乳狀液佐劑的免疫原性組合物可能含有來自任何類 型（甲型、乙型、丙型)和任何亞型（Hl至H16及Nl至N9)的流感病毒的流感抗原。合適地， 待包含于根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性組合物中的流感病毒來自大流行毒株。大流行毒株意 指是絕大部分人群對(duì)其沒有免疫力的新型流感病毒。在遍及本文中，將把大流行毒株指作 與流感疾病的爆發(fā)相關(guān)或易于與其相關(guān)的流感病毒毒株，例如大流行甲型流感病毒毒株。 合適的大流行毒株為但不限于：冊(cè)附、!19吧、!17階、!12吧、!17附和！1謂1。人中其他合適的大 流行毒株為H7N3 (兩例報(bào)告于加拿大)，H10N7 (兩例報(bào)告于埃及）和H5N2 (-例報(bào)告于日 本)?；蛘撸诟鶕?jù)本發(fā)明使用的含有水包油乳狀液佐劑的免疫原性組合物中的流感 病毒可以來自經(jīng)典毒株，即非大流行毒株。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性組合物含有甲型流感病毒，例如 Hl例如H1N1、H2、H5例如H5N1、H7或H9,并且用于誘導(dǎo)針對(duì)至少一種不同亞型的流感病毒 (例如H3)的免疫應(yīng)答。在可選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性組合物含有甲型 流感病毒，例如Hl例如H1N1、H2、H5例如H5N1、H7或H9,并且用于誘導(dǎo)針對(duì)至少一種乙 型流感病毒的免疫應(yīng)答。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性水包油乳狀液佐劑化的組合物是 單價(jià)的，即只含有一種流感病毒毒株。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的單價(jià)免 疫原性水包油乳狀液佐劑化的組合物含有大流行流感病毒毒株或具有與大流行病相關(guān)的 潛力的毒株。在可選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性水包油乳狀液佐劑化的組 合物是多價(jià)的，即含有多種流感病毒毒株。例如，組合物合適地為二價(jià)的、三價(jià)的或四價(jià)的。 [0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性水包油乳狀液佐劑化的組合物用 于誘導(dǎo)針對(duì)多種流感病毒毒株的免疫應(yīng)答，任選地包括來自不同于免疫原性水包油乳狀液 佐劑化的組合物中所包含的流感病毒毒株的亞型或類型的多種毒株。
[0045] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性水包油乳狀液佐劑化的組 合物用于誘導(dǎo)針對(duì)以下的一種、兩種、三種或全部的免疫應(yīng)答：A/H1N1毒株、A/H3N2毒株、Yagamata系的乙型毒株和Victoria系的乙型毒株。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的流感病毒或抗原制劑和水包油乳狀液佐劑 包含于同一容器中。它被稱為"一瓶法（onevialapproach)"。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根 據(jù)本發(fā)明使用的流感病毒或抗原制劑和水包油乳狀液佐劑是兩組分疫苗，即抗原制劑和佐 劑存在于不同容器中，在向主體施用前進(jìn)行混合。
[0047] ^<包油乳狀液佐劑 本發(fā)明的佐劑組合物含有水包油乳狀液佐劑，合適地所述乳狀液含有以總體積的 0. 5%-20%的量的可代謝油，并且具有其中以強(qiáng)度（intensity)計(jì)至少70%為直徑小于1 μm的油微滴。
[0048] 術(shù)語可代謝油的含義在本領(lǐng)域內(nèi)熟知?？纱x可以定義為"能夠通過新陳代謝 來轉(zhuǎn)化，'（DorlancTsIllustratedMedicalDictionary,ff.B.SandersCompany,第 25版（1974))。油可以是任何植物油、魚油、動(dòng)物油或合成油，其對(duì)受體不具有毒性且 可以通過新陳代謝轉(zhuǎn)化。堅(jiān)果、種子和谷物是植物油的常見來源。合成油也是本發(fā)明的 一部分，并可以包括可商購油例如ΝΕ0ΒΕΕ?及其他。特別合適的可代謝油是鯊烯。鯊烯 (2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六烯）是大量存在于鯊魚肝油中 且少量存在于橄欖油、麥胚芽油、米糠油和酵母中的不飽和油，并且是用于本發(fā)明中的特別 合適的油。鯊烯作為可代謝油是由于其是生物合成膽固醇的中間體（Merckindex，第10 版，登錄號(hào)8619)。
[0049] 水包油乳狀液本身在本領(lǐng)域中是熟知的，并且已被暗示可用為佐劑組合物（EP 399843;WO95/17210)〇
[0050] 合適的可代謝油以免疫原性組合物總體積的0. 5%-20% (終濃度）的量存在，合適 地以總體積的1. 〇%-1〇%的量，合適地以總體積的2. 0%-6. 0%的量。
[0051] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可代謝油以免疫原性組合物總體積的約0. 5%、1%、3. 5% 或5%的最終量存在。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可代謝油以免疫原性復(fù)合物總體積的 0. 5%、1%、3. 57%或5%的最終量存在。鯊烯合適的量為每疫苗劑量約10. 7mg，合適地為每 疫苗劑量10. 4至11.0mg。
[0052] 合適地，本發(fā)明的水包油乳狀液系統(tǒng)具有在亞微米范圍的小的油微滴大小。合適 地，微滴直徑大小范圍將是120至750nm，合適地大小為120至600nm。通常，水包油乳 狀液含有其中以強(qiáng)度計(jì)至少70%為直徑小于500nm的油微滴，尤其是以強(qiáng)度計(jì)至少80%為 直徑小于300nm，合適地以強(qiáng)度計(jì)至少90%的直徑范圍在120至200nm。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的油微滴的大小，即直徑，以強(qiáng)度給出。存在幾種通過強(qiáng)度來測(cè)定油微 滴大小的直徑的方法。強(qiáng)度使用定徑（sizing)儀器，合適地通過動(dòng)態(tài)光散射例如Malvern Zetasizer4000或合適地為MalvernZetasizer3000HS進(jìn)行測(cè)量。詳細(xì)的程序在實(shí)施例 II. 2中給出。第一種可能性是通過動(dòng)態(tài)光散射（PCS-光子相關(guān)光譜法）測(cè)定z平均直徑 ZAD;該方法額外給出多分散指數(shù)（PDI)，且ZAD和PDI均用累積量算法計(jì)算。這些值不需要 知道粒子折射率。第二種方式是通過另一種算法Contin、或NNLS、或自動(dòng)的"Malvern"算 法(為定徑儀器提供的缺省算法)經(jīng)測(cè)定整體粒子大小分布來計(jì)算油微滴的直徑。大多數(shù)情 況下，由于復(fù)雜組合物的粒子折射率是未知的，只有強(qiáng)度分布被考慮在內(nèi)，并且如需要，為 源自該分布的強(qiáng)度平均值。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的水包油乳狀液可以含有固醇或生育酚，例如α生育酚。固醇在本領(lǐng) 域內(nèi)熟知，例如膽固醇是熟知的，并公開于例如MerckIndex,第11版，第341頁中，其作 為發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物脂肪中的天然存在的固醇。其他合適的固醇包括β_谷固醇、豆固醇、麥角固 醇和麥角鈣化醇。所述固醇合適地以免疫原性組合物總體積的〇. 01%_20% (w/v)的量存 在，合適地以0.1%至5% (w/v)的量。合適地，當(dāng)固醇為膽固醇時(shí)，它以免疫原性組合物總 體積的0.02%至0.2% (w/v)的量存在，通常以在0.5ml疫苗劑量體積中0.02% (w/v)的 量，或在0. 5ml疫苗劑量體積中0. 07% (w/v)或在0. 7ml疫苗劑量體積中0. 1% (w/v)。
[0055] 合適地，存在α-生育酚或其衍生物例如α-生育酚琥珀酸酯。合適地，α-生育 酚以免疫原性組合物總體積的〇. 2%至5. 0%(ν/ν)的量存在，合適地以在0. 5ml疫苗劑量體 積中2. 5% (v/v)的量，或在0· 5ml疫苗劑量體積中0· 5% (v/v)或在0· 7ml疫苗劑量體 積中1. 7-1. 9% (v/v)，合適地為1. 8%。在此說明，以v/v給出的濃度可以通過應(yīng)用以下轉(zhuǎn) 換因子轉(zhuǎn)換為以w/v計(jì)的濃度：5% (v/v)的α-生育酚濃度等于4. 8% (w/v)α-生育酚濃 度。α-生育酚的合適量為每疫苗劑量約11. 9mg，合適地每疫苗劑量11. 6至12. 2mg。
[0056] 水包油乳狀液可以包含乳化劑。乳化劑可以以免疫原性組合物的0. 01重量％至 5. 0重量％ (w/w)的量存在，合適地以0. 1重量％至2. 0重量％ (w/w)的量存在。合適的 濃度為總組合物的〇. 5重量％至1. 5重量％(w/w)。
[0057] 乳化劑可以合適地為聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯（Tween80)。在一個(gè)具體的實(shí) 施方案中，0.5ml疫苗劑量體積含有1% (w/w)Tween80,并且0.7ml疫苗劑量體積含有 0· 7% (w/w)Tween80。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，Tween80濃度為0· 2% (w/w)。聚山 梨醇酯80的合適量為每疫苗劑量約4. 9mg，合適地每疫苗劑量4. 6至5. 2mg。
[0058] 合適地,疫苗劑量包含以每疫苗劑量約11. 9mg的量的α-生育酚、以每疫苗劑量 10. 7mg的量的鯊烯、和以每疫苗劑量約4. 9mg的量的聚山梨醇酯80。
[0059] 水包油乳狀液佐劑可以與其他佐劑或免疫促進(jìn)劑一同使用，并且因此本發(fā)明的一 個(gè)重要實(shí)施方案是含有鯊烯或另一種可代謝油、生育酚例如α-生育酚、及Tween80的水 包油制劑。水包油乳狀液還可以含有span85和/或Lecithin。通常,水包油會(huì)含有免疫 原性組合物總體積2至10%的鯊烯、2至10%的α-生育酚和0.3至3%的Tween80， 并可以根據(jù)WO95/17210描述的程序生產(chǎn)。合適地，鯊烯：α-生育酚的比例等于或小于1， 因?yàn)檫@提供更穩(wěn)定的乳狀液。Span85(聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯）也可以存在，例如 以1%的水平。用于本發(fā)明的水包油乳狀液佐劑的合適實(shí)例在EP0399843B中給出并詳述， 也稱為MF59。
[0060] 麟 待用本發(fā)明的免疫原性組合物接種的目標(biāo)人群是全部人群，例如健康的青年人(例如 18-60歲）、老年人(通常為大于60歲）或嬰兒/兒童。目標(biāo)人群可以具體是無免疫應(yīng)答的。 相比于健康的成年人，無免疫應(yīng)答的人通常較少能充分對(duì)抗原，特別是流感抗原應(yīng)答。
[0061] 在根據(jù)本發(fā)明的一方面，目標(biāo)人群是未接種的（na'ive)(例如相對(duì)于大流行毒株） 或?qū)ο惹皩?duì)流感感染或疫苗接種不能應(yīng)答的未針對(duì)流感引發(fā)的人群。合適地，目標(biāo)人群是 老年人，合適地年齡至少60歲或65歲或以上，更年輕的高危成年人（即年齡18至60歲之 間）例如在醫(yī)療機(jī)構(gòu)工作的人，或具有風(fēng)險(xiǎn)因素例如心血管和肺部疾病、或糖尿病的年輕 人。另一目標(biāo)人群是所有6個(gè)月或以上年齡的兒童，所述兒童經(jīng)歷相對(duì)高的流感相關(guān)的住 院率。特別地，本發(fā)明適合于處于年齡6個(gè)月至3歲，或年齡3歲至8歲，例如年齡4歲至 8歲，或年齡9歲至17歲的兒童中的兒童使用。因此，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含 來自第一流感病毒毒株的抗原或抗原制劑和水包油乳狀液佐劑的免疫原性組合物，其用于 在年齡6個(gè)月至3歲、或年齡4歲至8歲、或年齡9歲至17歲的主體中，誘導(dǎo)針對(duì)至少一種 第二流感病毒毒株的免疫應(yīng)答，所述第二流感病毒毒株為不同于第一流感病毒毒株的類型 或亞型。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供包含來自第一流感病毒毒株的抗原或抗原制劑和 水包油乳狀液佐劑的免疫原性組合物，其用于在年齡> 3歲的的主體中，誘導(dǎo)針對(duì)至少一 種第二流感病毒毒株的免疫應(yīng)答，所述第二流感病毒毒株是不同于第一流感病毒毒株的類 型或亞型。 再接種和用于再接種的組合物 本發(fā)明的一方面提供了用于為先前接種過用水包油乳狀液佐劑配制的流感免疫原性 組合物的人再接種的流感免疫原性組合物，以及預(yù)防和/或治療流感疾病的方法，其中含 有來自至少一種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑連同水包油乳狀液佐劑的第一免疫原性 組合物首先施用，并且隨后施用含有來自至少一種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑的第二 免疫原性組合物。在本發(fā)明的意義中，術(shù)語"施用第二免疫原性組合物"和"再接種"被視 為同義詞，并會(huì)以可互換的方式使用。
[0063]通常，再接種在第一次接種后至少6個(gè)月進(jìn)行，合適地在之后8至14個(gè)月，合適地 在之后約10至12個(gè)月。
[0064]再接種的免疫原性組合物可以含有任何類型的抗原制劑，或者為滅活的、重組的 或活減毒的。它可以含有如用于第一次接種的免疫原性組合物的相同類型的抗原制劑，即 裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原制劑、完整病毒粒（virion)、純化的HA和NA(亞單位） 疫苗或病毒體（virosome)?？蛇x地，第二組合物可以含有不同于第一次接種使用的另一類 型流感抗原，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原制劑、完整病毒粒、純化的HA和NA(亞 單位）疫苗或病毒體。合適地，使用裂解病毒或完整病毒粒疫苗。
[0065]第二免疫原性組合物可以是佐劑化的或未佐劑化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二免 疫原性組合物是未佐劑化的，并且是含有三種從WHO建議的適當(dāng)流感季節(jié)的毒株制備的滅 活裂解病毒粒抗原的經(jīng)典流感疫苗，例如肌內(nèi)給予的Fluarix? /a-Rix?/Influsplit?。 [0066]在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二免疫原性組合物是佐劑化的，例如用任何上文所述佐 劑佐劑化，例如水包油佐劑。合適地，第二免疫原性組合物含有水包油乳狀液佐劑，特別是 含有可代謝油、任選固醇或生育酚例如α-生育酚、以及乳化劑的水包油乳狀液佐劑。特別 地,所述水包油乳狀液佐劑含有以總體積的0. 5%-20%的量的至少一種可代謝油，并且具有 其中以強(qiáng)度計(jì)至少70%為直徑小于1μπι的油微滴?？蛇x地，第二免疫原性組合物含有明 礬佐劑，或者為氫氧化鋁或磷酸鋁或兩者混合物。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一次接種由如先前所述的大流行性流感組合物進(jìn)行，合適 地為裂解流感組合物，并且再接種如下進(jìn)行。
[0068] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第二免疫原性組合物是含有流感病毒毒株的單 價(jià)流感組合物，所述流感病毒毒株與大流行病相關(guān)或具有與大流行病相關(guān)的潛力。合適的 毒株為但不局限于：冊(cè)附、！19吧、！17階、！12吧、！17附和！1謂1。所述毒株可以與用于第一次 接種的組合物中存在的毒株或其中之一相同。在可選的實(shí)施方案中，所述毒株可能是變體 毒株，即用于第一次接種的組合物中存在的毒株的漂移毒株（driftedstrain)或轉(zhuǎn)變毒株 (shiftedstrain)〇
[0069] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于再接種的第二免疫原性組合物是多價(jià)流感疫 苗。特別地，當(dāng)加強(qiáng)組合物是多價(jià)疫苗例如二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)疫苗時(shí)，至少一種毒株與大流 行病相關(guān)或具有與大流行病相關(guān)的潛力。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在第二免疫原性組合 物中的兩個(gè)或多個(gè)毒株均為大流行毒株。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在第二免疫原性組 合物中的至少一種大流行毒株是與用于第一次接種的組合物中存在的毒株或其中之一相 同類型的。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，至少一種毒株可以是變體毒株，即第一次接種使用的 組合物中存在的至少一種大流行毒株的漂移毒株或轉(zhuǎn)變毒株。
[0070] 合適地，第二免疫原性組合物當(dāng)使用時(shí)在下一次流感季節(jié)給予，例如在第一免疫 原性組合物后約一年。第二免疫原性組合物也可以在隨后的每一年給予(第三、第四、第五 次接種等)。第二免疫原性組合物可以與第一次接種使用的組合物相同。合適地，第二免疫 原性組合物含有這樣的流感病毒或其抗原制劑，其是第一次接種使用的流感病毒的變體毒 株。特別地，流感病毒毒株或抗原制劑根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的參考材料進(jìn)行選擇，使得它 們適合于在再接種年份流行的流感病毒毒株。合適地，第一次接種在大流行宣告時(shí)進(jìn)行，且 再接種于之后進(jìn)行。合適地，再接種用含有流感病毒毒株(例如H5N1Vietnam)的疫苗進(jìn)行， 其是與第一次接種使用的相同的亞型(例如H5N1Vietnam)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，再 接種使用相同亞型的漂移毒株，例如H5N1Indonesia進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，再接種 使用的所述流感病毒毒株是轉(zhuǎn)變毒株，即不同于第一次接種使用的毒株，例如它具有不同 的HA或NA亞型，例如H5N2 (與H5N1相同的HA亞型，但NA亞型不同）或H7N1 (與H5N1 不同的HA亞型但NA亞型相同）。
[0071] 合適地，相比于用未佐劑化的流感病毒或其抗原制劑第一次接種之后誘導(dǎo)的等 同應(yīng)答，再接種誘導(dǎo)以下任一種、合適地兩種或全部：（i)對(duì)流感病毒或其抗原制劑改進(jìn)的 CD4應(yīng)答，或（ii)提升的B細(xì)胞記憶應(yīng)答或（iii)改進(jìn)的體液應(yīng)答。合適地，如本文定義的 用佐劑化的流感病毒或其抗原制劑的再接種后所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，高于用未佐劑化的組合 物的再接種后誘導(dǎo)的相應(yīng)的應(yīng)答。合適地，用未佐劑化的(合適地為裂解的）流感病毒的再 接種后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，在用佐劑化的(合適地為裂解的）流感組合物第一次接種的人群中 高于在用未佐劑化的(合適地為裂解的）流感組合物的第一次接種的人群的相應(yīng)的應(yīng)答。
[0072] 本發(fā)明的佐劑化的組合物相比于由對(duì)照疫苗所賦予的保護(hù)，將能夠誘導(dǎo)針對(duì)漂移 毒株(來自下一個(gè)流感季節(jié)的流感病毒毒株)更好的交叉應(yīng)答性。所述交叉應(yīng)答性相比于用 未佐劑化的制劑獲得的顯示出更高的持續(xù)性。佐劑增強(qiáng)針對(duì)漂移毒株的交叉應(yīng)答性的作用 在大流行病情形下是重要的。
[0073] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及疫苗接種方案，其中第一次疫苗接種用流感 組合物、合適地為裂解流感組合物進(jìn)行，其含有可能潛在地導(dǎo)致大流行病的流感病毒毒株， 并且再接種用單價(jià)或多價(jià)的組合物進(jìn)行，所述組合物含有至少一種正在流行的毒株，或者 為大流行毒株或經(jīng)典毒株，可能地為不同于第一次疫苗接種使用的毒株的亞型或類型的毒 株。
[0074]疫苗接種方法 本發(fā)明的組合物可以通過任何合適的遞送途徑進(jìn)行施用，例如皮內(nèi)、粘膜例如鼻內(nèi)、口 月艮、肌內(nèi)、或皮下。其他遞送途徑在本領(lǐng)域內(nèi)熟知。
[0075] 肌內(nèi)遞送途徑特別合適用于佐劑化的流感組合物。根據(jù)本發(fā)明組合物可能存在 于單一劑量容器中，或可選地，存在于多劑量容器中，特別適合于大流行性疫苗。在此情 況下，可能存在抗微生物防腐劑例如硫柳汞以在使用過程中預(yù)防污染。硫柳汞合適地以 5μg/0. 5ml劑量（即 10μg/ml)或 10μg/0. 5ml劑量（即 20μg/ml)的濃度存 在。合適的IM遞送設(shè)備可能被使用，例如無針液體快速注射設(shè)備，例如Biojector2000 (Bioject,Portland, 0R)?？蛇x地，筆式注射器設(shè)備，例如用于家用遞送腎上腺素的設(shè)備， 可以用于允許疫苗的自助施用。此類遞送設(shè)備的使用可能特別適用于例如在大流行病期間 會(huì)需要的大規(guī)模的免疫活動(dòng)。
[0076] 皮內(nèi)遞送是另一種合適的途徑。任何合適的設(shè)備可能用于皮內(nèi)遞送，例如短針設(shè) 備。此類設(shè)備在本領(lǐng)域內(nèi)熟知。皮內(nèi)疫苗也可以通過限制針頭進(jìn)入皮膚的有效穿透長度的 設(shè)備施用，例如在W099/34850和EP1092444中描述的那些，其通過引用并入本文，及其功 能等同方案。同樣合適的是這樣的快速注射設(shè)備，其通過液體快速注射器或通過針頭(其刺 穿角質(zhì)層并產(chǎn)生到達(dá)真皮的射流)來遞送液體疫苗到真皮。同樣合適的是彈道粉末/顆粒遞 送設(shè)備（ballisticpowder/particledeliverydevice),其使用壓縮氣體加速粉末形式 的疫苗經(jīng)皮膚外層到達(dá)真皮。此外，常規(guī)的注射器可以用于皮內(nèi)施用的經(jīng)典芒圖（mantoux) 方法。
[0077] 另一種合適的施用途徑是皮下途徑。任何合適設(shè)備可以用于皮下遞送，例如經(jīng)典 的針。合適地，無針快速注射器裝置可以使用。此類設(shè)備在本領(lǐng)域中熟知。合適地，所述設(shè) 備預(yù)填充有液體疫苗制劑。
[0078] 可選地，鼻內(nèi)施用疫苗。通常，疫苗局部施用于鼻咽區(qū)域，合適地不被吸入肺中。期 望使用遞送疫苗制劑至鼻咽區(qū)域而不會(huì)或基本上不會(huì)進(jìn)入肺中的鼻內(nèi)遞送設(shè)備。
[0079] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗的合適的鼻內(nèi)施用設(shè)備是噴霧設(shè)備。合適的可商購的鼻腔噴霧 設(shè)備包括Accuspray?(BectonDickinson)。噴霧器產(chǎn)生極細(xì)的噴霧，所述噴霧能容易地 吸入肺部并因此不能有效到達(dá)鼻粘膜。因此噴霧器不是優(yōu)選的。
[0080] 合適的用于鼻內(nèi)使用的噴霧設(shè)備是設(shè)備性能不取決于由使用者施加的壓力的設(shè) 備。這些設(shè)備被稱為壓力閥值設(shè)備。只有當(dāng)施加閥值壓力時(shí)液體才會(huì)從噴嘴釋放。這些設(shè) 備能夠更容易實(shí)現(xiàn)微滴大小規(guī)則的噴霧。本發(fā)明合適使用的壓力閥值設(shè)備是本領(lǐng)域內(nèi)已知 的，并在例如WO91/13281和EP311 863B和EP516 636中描述，其通過引用并入本 文。此類設(shè)備可從PfeifferGmbH商購，并同樣在Bommer,R.PharmaceuticalTechnology Europe, 1999年9月中被描述。
[0081] 合適的鼻內(nèi)設(shè)備產(chǎn)生范圍在1至200μm，合適地為10至120μm的微滴(使用水作 為液體測(cè)量)。低于10μm會(huì)有吸入的風(fēng)險(xiǎn)，因此期望具有不多于約5%的微滴低于10μm。 大于120μm的微滴不能像較小的微滴一樣擴(kuò)散，因此期望具有不多于約5%的微滴超過 120μm〇
[0082] 可選地，表皮或經(jīng)皮的疫苗接種途徑也考慮在本發(fā)明中。
[0083] 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，用于第一次接種的佐劑化的免疫原性組合物可以肌內(nèi)給 予，且加強(qiáng)組合物，無論是否佐劑化，可以通過不同的途徑施用，例如皮內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)。在 一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于第一次施用的組合物含有對(duì)于大流行性流感病毒毒株少于 15μg的HA量，并且加強(qiáng)組合物可以含有15μg的標(biāo)準(zhǔn)量，或者，合適地HA的低量即低于 15μg(這取決于施用的途徑）可以以較小的體積給予。
[0084]疫苗接種方案、劑量和療效標(biāo)準(zhǔn) 合適地，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原性組合物在大多數(shù)情況下標(biāo)準(zhǔn)的〇. 5ml可注射劑 量，并含有15μg或更少的來自流感病毒毒株的血細(xì)胞凝集素抗原組分，如通過單向輻射 狀免疫擴(kuò)散（SRD)所測(cè)量的（J·MWood等人：J.Biol.Stand5 (1977) 237-247;J. M.Wood等人，J.Biol.Stand. 9 (1981) 317-330)。合適地，疫苗劑量體積會(huì)在 0.5ml 至Iml之間，特別是標(biāo)準(zhǔn)的0. 5ml或0. 7ml疫苗劑量體積。對(duì)劑量體積的輕微改變將取決 于在原始整裝樣本中的HA濃度并還取決于遞送途徑(其中更小劑量通過鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑 給予）來常規(guī)進(jìn)行。
[0085] 合適地，根據(jù)本發(fā)明使用的所述免疫原性組合物含有低的HA抗原量一例如每流 感病毒毒株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14yg的HA或每毒株不超過15yg的HA 的任一種。HA量的所述低量可以低至實(shí)際可行的量，只要這允許配制效力符合國際例如EU 或FDA標(biāo)準(zhǔn)的疫苗,如下文詳述(參見表1和如所述的具體參數(shù))。合適的HA低量為每流感 病毒毒株1至7. 5μg的HA,合適地為每流感病毒毒株3. 5至5μg諸如3. 75或3. 8μg 的HA，典型地為每流感病毒毒株約5μg的HA。另一合適的HA量為每流感病毒毒株0. 1至 5μg的HA，合適地為每流感病毒毒株1. 0至2μg的HA如每流感病毒毒株1. 9μg的HA。
[0086] 有利地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗劑量，特別是低HA量的疫苗，可以以較常規(guī)注射的裂 解流感疫苗更小的體積提供，其通常為每劑量約〇.5、0.7或Iml。根據(jù)本發(fā)明的低體積劑 量合適地每劑量低于500μ1，通常低于300μ1并且合適地不多于約200μ1或更少。 [0087] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的合適的低體積疫苗劑量為在低體積中具有低抗原 劑量的劑量，例如在約200μ1的體積中約15μg或約7. 5μgHA或約3. 0μgΗΑ(每毒株)。 [0088] 本發(fā)明的流感藥劑合適地符合疫苗的某一國際標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用國際標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)量流感疫 苗的效力。血清學(xué)變量根據(jù)評(píng)價(jià)人使用的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品的歐洲機(jī)構(gòu)（EuropeanAgencyforthe EvaluationofMedicinalProductsforhumanuse)(CHMP/BWP/214/96,Committeefor ProprietaryMedicinalProducts(CPMP).Noteforharmonizationofrequirements /br 1997.CHMP/BWP/214/96circularN。96-0666: 1-22)對(duì)于 與流感疫苗的年度許可程序相關(guān)的臨床試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)(表1)。要求對(duì)于成年人群（18-60歲） 和老年人群（>60歲）不同(表1)。對(duì)于大流行之間的流感疫苗，對(duì)于疫苗中所包含的所有 流感毒株，至少一種評(píng)估(血清轉(zhuǎn)化因子、血清轉(zhuǎn)化率、血清保護(hù)率）應(yīng)當(dāng)達(dá)到歐洲要求。等 于或大于1:40的滴度比例被視為最相關(guān)，因?yàn)槠谕@些滴度與保護(hù)最為相關(guān)[BeyerW等 人 1998.ClinDrugInvest. ;15: 1-12]。
[0089] 如〃Guidelineondossierstructureandcontentforpandemicinfluenza vaccinemarketingauthorisationapplication. (CHMP/VEG/4717/03, 2004 年 4 月 5 日）中指出的，在缺少對(duì)源自非流行毒株的流感疫苗的特定標(biāo)準(zhǔn)的情況下，期望大流行性 候選疫苗應(yīng)當(dāng)（至少）在兩次劑量的疫苗后在未引發(fā)的成年人或老年人主體中，能夠引起足 夠的免疫應(yīng)答以合適地達(dá)到為現(xiàn)有疫苗設(shè)立的所有三種現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。
[0090] 根據(jù)本發(fā)明使用的組合物合適地達(dá)到至少一種對(duì)于組合物中包含的流感病毒毒 株的此類標(biāo)準(zhǔn)(一種標(biāo)準(zhǔn)足夠獲得批準(zhǔn))，合適地至少兩種，或通常至少在表1中所述的所有 三種保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)。
[0091] 表I(CHMP標(biāo)準(zhǔn)） !

【權(quán)利要求】
1. 免疫原性組合物，其包含來自第一流感病毒毒株的抗原或抗原制劑和水包油乳狀液 佐劑，用于誘導(dǎo)針對(duì)至少一種第二流感病毒毒株的免疫應(yīng)答，其中所述第二流感病毒毒株 來自與所述第一流感病毒毒株不同的類型或不同的亞型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述第一流感病毒毒株是甲型，諸如H1例 如 H1N1、H2、H5 例如 H5N1、H7 或 H9。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述第一流感病毒毒株是乙型。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物包含來自多種流感 病毒毒株的抗原或抗原制劑。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述第二流感病毒毒株是甲型 或乙型。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述使用用于誘導(dǎo)針對(duì)多種流 感病毒毒株，任選包括來自與所述第一流感病毒毒株不同的亞型或不同的類型的多種流感 病毒毒株的免疫應(yīng)答。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述使用用于誘導(dǎo)針對(duì)以下的 一種、兩種、三種或全部的免疫應(yīng)答：A/H1N1毒株、A/H3N2毒株、Yagamata系的乙型毒株和 Victoria系的乙型毒株。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答持續(xù)至少6個(gè) 月。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述抗原是血細(xì)胞凝集素，任 選以每劑量小于15微克諸如3. 75至10微克的量。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述抗原或抗原制劑來源于 細(xì)胞培養(yǎng)物或產(chǎn)生于胚胎蛋中。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述抗原或抗原制劑是純化 的完整流感病毒、非活的流感病毒，諸如裂解流感病毒或亞單位流感病毒。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-3和5-11中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物是單價(jià)的， 任選包含與大流行病相關(guān)的或具有與大流行病相關(guān)的潛力的毒株。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物是多價(jià)的，任選 包含與大流行病相關(guān)的或具有與大流行病相關(guān)的潛力的毒株。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述水包油乳狀液包含可代 謝油諸如鯊烯，和乳化劑諸如聚山梨醇酯80。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的免疫原性組合物，其中所述水包油乳狀液進(jìn)一步包含α-生育 酚。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述使用用于人主體，諸如兒 童或青少年主體，例如年齡為6個(gè)月至3歲、或年齡為4歲至8歲、或年齡為9至17歲的主 體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其中所述使用用于年齡> 3歲的主體。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中將所述免疫原性組合物腸道 外施用，例如肌內(nèi)施用。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物根據(jù)一 次或兩次劑量方案施用，任選具有21至28天的間隔。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述免疫應(yīng)答涉及交叉反應(yīng) 性CD4 T輔助細(xì)胞應(yīng)答和/或交叉反應(yīng)性體液免疫應(yīng)答。
21. 第二免疫原性組合物，其包含來自至少一種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑，用于 根據(jù)一次劑量方案在兒童主體中使用，所述兒童主體之前已經(jīng)接種有包含來自至少一種流 感病毒毒株的抗原或抗原制劑和水包油乳狀液佐劑的第一免疫原性組合物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的第二免疫原性組合物和第一免疫原性組合物，其中所述第二免 疫原性組合物的至少一種流感病毒毒株是不同于所述第一免疫原性組合物的至少一種流 感病毒毒株的類型或亞型。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的第二免疫原性組合物，其中所述組合物是未佐劑 化的。
24. 根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)的第二免疫原性組合物，其中所述組合物是包含兩 種不同亞型的甲型流感病毒毒株和一種乙型流感病毒毒株的三價(jià)組合物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求21至24中任一項(xiàng)的第二免疫原性組合物，其中所述兒童主體的年齡 為6個(gè)月至3歲，或年齡為4歲至8歲。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的第二免疫原性組合物，其中所述兒童主體的年齡> 3歲。
27. 根據(jù)權(quán)利要求21至26中任一項(xiàng)的第二免疫原性組合物，其中所述兒童主體在施用 所述第二免疫原性組合物之前一年已經(jīng)接種有所述第一免疫原性組合物。
28. 免疫原性組合物，其包含來自第一流感病毒毒株的抗原或抗原制劑和水包油乳狀 液佐劑，用于治療或預(yù)防由第二流感病毒毒株引起的疾病，其中所述第二流感病毒毒株來 自與所述第一流感病毒毒株不同的亞型或不同的類型。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求2至20的一種或多種特征。
30. 預(yù)防和/或治療流感疾病的方法，其包括施用包含來自至少一種流感病毒毒株的 抗原或抗原制劑連同水包油乳狀液佐劑的第一免疫原性組合物，隨后施用包含來自至少一 種流感病毒毒株的抗原或抗原制劑的第二免疫原性組合物，其中施用所述第一免疫原性組 合物誘導(dǎo)針對(duì)包含在所述第二免疫原性組合物中但不存在于所述第一免疫原性組合物中 的流感病毒毒株的免疫應(yīng)答。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第一免疫原性組合物的至少一種流感病毒毒株 和所述第二免疫原性組合物的至少一種流感病毒毒株是不同的類型或亞型。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述第一免疫原性組合物的至少一種流感病毒毒株 是甲型，并且所述第二免疫原性組合物的至少一種流感病毒毒株是乙型。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述第二免疫原性組合物進(jìn)一步包含不同于引發(fā)組 合物中包含的甲型流感病毒毒株的亞型的甲型流感病毒毒株。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30至33中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二免疫原性組合物在引發(fā)組合 物之后一年施用。
35. 根據(jù)權(quán)利要求30至34中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一免疫原性組合物根據(jù)一次劑 量方案施用。
36. 根據(jù)權(quán)利要求30至35中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二免疫原性組合物根據(jù)一次劑 量方案施用。
【文檔編號(hào)】A61K39/145GK104302318SQ201380026802
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月23日
【發(fā)明者】B.L.因尼斯, S.羅伊-格漢塔 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司