結(jié)合銅綠假單胞菌pcrv的單可變結(jié)構(gòu)域抗體的制作方法

結(jié)合銅綠假單胞菌pcrv的單可變結(jié)構(gòu)域抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠顯著抑制和/或中和銅綠假單胞菌(P?aeruginosa)的多肽。所述多肽包含兩種以上針對銅綠假單胞菌的PcrV蛋白的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中“第一”免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和“第二”免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有不同的互補位。
【專利說明】結(jié)合銅綠假單胞菌PCRV的單可變結(jié)構(gòu)域抗體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及結(jié)合銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)的PcrV蛋白的多肽。 更具體地，本發(fā)明涉及結(jié)合PcrV并且中和銅綠假單胞菌的多互補位多肽（在本發(fā)明中還稱 為"本發(fā)明的多互補位多肽"）。本發(fā)明還涉及用作制備本發(fā)明的多互補位多肽的結(jié)構(gòu)單元 的單價多肽（在本發(fā)明中還稱為"本發(fā)明的單價多肽"）。
[0002] 本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的核酸（在本發(fā)明中還稱為"本發(fā)明的核酸"）；涉及 制備所述多肽的方法；涉及表達(dá)或能夠表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞；涉及包括所述多肽、核 酸和/或宿主細(xì)胞的組合物，特別是藥物組合物；并且涉及多肽、核酸、宿主細(xì)胞和/或組 合物的應(yīng)用，特別是用于預(yù)防和/或治療目的，如本發(fā)明所提及的預(yù)防和/或治療目的的應(yīng) 用。
[0003] 本發(fā)明的其他方面、實施方案、優(yōu)點和應(yīng)用將從本發(fā)明的進一步描述中變得清楚。

【背景技術(shù)】
[0004] 銅綠假單胞菌是一種與人類中的廣譜感染相關(guān)的環(huán)境革蘭氏陰性細(xì)菌。其具有代 謝上非常靈活的非常龐大的基因組，這解釋了為何其可以存在于非常多樣化的環(huán)境中。這 種機會性病原體能夠通過III型分泌系統(tǒng)（TTSS)遞送外毒素而引起急性肺損傷和死亡。
[0005] 銅綠假單胞菌（P. aeruginosa)的III型分泌系統(tǒng)（TTSS)是穿過完整細(xì)胞壁的復(fù) 雜的多蛋白結(jié)構(gòu)。其是僅分泌TTSS蛋白和致病性相關(guān)的毒素的特化的中空針樣分子結(jié)構(gòu)。 許多不同的蛋白形成TTSS，在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)一側(cè)和外部都形成。在外部，只有單一的'桶狀' 同聚物形成蛋白和'針尖'蛋白是抗體可及的。認(rèn)為針狀蛋白PcrV在針尖上形成環(huán)型結(jié)構(gòu)。 TTSS復(fù)合物可以將由細(xì)菌產(chǎn)生的多種外毒素直接注射到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
[0006] 由于事實上表達(dá)TTSS而非毒素的突變體也是細(xì)胞毒性的，所以，該易位裝置 在發(fā)病機制中的參與可能不限于轉(zhuǎn)運外毒素（Lee等.Infect. Immun.(傳染病免疫 學(xué)）73:1695-1705, 2005)。易位孔本身足以引起宿主細(xì)胞死亡，其通過孔介導(dǎo)的膜滲透性增 加直接引起，或通過激活廣泛的細(xì)胞防御反應(yīng)而間接引起。細(xì)菌外表面上的TTSS毒力機制 允許銅綠假單胞菌通過殺死白血細(xì)胞和表皮細(xì)胞和引發(fā)組織損傷性炎癥而避開人免疫防 御。
[0007] 在正常情形下，細(xì)菌是完全無害的。然而，在特定情形下，細(xì)菌可以在免疫系統(tǒng) 減弱的宿主中定殖。認(rèn)為其是與免疫受損的和有免疫能力的患者中的侵入性裝置、機械 通氣、燒傷或外科手術(shù)相關(guān)的醫(yī)院菌血癥（nosocomial bacteremia)和感染的主要原因 (Giamarellou 和 Kanellakopoulou Crit. Care Clin. 24:261-278, 2008)，所述患者如骨髓 移植患者（Velasco 等· Clin. Microbiol. Infect.(臨床微生物感染）10:542-549, 2004)。 銅綠假單胞菌典型地引起肺道、尿道、（燒傷）傷口的醫(yī)院感染以及敗血癥（S印sis)。
[0008] 在囊性纖維化（Cystic Fibrosis, CF)患者中，銅綠假單胞菌感染按照在低齡兒 童中充分建立的復(fù)發(fā)性肺部感染的模式，這在較大的CF患者中導(dǎo)致慢性感染的建立，在該 情形中，其是導(dǎo)致呼吸衰竭的肺功能進展性減退和疾病惡化的主要促成因素 （FitzSimmons J.Pediatr. 122:1-9, 1993 ;Kerem 等.J.Pediatr. 116: 714-719, 1990 ;Lyczak 等.Clin. Microb. Rev.(臨床微生物學(xué)綜述）15:194-222, 2002)。一旦建立慢性銅綠假單胞菌肺 部感染，則利用現(xiàn)有治療法根除該生物體似乎是不可能的（Lee Chronic Respiratory Disease (慢性呼吸道疾病）6:99-107, 2009)。
[0009] 銅綠假單胞菌在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease， C0PD)的建立中具有一些不同的表現(xiàn)。該生物體是這樣的定殖菌落：其被快速清除，引起急 性惡化，并且在患有C0PD的成年人亞群中還可以引起慢性感染（Murphy Curr. Opin. Pulm. Med.(肺部醫(yī)學(xué)現(xiàn)代觀點）15:138-142, 2009)。
[0010] Giamarellou 和 Kanellakopoulou(Crit. Care Clin. 24:261-278, 2008)，Malcolm 和 Heim(Curr. Opin. Pharmacol.(藥理學(xué)當(dāng)前觀點）9:558-565, 2009)，El Solh 和 Alhajhusain (J. Antimicrobial Chemotherapy (抗微生物化療雜志）64:229-238, 2009) 以及 Roux 和 Ricard(Infectious Disorders - Drug Targets(傳染病癥-藥物革巴 標(biāo)）11:389-394, 2011)給出了關(guān)于當(dāng)前銅綠假單胞菌肺炎治療的良好的綜述。當(dāng)前用于 患者的治療仍然依賴于抗生素。四種主要結(jié)構(gòu)種類的抗生素用于針對銅綠假單胞菌感染 (Giamarellou 和 Kanellakopoulou Crit. Care Clin. 24:261-278, 2008)。重要的是，一旦 已經(jīng)建立銅綠假單胞菌定殖群集，則由于生物膜形成的原因，使用抗生素不可能成功地將 其清除。生物膜限制某些抗生素進入膜的較深層（擴散限制性）。更重要的是，生物膜的較 深層包含許多銅綠假單胞菌細(xì)菌，所述銅綠假單胞菌細(xì)菌是活的，但是由于缺少營養(yǎng)物進 入幾乎完全沒有活性。不同種類的抗生素作用于細(xì)胞分裂或高活性代謝途徑，因此不能殺 死這些休眠的細(xì)菌。一旦治療倒退或停止，這些細(xì)胞就迅速地重新在患者中定殖。
[0011] 此外，銅綠假單胞菌具有逃避新抗微生物療法并且發(fā)展抗性的能力，一方面針對 多種藥物是固有抗性的，另一方面通過多種機制快速獲得抗性（Malcolm和Heim Curr. Opin. Pharmacol.(現(xiàn)代藥理學(xué)觀點）9:558-565, 2009)。由于銅綠假單胞菌基因組的多樣 性和大的尺寸，所以可能同時存在多種抗性機制，引起針對一些抗假單胞菌藥劑的交叉抗 性（Giamarellou 和 Kanellakopoulou Crit. Care Clin. 24:261-278, 2008)。正在開發(fā)基于 相同基本抗生素結(jié)構(gòu)的新型變體，并且其可以在某種程度上減輕目前的抗性，但是當(dāng)廣泛 臨床應(yīng)用時非?？赡芤鹦碌目剐?。已知沒有新種類的抗生素進行臨床開發(fā)。由于新種類 抗生素的開發(fā)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于我們對此類藥物的日益增長的需求，所以我們正面臨著具有有限 的抗擊這些感染的能力的抗生素后時代（post-antibiotic era)。
[0012] 已有抗生素的局部給藥（例如，妥布霉素（tobramycin)或多黏菌素 E(colistin)的氣霧劑給藥）已經(jīng)用于遞送更高局部濃度的抗生素，而不需要使患者 暴露于可能對所述患者有毒性的高系統(tǒng)水平（Luyt等.Curr. Opin. Infect. Dis.(現(xiàn)代 傳染病觀點）22:154-158, 2009)。然而，關(guān)于其功效以及潛在的抗性的出現(xiàn)引起持續(xù) 的關(guān)注（El Solh 和 Alhajhusain J. Antimicrobial Chemotherapy (抗微生物化療雜 志）64:229-238,2009 ;Roux 和 Ricard Infectious Disorders-Drug Targets(傳染病 癥-藥物靶標(biāo)）11:389-394, 2011)。
[0013] 隨著新抗微生物藥劑渠道的日漸干涸，銅綠假單胞菌的治療持續(xù)依賴于組合療法 的理論優(yōu)點和先前由于嚴(yán)重的毒性棄之不用的舊藥（如多黏菌素（polymyxin))的再度 使用（Giamarellou 和 Kanellakopoulou Crit. Care Clin. 24:261-278, 2008 ;E1 Solh 和 Alhajhusain J. Antimicrobial Chemotherapy (抗微生物化療雜志）64:229-238, 2009)。 然而，隨著非常令人煩惱的最新的抗性率和具有多藥抗性或甚至泛抗性表型的假單胞菌 菌屬（Pseudomonas)菌株的出現(xiàn)，迅速出現(xiàn)了針對這樣的治療的抗性（Malcolm和Heim Curr. Opin. Pharmacol.(藥理學(xué)現(xiàn)代觀點）9:558-565, 2009)?；趫蟮赖目剐员O(jiān)視數(shù)據(jù)， 明顯的是，當(dāng)前用于銅綠假單胞菌感染的治療方法正日益接近其極限（Giamarellou和 Kanellakopoulou Crit. Care Clin. 24:261-278, 2008)〇
[0014] 目前市場上尚沒有基于非抗生素的治療。然而，有多種候選藥正在開發(fā)中。
[0015] 已經(jīng)描述了各種單克隆抗體，其主要針對銅綠假單胞菌鞭毛蛋白或菌株特異性的 LPS。大部分沒有進入臨床階段。一種LPS-反應(yīng)性IgM(Kenta(Berna/Crucell)被列為處 于活性II期研發(fā)過程中。然而，該抗體的血清型特異性強調(diào)了對于在醫(yī)院設(shè)置中確定傳染 劑的血清型的快速測定和開發(fā)特異性針對其他臨床相關(guān)的血清型的抗體的需求（Roux和 Ricard Infectious Disorders-Drug Targets (傳染病癥-藥物祀標(biāo)）11:389-394, 2011)。
[0016] Frank 等·（J. Infect. Dis.(傳染病雜志）186:64-73, 2002)和 Faure 等（J. Immune based Therapies and Vaccines (基于免疫的治療和疫苗雜志）1:2,2003)已經(jīng)描述了在 小鼠和大鼠假單胞菌菌屬感染模型中具有有效的中和活性的小鼠單克隆抗-PcrV抗體，單 克隆抗體（Mab) 166。W0 2009/073631A2 和 Baer 等·（Infection and Immunity (感染和免 疫性）77:1083-1090)描述了 一些改造的對銅綠假單胞菌PcrV蛋白特異性的人抗體Fab片 段（其中有FablA8)，并且其與MAbl66競爭結(jié)合PcrV上的相同表位。這些Fabs表現(xiàn)出有 力的針對銅綠假單胞菌III型分泌系統(tǒng)的中和活性。KB001(KaloBios，US)是Humaneered? 抗-PcrV PEG 化的抗體 Fab' 片段（Anti-PcrV Program Fact Sheet, KaloBios)，其在細(xì)胞 的細(xì)胞毒性測定中顯示出有力的III型分泌系統(tǒng)（TTSS)中和活性。正在開發(fā)KB001用于預(yù) 防Pa通風(fēng)器相關(guān)性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP)和用于治療CF。初步 的活性和安全性證據(jù)已在KaloBios進行的1/2期試驗中在兩種適應(yīng)證中得到證實。然而， 其仍然需要確定當(dāng)施用給患者時針對這種單特異性單克隆抗體是否會發(fā)展逃逸突變體。
[0017] 綜上所述，特定類型的感染中增加的發(fā)病率、醫(yī)院中侵入性裝置的增加的使用以 及多抗性假單胞菌菌屬菌株增加的頻率已經(jīng)明顯地導(dǎo)致用于醫(yī)院假單胞菌菌屬感染的治 療選擇的匱乏。盡管有上述嘗試，但是銅綠假單胞菌感染的管理對于危重患者醫(yī)療醫(yī)師來 說代表著困難的治療挑戰(zhàn)（El Solh 和 Alhajhusain J. Antimicrobial Chemotherapy (抗 微生物化療雜志）64:229-238, 2009)。對于具有多藥抗性菌株的患者，存在非常少的臨 床選擇。因此，認(rèn)為發(fā)現(xiàn)并開發(fā)新型抗假單胞菌菌屬的藥物來填補臨床醫(yī)生的抗菌醫(yī) 療設(shè)備的危險空缺是急需的（Malcolm和Heim Curr.Opin. Pharmacol.(現(xiàn)代藥理學(xué)觀 點）9:558-565, 2009)。
[0018] 發(fā)明概述
[0019] 本發(fā)明提供與現(xiàn)有技術(shù)氨基酸序列和抗體相比，除具有其他有利特性（諸如例 如，改善的制備容易性、良好的穩(wěn)定性和/或減少的商品成本）外還具有改善的預(yù)防、治療 和/或藥理學(xué)特性的多肽。更具體地，本發(fā)明提供包含兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 的多價多肽，與現(xiàn)有技術(shù)中所述的PcrV中和分子相比，其表現(xiàn)出改善的中和PcrV的特性。 本發(fā)明人令人 1驚訝地觀察到，與單價PcrV-結(jié)合結(jié)構(gòu)單元單獨的PcrV中和能力相比，包含 兩種不同的PcrV-結(jié)合免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的二互補位多肽表現(xiàn)出PcrV-中和功效的 顯著增加。對于這一目的，本發(fā)明另外還使得特異性結(jié)合PcrV和/或能夠顯著抑制或中 和PcrV的多種高度有利的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（即，單價多肽）成為可用的。這些 PcrV-結(jié)合免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和包含其的多肽形成本發(fā)明的其他方面。
[0020] 因此，本發(fā)明提供包含兩種以上特異性結(jié)合銅綠假單胞菌的PcrV蛋白（本文稱 為"PcrV"）的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩種以上特異性結(jié)合銅綠假單胞菌的 PcrV蛋白（本文稱為"PcrV"）的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的多肽。所述多肽在本文 中還稱為"本發(fā)明的多價多肽"。所述兩種以上的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以任選地通過 一種或多種膚接頭連接。
[0021] 優(yōu)選地，多肽多肽包含兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中"第 一"針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和"第二"針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 具有不同的互補位。所述多肽在本文中還稱為"本發(fā)明的多互補位多肽"。因此，本發(fā)明涉及 包含兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或由兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域組成的多肽，其中"第一"針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和"第二"針 對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有不同的互補位。所述多肽包含兩種以上針對PcrV 上不同表位的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或由兩種以上針對PcrV上不同表位的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域組成。更具體地，所述多肽包含至少一種針對PcrV上第一表位的"第一"免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和至少一種針對不同于PcrV上第一表位的PcrV上第二表位的"第 二"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，本發(fā)明的這些多互補位多肽是二互補位的或三互補 位的多肽（在本發(fā)明中還稱為"本發(fā)明的二互補位多肽"和"本發(fā)明的三互補位多肽"），如 本文進一步所定義。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)中所述的PcrV中和分子相比，本文所述的多互補位（如二互補位或三 互補位）多肽表現(xiàn)出改善的中和PcrV的特性。本發(fā)明的多互補位（諸如二互補位或三互補 位）多肽在細(xì)胞毒性測定中（諸如例如，在使用Μ0Ι為12的P3X63細(xì)胞作為靶標(biāo)的細(xì)胞毒 性測定中）能夠以100%的功效中和PcrV。除此之外和/或另外，本發(fā)明的多互補位（諸 如二互補位或三互補位）多肽在細(xì)胞毒性測定中（諸如例如，在使用Μ0Ι為12的P3X63細(xì) 胞作為靶標(biāo)的細(xì)胞毒性測定中）能夠以5. OxlO-lOM以下的IC50中和PcrV。除此之外和/ 或另外，在存在銅綠假單胞菌彈性蛋白酶（3ug/ug多肽）時，本發(fā)明的多互補位（諸如二互 補位或三互補位）多肽在24小時后具有最大5倍（例如，5倍、3倍、2倍或以下）的效力減 少。除此之外和/或另外，在存在人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（l-2ug/ug多肽）時，本發(fā)明 的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽在24小時后具有最大15倍（例如，10倍、5 倍、3倍、2倍或以下）的效力減少。
[0023] 本發(fā)明優(yōu)選的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽包含兩種以上免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中至少一種免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為 ⑶R1-⑶R3)組成，其中（見表A-6):
[0024] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0025] a) SEQ ID NOs: 20-37 的氨基酸序列；
[0026] b)與SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0027] c)與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0028] 和 / 或
[0029] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0030] d)SEQ ID NOs :38-56 的氨基酸序列；
[0031] e)與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0032] f)與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0033] 和 / 或
[0034] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0035] g)SEQ ID NOs :57-75 的氨基酸序列；
[0036] h)與SEQ ID N0s:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0037] i)與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0038] 更具體地，本發(fā)明的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽包含兩種以上免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中至少一種 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為 ⑶R1-⑶R3)組成，其中：
[0039] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0040] a) SEQ ID NOs :20-37 的氨基酸序列；
[0041] b)與SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0042] c)與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0043] 和
[0044] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0045] d)SEQ ID NOs :38-56 的氨基酸序列；
[0046] e)與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0047] f)與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0048] 和
[0049] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0050] g)SEQ ID NOs :57-75 的氨基酸序列；
[0051] h)與SEQ ID N0s:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0052] i)與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0053] 本發(fā)明優(yōu)選的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽包含兩種以上免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中，在至少一種所 述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中，CDR序列與具有SEQ ID N0s:l-19的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域中至少一種的⑶R序列（表A-4)具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨 基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多，或甚至 基本上100%的氨基酸同一性。
[0054] 在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽包含 兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其 中至少一種所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs :1-19的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-19 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
[0055] 在一個優(yōu)選的方面中，在本發(fā)明的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽中 存在的所述兩種以上的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的每一種如上文定義。本發(fā)明的多互補 位（諸如二互補位或三互補位）多肽的實例是SEQ ID N0sll8-151(表A-5)。
[0056] 在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽的兩 種以上的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的每一種（其針對PcrV)屬于不同的表位庫（epitope bin)。因此，本發(fā)明涉及包含兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩 種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的多肽，其中所述兩種以上針對PcrV的 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的每一種屬于不同的表位庫。通過定義，屬于不同表位庫的免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域彼此不交叉競爭與靶標(biāo)PcrV的結(jié)合。因此，本發(fā)明涉及包含兩種以 上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域組成的多肽，其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域不交叉阻斷第二免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合，和/或其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合不被第 二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷。
[0057] 在本發(fā)明的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽中存在的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選的組合可以包括下述的任一種：
[0058] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位 庫2]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種交叉阻斷；
[0059] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表 位庫3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種交叉阻斷；
[0060] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs :1-2的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1] 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 3-10的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種交叉阻斷；
[0061] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫 3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種交叉阻斷；
[0062] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs :11-12的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種交叉阻斷；并且第二 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表 位庫1]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :3-10的 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種交叉阻斷；或
[0063] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs :11-12的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種交叉阻斷；并且第二 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表 位庫2]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種交叉阻斷。
[0064] 本發(fā)明優(yōu)選的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽可以包含下述免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域的組合中的一種或基本上由下述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組合中的一 種組成：
[0065]-第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫1的多肽，并且選自下述任一種：
[0066] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 4 (SEQ ID N0:202)和嵌合體6 (SEQ ID N0:204)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% ) 或沒有結(jié)合；
[0067] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同 一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0068] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3_10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0069] 〇是SEQ ID N0s:3_10中的任一種的多肽；
[0070] 并且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫2的多肽，并且選自下述任一 種：
[0071] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV(SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 7 (SEQ ID N0:205)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0072] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一 性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100% 的氨基酸同一'I"生；
[0073] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0074] 〇是SEQ ID NOs: 1和2中的任一種的多肽；
[0075] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫1的多肽，并且選自下述任一種：
[0076] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 4 (SEQ ID N0:202)和嵌合體6 (SEQ ID N0:204)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% ) 或沒有結(jié)合；
[0077] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同 一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0078] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0079] 〇是SEQ ID N0s:3_10中的任一種的多肽；
[0080] 并且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫3的多肽，并且選自下述任一 種：
[0081] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 2 (SEQ ID N0:200)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0082] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸 同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0083] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0084] 〇是SEQ ID NOs: 11和12中的任一種的多肽；
[0085] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫2的多肽，并且選自下述任一種：
[0086] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 7 (SEQ ID N0:205)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0087] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一 性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100% 的氨基酸同一'I"生；
[0088] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0089] 〇是SEQ ID NOs: 1和2中的任一種的多肽；
[0090] 并且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫1的多肽，并且選自下述任一 種：
[0091] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 4 (SEQ ID N0:202)和嵌合體6 (SEQ ID N0:204)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90%) 或沒有結(jié)合；
[0092] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同 一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0093] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3_10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其被與PcrV的結(jié)合具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0094] 〇是SEQ ID N0s:3_10中的任一種的多肽；
[0095]-第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫2的多肽，并且選自下述任一種：
[0096] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 7 (SEQ ID N0:205)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0097] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一 性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100% 的氨基酸同一'I"生；
[0098] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0099] 〇是SEQ ID NOs: 1和2中的任一種的多肽；
[0100] 并且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫3的多肽，并且選自下述任一 種：
[0101] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 2 (SEQ ID N0:200)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0102] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸 同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0103] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0104] 〇是SEQ ID N0s:ll和12中的任一種的多肽；
[0105] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫3的多肽，并且選自下述任一種：
[0106] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 2 (SEQ ID N0:200)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0107] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸 同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95 %的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0108] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0109] 〇是SEQ ID N0s:ll和12中的任一種的多肽；
[0110] 并且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫1的多肽，并且選自下述任一 種：
[0111] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 4 (SEQ ID N0:202)和嵌合體6 (SEQ ID N0:204)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% ) 或沒有結(jié)合；
[0112] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同 一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0113] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0114] 〇是SEQ ID N0s:3_10中的任一種的多肽；或者
[0115] -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫3的多肽，并且選自下述任一種：
[0116] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 2 (SEQ ID N0:200)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90%)或沒有結(jié)合；
[0117] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸 同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0118] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0119] 〇是SEQ ID N0s:ll和12中的任一種的多肽；
[0120] 第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫2的多肽，并且選自下述任一種：
[0121] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV(SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 7 (SEQ ID N0:205)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0122] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一 性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100% 的氨基酸同一'I"生；
[0123] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0124] 〇是SEQ ID NOs: 1和2中的任一種的多肽。
[0125] 本發(fā)明優(yōu)選的多肽選自SEQ ID NOs: 124-141(表A-5)中的任一種。
[0126] 在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及上文定義的多肽，其中第一免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域為SEQ ID N0:12。在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及一種多肽，其中第二免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID N0s:l和10中的任一種。在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉 及選自SEQ ID N0s:129和134中任一種的多肽。在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及一種 多肽，其中第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域為SEQ ID N0:1。在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明 涉及一種多肽，其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是選自SEQ ID N0s:3和12中的任一種。 在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及選自SEQ ID NOs: 129和137中的任一種的多肽。
[0127] 在另一方面中，本發(fā)明的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽的兩種以上 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的每一種（其針對PcrV)屬于相同的表位庫。因此，本發(fā)明 還涉及包含兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩種以上針對PcrV 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的多肽，其中所述兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域中的每一種屬于相同的表位庫。通過定義，屬于相同的表位庫的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域彼此交叉競爭與靶標(biāo)PcrV的結(jié)合。因此，本發(fā)明涉及包含兩種以上針對PcrV的 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成 的多肽，其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV 的結(jié)合，和/或其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合被第二免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域交叉阻斷。
[0128] 在本發(fā)明所述的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽中存在的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選的組合可以包括下述的任一種：
[0129] -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或第一和第二免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位 庫1]中的至少一種交叉阻斷；
[0130] -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或第一和第二免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫 2]中的至少一種交叉阻斷；或
[0131] -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或第一和第二免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位 庫3]中的至少一種交叉阻斷。
[0132] 本發(fā)明所述的優(yōu)選的多互補位（諸如二互補位或三互補位）多肽可以包含下述免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組合中的一種或基本上由下述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組合中的 一種組成：
[0133] -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫1的多肽，并且選自下述任 一種：
[0134] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 4 (SEQ ID N0:202)和嵌合體6 (SEQ ID N0:204)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% ) 或沒有結(jié)合；
[0135] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同 一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0136] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0137] 〇是SEQ ID N0s:3_10中的任一種的多肽；
[0138] -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫2的多肽，并且選自下述任 一種：
[0139] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 7 (SEQ ID N0:205)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0140] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一 性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100% 的氨基酸同一'I"生；
[0141] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中 的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0142] 〇是SEQ ID NOs: 1和2中的任一種的多肽；或者
[0143] -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是屬于表位庫3的多肽，并且選自下述任 一種：
[0144] 〇這樣的多肽，所述多肽結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，并且表現(xiàn)出與嵌合體 2 (SEQ ID N0:200)減少的結(jié)合（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有結(jié)合；
[0145] 〇這樣的多肽，其中⑶R序列與具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸 同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95 %的氨基酸同一性或更多或甚至基本上 100%的氨基酸同一性；
[0146] 〇這樣的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷；和
[0147] 〇是SEQ ID N0s:ll和12中的任一種的多肽。
[0148] 在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及上文定義的多肽，其選自SEQ ID NOs :118-123 (表 A-5)中的任一種。
[0149] 在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及上文定義的多肽，其中至少一個免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域是SEQ ID N0:3。在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及上文定義的多肽，其選 自SEQ ID NOs: 118, 120和121中的任一種。在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及上文定義 的多肽，其中至少一個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是SEQ ID N0:1。在另一個優(yōu)選的方面中， 本發(fā)明涉及上文定義的多肽，其選自SEQ ID NOs: 122和123中的任一種。
[0150] 在本發(fā)明的多肽中存在的兩種以上的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以由輕鏈可變 結(jié)構(gòu)域序列（例如，'-序列）組成或由重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，V H_序列）組成。它們 可以由來源于常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列組成或者由來源于重鏈抗體的重鏈可 變結(jié)構(gòu)域序列組成。它們可以由結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸）組成，由 單結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸）組成，由"dAb"(或適合用作dAb的 氨基酸）組成或由納米抗體（包括但不限于V HH)組成。在一個優(yōu)選的方面中，所述兩種以 上的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域由部分或完全人源化的納米抗體或部分或完全人源化的VHH 組成。
[0151] 本發(fā)明的多價（如多互補位）多肽通?？梢酝ㄟ^適當(dāng)?shù)剡B接（任選地通過適當(dāng)?shù)?接頭）或組合兩種以上（單價）免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（或通過適當(dāng)?shù)剡B接或組合編碼 所述（單價）免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列以提供編碼所需要的多價構(gòu)建體的核 酸，然后適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)所述多價構(gòu)建體）而提供（并且特別地，有目的地設(shè)計用于特定的生物 學(xué)作用）。因此，清楚的是，本發(fā)明不僅使得本文所述的多價（優(yōu)選多互補位）多肽成為可 用的，而且通過使得本文所述的單價多肽成為可用的而為技術(shù)人員提供各種各樣的不同的 "結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"結(jié)合單元"，所述"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"結(jié)合單元"可以用作"結(jié)構(gòu)單元"，從 而通過使用本文所述的適當(dāng)?shù)?結(jié)構(gòu)單位"來提供各種各樣的不同的多價（優(yōu)選多互補位 (具體地是二互補位和三互補位））多肽（其可以具有不同的結(jié)合親和力、抗體親抗原性、特 異性、效力和/或功效）。
[0152] 從而，本發(fā)明的各種的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或單價多肽（和/或編碼其 的核苷酸序列和/或核酸）及其作為"結(jié)構(gòu)單元"在制備多價和/或多互補位多肽（或編 碼其的核苷酸序列/核酸）中或用于制備其的應(yīng)用形成本發(fā)明的重要方面。
[0153] 因此，在另一個方面中，本發(fā)明還涉及包含選自由以下組成的組的至少一種氨基 酸殘基片段（stretch)的多肽（在本文中也稱為"本發(fā)明的單價多肽"）：
[0154] -CDR1 序列：
[0155] a) SEQ ID NOs :20-37 ;
[0156] b)與SEQ ID N0s:20_37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列的片段；
[0157] c)與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列的片段；
[0158] 和/或
[0159] -CDR2 序列：
[0160] d)SEQ ID NOs :38-56 ；
[0161] e)與SEQ ID N0s:38_56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列的片段；
[0162] f)與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列的片段；
[0163] 和/或
[0164] -CDR3 序列：
[0165] g)SEQ ID NOs :57-75 ；
[0166] h)與SEQ ID N0s:57_75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列的片段；
[0167] i)與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列的片段。
[0168] 包含上述指定的氨基酸殘基片段中的一種或多種的單價多肽表現(xiàn)出改善的特性， 諸如例如，改善的結(jié)合特征（適當(dāng)測量的和/或表示為K D-值（實際的或表觀的），κΑ-值 (實際的或表觀的），速率和/或kWiS-速率，或備選地為IC 5(I值，如本文進一步所 述），改善的親和性和/或改善的針對PcrV的抗體親抗原性和/或改善的中和PcrV的功效 和/或效力。
[0169] 例如，在使用平均Μ0Ι為2. 8的P3X63細(xì)胞作為靶標(biāo)的TTSS-依賴性細(xì)胞毒性 測定中，本發(fā)明的單價多肽可以具有InM-lOOOOnM，5nM-1000nM，優(yōu)選5nM-500nM，更優(yōu)選 5nM-200nM，如 5nM-50nM 或更小的 IC50 值。
[0170] 除此之外和/或另外，在所述TTSS-依賴性細(xì)胞毒性測定中，本發(fā)明的單價多肽可 以具有50%以上、優(yōu)選90%以上、如100%的功效抑制；參見實施例4. 4)。
[0171] 在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的單價多肽具有結(jié)構(gòu) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,其中CDR1, CDR2和CDR3如本文關(guān)于本發(fā)明的單價多肽 所定義，并且FR1，F(xiàn)R2, FR3和FR4為構(gòu)架序列。因此，本發(fā)明還涉及基本上由4個構(gòu)架區(qū) (分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成的單價多肽，其中 ：
[0172] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0173] a) SEQ ID NOs :20-37 的氨基酸序列；
[0174] b)與SEQ ID N0s:20_37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0175] c)與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0176] 和 / 或
[0177] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0178] d)SEQ ID N0s:38-56 的氨基酸序列；
[0179] e)與SEQ ID N0s:38_56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0180] f)與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0181] 和/或
[0182] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0183] g)SEQ ID NOs :57-75 的氨基酸序列；
[0184] h)與SEQ ID N0s:57_75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0185] i)與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0186] 優(yōu)選的單價多肽基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分 別為CDR1-CDR3)組成，其中：
[0187] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0188] a) SEQ ID NOs :20-37 的氨基酸序列；
[0189] b)與SEQ ID N0s:20_37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0190] c)與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0191] 和
[0192] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0193] d)SEQ ID NOs :38-56 的氨基酸序列；
[0194] e)與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0195] f)與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0196] 和
[0197] -CDR3選自由以下組成的組：
[0198] g)SEQ ID NOs :57-75 的氨基酸序列；
[0199] h)與SEQ ID N0s:57_75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0200] i)與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0201] 在本發(fā)明的優(yōu)選的單價多肽中，所述CDR序列與具有SEQ ID NOs :1-19的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80% 的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多或甚至 基本上100%的氨基酸同一性。
[0202] 本發(fā)明還涉及針對PcrV的單價多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
[0203] 本發(fā)明優(yōu)選的多肽選自SEQ ID NOs: 1-19中的任一種。
[0204] 本發(fā)明人還觀察到屬于特定的表位庫的免疫球蛋白特別適用于結(jié)合PcrV，中和銅 綠假單胞菌和/或作為制備多互補位（諸如例如二互補位或三互補位）多肽的結(jié)合單元。 優(yōu)選的免疫球蛋白屬于表位庫1、2或3 (如本文進一步定義）。
[0205] 因此，在另一個方面中，本發(fā)明涉及屬于表位庫1的免疫球蛋白，并且其具有下述 特征中的一種或多種：
[0206] ?其交叉阻斷具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與 PcrV的結(jié)合；
[0207] ?其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:3_10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少 一種交叉阻斷；
[0208] ?其結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，同時表現(xiàn)出與嵌合體4 (SEQ ID N0:202)和 嵌合體6 (SEQ ID NO: 204)減少的（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有（與全長PcrV相 t匕，低于30% )結(jié)合；
[0209] ?其由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3) 組成，其中：
[0210] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0211] a) SEQ ID NOs :22-28 的氨基酸序列；
[0212] b)與SEQ ID N0s:22_28的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0213] c)與SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0214] 和
[0215] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0216] d)SEQ ID NOs :40-47 的氨基酸序列；
[0217] e)與SEQ ID N0s:40_47的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0218] f)與SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0219] 和
[0220] -CDR3選自由以下組成的組：
[0221] g)SEQ ID NOs :59-66 的氨基酸序列；
[0222] h)與SEQ ID N0s:59_66的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0223] i)與SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0224] ?其⑶R序列與具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一 種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少 90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100%的氨基酸同一 性；或者
[0225] ?其選自 SEQ ID N0s:3_10 中的任一種。
[0226] 在另一個方面中，本發(fā)明涉及屬于表位庫2的免疫球蛋白，并且其具有下述特征 中的一種或多種：
[0227] ?其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與 PcrV的結(jié)合；
[0228] ?其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至 少一種交叉阻斷；
[0229] ?其結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，同時表現(xiàn)出與嵌合體7 (SEQ ID N0:205)減 少的（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有（與全長PcrV相比，低于30% )結(jié)合；
[0230] ?其由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3) 組成，其中：
[0231] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0232] a)SEQ ID N0s:20_21 的氨基酸序列；
[0233] b)與SEQ ID N0s:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0234] c)與SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0235] 和
[0236] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0237] d)SEQ ID NOs :38-39 的氨基酸序列；
[0238] e)與SEQ ID N0s:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0239] f)與SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0240] 和
[0241] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0242] g) SEQ ID NOs: 57-58 的氨基酸序列；
[0243] h)與SEQ ID N0s:57_58的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0244] i)與SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0245] ?其⑶R序列與具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一 種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至 少90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100%的氨基酸同一 性；或者
[0246] ?其選自SEQ ID NOs: 1和2中的任一種。
[0247] 在另一個方面中，本發(fā)明涉及屬于表位庫3的免疫球蛋白，并且其具有下述特征 中的一種或多種：
[0248] ?其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種 與PcrV的結(jié)合；
[0249] ?其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的 至少一種交叉阻斷；
[0250] ?其結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，同時表現(xiàn)出與嵌合體2 (SEQ ID N0:200)減 少的（與全長PcrV相比，30-90% )或沒有（與全長PcrV相比，低于30% )結(jié)合；
[0251] ?其由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3) 組成，其中：
[0252] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0253] a) SEQ ID NOs: 29-30 的氨基酸序列；
[0254] b)與SEQ ID N0s:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0255] c)與SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0256] 和
[0257] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0258] d) SEQ ID NOs: 48-49 的氨基酸序列；
[0259] e)與SEQ ID N0s:48_49的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0260] f)與SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0261] 和
[0262] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0263] g) SEQ ID NOs: 67-68 的氨基酸序列；
[0264] h)與SEQ ID N0s:67_68的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0265] i)與SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0266] ?其⑶R序列與具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少 一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至 少90%的氨基酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100%的氨基酸同一 性；
[0267] ?其選自SEQ ID NOs: 11和12中的任一種。
[0268] 本發(fā)明的單價多肽可以基本上由選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，'-序列）和選 自重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，V H_序列）的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成。本發(fā)明的單價 多肽可以基本上由選自來源于常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和來源于重鏈抗體的 重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列組成。本發(fā)明的單價多肽可以基本上由選自以下的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域組成：結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸），單結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作 單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸），"dAb"(或適合用作dAb的氨基酸），或納米抗體（包括但不限于 Vhh)。在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的單價多肽基本上由部分或完全人源化的納米抗體，如 部分或完全人源化的VHH組成。
[0269] 如上文所述，本發(fā)明還涉及本文所述的單價多肽在制備本發(fā)明的多價、優(yōu)選多互 補位多肽中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單價多肽作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合單元在制 備本發(fā)明的多價多肽中的應(yīng)用。
[0270] 本發(fā)明還涉及包含一種或多種單價多肽或一種或多種本發(fā)明的多價、優(yōu)選多互補 位多肽或基本上由一種或多種單價多肽或一種或多種本發(fā)明的多價、優(yōu)選多互補位多肽組 成的多肽（在本文中還稱為"本發(fā)明的多肽"），并且任選地還包含一種或多種其他基團、殘 基、結(jié)構(gòu)部分或結(jié)合單元，其任選地通過一個或多個肽接頭連接。如技術(shù)人員應(yīng)該從本文進 一步的公開內(nèi)容中清楚的，所述其他基團、殘基、結(jié)構(gòu)部分、結(jié)合單元或氨基酸序列可以為 或可以不為本發(fā)明的單價或多價、優(yōu)選多互補位多肽提供其他官能性，并且可以改變或可 以不改變本發(fā)明的單價或多價多肽的特性。
[0271] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的核酸或核苷酸序列。所述核酸在本文中還稱為 "本發(fā)明的核酸"，并且例如，可以以遺傳構(gòu)建體的形式存在，如本文進一步所述。因此，本發(fā) 明還涉及以遺傳構(gòu)建體形式存在的核酸或核苷酸序列。
[0272] 編碼本發(fā)明的單價多肽的核酸可以連接起來以獲得編碼本發(fā)明的多價、優(yōu)選多互 補位多肽的核酸。因此，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的單價多肽的核酸或核苷酸序列用于制 備編碼本發(fā)明的多價、優(yōu)選多互補位多肽的遺傳構(gòu)建體的應(yīng)用。
[0273] 本發(fā)明還涉及表達(dá)（或在適宜的環(huán)境下能夠表達(dá)）本發(fā)明的多肽的宿主或宿主細(xì) 胞；和/或包含本發(fā)明的核酸的宿主或宿主細(xì)胞。通過本文的進一步描述，所述宿主或宿主 細(xì)胞的一些優(yōu)選但非限制性的實例將變得清楚。
[0274] 本發(fā)明還涉及一種組合物，所述組合物含有或包含至少一種本發(fā)明的多肽和/或 至少一種本發(fā)明的核酸以及任選地所述組合物的本身已知的一種或多種其他成分，即，這 取決于所述組合物的目的應(yīng)用。例如，所述組合物可以是藥物組合物（如本文所述）或獸 醫(yī)用組合物。通過本文的進一步描述，所述組合物的一些優(yōu)選但非限制性的實例將變得清 楚。
[0275] 本發(fā)明還涉及用于制備本文所述的多肽、核酸、宿主細(xì)胞和組合物的方法。
[0276] 本發(fā)明還涉及本文所述的多肽、核酸、宿主細(xì)胞和組合物用于預(yù)防和/或治療銅 綠假單胞菌感染的的應(yīng)用和用途，以及方法。通過本文的進一步描述，一些優(yōu)選的但非限制 性的應(yīng)用和用途將變得清楚。
[0277] 由此，本發(fā)明的多肽和組合物可以用于預(yù)防和/或治療銅綠假單胞菌感染。對銅 綠假單胞菌感染敏感的患者組是技術(shù)人員所清楚的，并且例如，包括（但不限于）通風(fēng)器 相關(guān)性肺炎（VAP)，燒傷受害者，機械通氣的患者，囊性纖維化（CF)患者，造血細(xì)胞移植患 者，骨髓移植患者，進行手術(shù)的患者，患有慢性阻塞性肺疾?。–0PD)的患者，患有支氣管 擴張（bronchiectasis)的患者，患有敗血癥的患者和患有癌癥相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥 (cancer-associated neutropenia)的患者。
[0278] 因此，本發(fā)明還涉及用于預(yù)防和/或治療下述中的至少一種中的銅綠假單胞菌感 染的方法：通風(fēng)器相關(guān)性肺炎（VAP)，燒傷受害者，機械通氣的患者，囊性纖維化（CF)患者， 造血細(xì)胞移植患者，骨髓移植患者，外科手術(shù)，慢性阻塞性肺疾?。–OPD)，支氣管擴張，敗血 癥，癌癥相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥，所述方法包括向有此需要的受試者施用藥物活性量的 至少一種本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的組合物。
[0279] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽在制備用于預(yù)防和/或治療下述至少一種中的銅綠 假單胞菌感染的藥物組合物中的應(yīng)用：通風(fēng)器相關(guān)性肺炎（VAP)，燒傷受害者，機械通氣的 患者，囊性纖維化（CF)患者，造血細(xì)胞移植患者，骨髓移植患者，外科手術(shù)，慢性阻塞性肺 疾病（C0PD)，支氣管擴張，敗血癥，癌癥相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥；和/或用于本文所述的 一種或多種方法中的應(yīng)用。
[0280] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的組合物，其用于預(yù)防和/或治療下述至 少一種中的銅綠假單胞菌感染：通風(fēng)器相關(guān)性肺炎（VAP)，燒傷受害者，機械通氣的患者， 囊性纖維化（CF)患者，造血細(xì)胞移植患者，骨髓移植患者，外科手術(shù)，慢性阻塞性肺疾病 (C0PD)，支氣管擴張，敗血癥，癌癥相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥。
[0281] 通過本發(fā)明的進一步公開，本發(fā)明的多肽和組合物的其他應(yīng)用和用途將為技術(shù)人 員所清楚。
[0282] 附圖簡述
[0283] 圖1A-1D:在如實施例5所述的使用P3X63細(xì)胞作為靶標(biāo)的細(xì)胞毒性測定中分析 單價抗-PcrV納米抗體。
[0284] 圖2A-2B:在如實施例7所述的使用P3X63細(xì)胞作為靶標(biāo)的細(xì)胞毒性測定中分析 二價/雙互補位抗-PcrV納米抗體。
[0285] 圖3:用于表位繪圖的分子的示意圖。PcrV-LcrV嵌合體設(shè)計是基于一級序列和結(jié) 構(gòu)（特別是二級結(jié)構(gòu)）信息。通過引入七種長度為17-47個氨基酸殘基的LcrV片段（透 明長方塊）替代PcrV的結(jié)構(gòu)對應(yīng)副本（黑色長方塊）而設(shè)計七種不同的嵌合分子。也產(chǎn) 生了 Frank 等·（The Journal of infectious diseases (傳染病雜志）186:64-73, 2002 和 US6, 827, 935)所述的PcrV片段（氨基酸144-257)。長方塊上方和下方的數(shù)字分別表示 PcrV或LcrV的氨基酸殘基數(shù)目。不同構(gòu)建體的氨基酸序列在表A-7中給出。
[0286] 圖4A-4B:在急性銅綠假單胞菌感染小鼠模型中接種納米抗體339, 360和376后 獲得的存活曲線。每組7至8只C57B1/6小鼠用預(yù)先與銅綠假單胞菌混合的納米抗體、 Fabl3. 37或緩沖液單獨的預(yù)混合物鼻內(nèi)攻擊。在96小時或125小時內(nèi)監(jiān)測小鼠的存活。
[0287] 圖5A-5C:肺炎癥參數(shù)和細(xì)菌負(fù)擔(dān)。每組3至5只C57B1/6小鼠用預(yù)先與銅綠假 單胞菌混合的納米抗體、Fabl3. 37或緩沖液單獨的預(yù)混合物鼻內(nèi)攻擊。另一組i. p.接受 10mg/kg妥布霉素（Tobramycin)作為陽性對照。在感染后24小時處死所有小鼠，之后評估 髓過氧化物酶活性（A)、細(xì)菌負(fù)擔(dān)（B)和肺重量相對于總體重的百分比（C)。結(jié)果表示為平 均數(shù)土SEM。使用具有post-hoc Bonferroni' s多重比較檢驗的單向AN0VA進行統(tǒng)計學(xué)。 〈0. 05的P-值認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。
[0288] 圖6:相對體重減輕。每組7-8只C57B1/6小鼠用預(yù)先與銅綠假單胞菌混合的納 米抗體、Fabl3. 37或緩沖液單獨的預(yù)混合物鼻內(nèi)攻擊。監(jiān)測小鼠5天，并且每天在lpm記 錄體重。結(jié)果表示為平均數(shù)土SEM。
[0289] 圖7.在霧化之前和之后納米抗體樣品的0D500值。多肽339, 360, 354和376 (在 具有和不具有吐溫80的D-PBS中）通過AfGTA2A APIXNEB噴霧器系統(tǒng)（Activaero)霧 化。霧化實驗一式兩份進行。5000樣品通過具有4um膜的篩網(wǎng)噴霧器連續(xù)霧化。氣霧 劑收集在100mL玻璃瓶中，然后進行分析。
[0290] 詳述
[0291]
[0292] 除非另外指明或限定，所用的所有術(shù)語具有它們在本領(lǐng)域內(nèi)的通用意思，其對 于熟練的技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的。例如，參考標(biāo)準(zhǔn)手冊，如Sambrook等.（Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克?。簩嶒炇沂謨裕ǖ?2 版）Vols.l_3，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實驗室出版社），1989)，F(xiàn). Ausubel 等·（Current protocols in molecular biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)方法），Green Publishing&Wiley Interscience, New York, 1987), Lewin (Genes II (基因 II), John Wiley&Sons, New York, N. Y. , 1985), Old 等·（Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering(基因操作原理：基因工程導(dǎo)言）（第2版）University of California Press，Berkeley，CA，1981) ;Roitt 等·（Immunology (免疫學(xué)）（第 6 版）Mosby/Elsevier, Edinburgh，2001)，Roitt 等·（Roitt's Essential Immunology(Roitt 基礎(chǔ)免疫學(xué)）（第 10 版）Blackwell Publishing，UK，2001)，和 Janeway 等·（Immunobiology (免疫生物學(xué)）（第 6 版）Garland Science Publishing/Churchi 11 Livingstone, New York, 2005),以及本發(fā) 明所引用的一般【背景技術(shù)】。
[0293] 熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，除非另外指明，沒有特別詳細(xì)描述的所有方法、 步驟、技術(shù)和操作可以以本身已知的方式進行并且已經(jīng)以本身已知的方式進行。例 如，同樣參考標(biāo)準(zhǔn)手冊和本文提及的一般【背景技術(shù)】以及其中引用的其他參考文獻(xiàn)；以 及例如下述綜述：Presta(Adv.Drug Deliv.Rev.58(5-6):640_56,2006)，Levin 和 Weiss (Mol. Biosyst. 2 (1) : 49-57, 2006)，Irving 等·（J. Immunol. Methods (免疫學(xué)方法雜 志）248(1-2):31-45,2001)，Schmitz 等·（Placenta21Suppl. A:S106-12,2000)，Gonzales 等.（Tumour Biol.(腫瘤生物學(xué)）26(1) :31-43, 2005)，其描述了用于蛋白質(zhì)工程的技術(shù)， 諸如親和力成熟和其他用于提高蛋白如免疫球蛋白的特異性和其他需要的特性的技術(shù)。
[0294] 術(shù)語"序列"用在本文中（例如，在如"免疫球蛋白序列"，"抗體序列"，"可變結(jié)構(gòu) 域序列"，"V HH序列"或"蛋白序列"的術(shù)語中）通常應(yīng)該理解為包含相關(guān)的氨基酸序列以及 編碼其的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更局限的解釋。
[0295] 氨基酸殘基按照標(biāo)準(zhǔn)的三字母或一字母氨基酸密碼表示。參考見W008/020079第 48頁的表A-2。
[0296] 核酸或氨基酸被認(rèn)為是"（以）基本上分離的（形式存在）" 一一例如，與其從中 獲得的反應(yīng)介質(zhì)或培養(yǎng)基相比一一此時其已經(jīng)與其通常在所述來源或介質(zhì)中與之締合的 至少一種其他成分（諸如另一種核酸，另一種蛋白/多肽，另一種生物成分或高分子或至少 一種污染物、雜質(zhì)或微量組分）分離。特別地，當(dāng)它已被純化至少2倍，特別是至少10倍，更 特別地至少100倍，并且高達(dá)1000倍或更多時，認(rèn)為核酸或氨基酸是"（基本上）分離的"。 當(dāng)使用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，諸如適當(dāng)?shù)膶游黾夹g(shù)，諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)確定時，"以（基本 上）分離的形式存在"的核酸或氨基酸優(yōu)選地基本上是均質(zhì)的。
[0297] 當(dāng)認(rèn)為核苷酸序列或氨基酸序列分別"包含"另一個核苷酸序列或氨基酸序列，或 "基本上由"另一個核苷酸序列或氨基酸序列"組成"時，這可以意指后一個核苷酸序列或氨 基酸序列已經(jīng)分別結(jié)合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，這一般 意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列內(nèi)分別包含核苷酸或氨基酸殘基的片 段，其分別與后一個序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管最先提及的序列實 際上是怎樣產(chǎn)生或獲得的（例如，其可以通過本發(fā)明所述的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行）。通過非 限制性實例的方式，當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明的多肽包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域時，這可以意指所 述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域序列已經(jīng)結(jié)合在本發(fā)明的多肽的序列內(nèi)，但是更通常地，這一 般意指本發(fā)明的多肽在其序列內(nèi)包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的序列，而不管本發(fā)明所述 的多肽是怎樣產(chǎn)生或獲得的。此外，當(dāng)認(rèn)為核酸或核苷酸序列包括另一個核苷酸序列時，最 先提及的核酸或核苷酸序列優(yōu)選是這樣的，以致當(dāng)它被表達(dá)成表達(dá)產(chǎn)物（例如，多肽）時， 由后一個核苷酸序列編碼的氨基酸序列形成所述表達(dá)產(chǎn)物的一部分（換言之，后一個核苷 酸序列處在與所述最先提及的、較大的核酸或核苷酸序列相同的閱讀框內(nèi)）。
[0298] "基本上由......組成"意指用于本發(fā)明方法中的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與本發(fā) 明的多肽完全相同，或者與本發(fā)明的多肽相對應(yīng)，其具有添加到所述免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域的氣基末端、竣基末端或者氣基末端和竣基末端兩端的有限數(shù)目的氣基酸殘基，諸如 1-20個氨基酸殘基，例如1-10個氨基酸殘基并且優(yōu)選地1-6個氨基酸殘基，諸如1，2, 3,4， 5或6個氨基酸殘基。
[0299] 出于比較兩種或更多種核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之 間的"序列同一性"百分比可以通過用[第一核苷酸序列中與第二核苷酸序列中相應(yīng)位置 的核苷酸相同的核苷酸數(shù)目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸總數(shù)]并且乘以[100% ] 而計算，其中在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、取代或添加一一與第一核苷酸 序列相比一一都視作在單一核苷酸（位置）的差異。備選地，兩種或更多種核苷酸序列之間 的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比對的使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的計算機算法進行計算， 諸如 NCBI Blast ν2·0。例如，在 W0 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, W0 00/55318, W0 00/78972, W0 98/49185和GB 2357768中描述了用于確定序列同一性程度的一些其他的技 術(shù)、計算機算法和設(shè)置。通常，出于按照上文列出的計算方法來確定兩種核苷酸序列之間的 "序列同一性"的百分比的目的，將具有最大核苷酸數(shù)目的核苷酸序列視作"第一"核苷酸序 列，并且將另一種核苷酸序列視作"第二"核苷酸序列。
[0300] 出于比較兩種或更多種氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之 間的"序列同一性"百分比（在本文也稱為"氨基酸同一性"）可以通過用[第一氨基酸序 列中與第二氨基酸序列中相應(yīng)位置的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基數(shù)目]除以[第一氨基 酸序列中的氨基酸殘基總數(shù)]并且乘以[100% ]而計算，其中第二氨基酸序列中氨基酸殘 基的每一缺失、插入、取代或添加一一與第一氨基酸序列相比一一都視作在單一氨基酸殘 基（位置）上的差異，即，視作本發(fā)明所定義的"氨基酸差異"。備選地，兩種氨基酸序列之 間的序列同一性程度可以使用已知的計算機算法進行計算，諸如上文提及的用于確定核苷 酸序列的序列同一性程度的那些，其仍舊使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。通常，出于按照上文列出的計算方 法來確定兩種氨基酸序列之間的"序列同一性"的百分比的目的，將具有最大氨基酸殘基數(shù) 目的氨基酸序列視作"第一"氨基酸序列，并且將另一種氨基酸序列視作"第二"氨基酸序 列。
[0301] 此外，在確定兩種氨基酸序列之間的序列同一性程度時，技術(shù)人員可以考慮所謂 的"保守"氨基酸取代，其通?？梢悦枋鰹檫@樣的氨基酸取代，即，其中氨基酸殘基被具有 相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的另一種氨基酸殘基取代，并且其對所述多肽的功能、活性或其他生物學(xué)特 性幾乎沒有或者基本上沒有影響。這種保守氨基酸取代是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，例如，從W0 04/037999，GB 335768, TO 98/49185, TO 00/46383 和 TO 01/09300 中可知；并且可以基于 TO 04/037999以及W0 98/49185和其中所引用的其他參考文獻(xiàn)的相關(guān)教導(dǎo)而選擇此類取 代的（優(yōu)選）類型和/或組合。
[0302] 所述保守取代優(yōu)選地是這樣的取代，即，其中下列組（a) - (e)內(nèi)的一個氨基酸被 同組內(nèi)的另一氨基酸殘基取代：(a)小的脂肪族、非極性或弱極性的殘基:Ala，Ser，Thr， Pro和Gly ; (b)極性、帶負(fù)電荷的殘基及其（不帶電荷的）酰胺：Asp, Asn，Glu和Gin ; (c) 極性、帶正電荷的殘基：His, Arg和Lys ; (d)大的脂肪族、非極性殘基：Met，Leu, lie, Val 和Cys ;以及（e)芳族殘基：Phe，Tyr和Trp。特別優(yōu)選的保守取代如下：Ala取代成Gly 或取代成Ser ;Arg取代成Lys ;Asn取代成Gin或取代成His ;Asp取代成Glu ;Cys取代成 Ser ;Gln取代成Asn ;Glu取代成Asp ;Gly取代成Ala或取代成Pro ;His取代成Asn或取 代成Gin ;lie取代成Leu或取代成Val ;Leu取代成lie或取代成Val ;Lys取代成Arg，取 代成Gin或取代成Glu ;Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成lie ;Phe取代成Met，取代成 Leu或取代成Tyr ;Ser取代成Thr ;Thr取代成Ser ;Trp取代成Tyr ;Tyr取代成Trp ;和/ 或Phe取代成Val，取代成lie或取代成Leu。
[0303] 用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代還可以基于Schulz等（"Principles of Protein Structure (蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理）"，Springer-Verlag, 1978)研究的不同物 種的同源蛋白之間的氨基酸變異頻率的分析，基于Chou和Fasman(Biochemistry (生 物化學(xué)）13:211, 1974 ;Adv.Enzymol.(高級酶學(xué)），47:45-149, 1978)研究的結(jié)構(gòu) 形成潛力的分析，和基于Eisenberg等（Proc. Nad. Acad Sci. USA(美國國家科學(xué) 院學(xué)報）81:140-144, 1984)，Kyte 和 Doolittle (J.Molec. Biol.(分子生物學(xué)雜 志）· 157:105-132, 1981)，以及 Goldman 等（Ann. Rev. Biophys. Chem.(生物物理化學(xué)年度 綜述）15:321-353, 1986)研究的蛋白中疏水模式的分析，所有這些通過引用完全結(jié)合于 此。在本文描述和上文引用的公知【背景技術(shù)】中給出關(guān)于納米抗體的一級、二級和三級結(jié)構(gòu) 的信息。此夕卜，出于這一目的，例如，Desmyter等（Nature Structural Biology (自然結(jié)構(gòu) 生物學(xué)），3 :803,1996), Spinelli 等（Natural Structural Biology (自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)）， 3 :752-757,1996)和 Decanniere 等（Structure (結(jié)構(gòu)），7 (4) : 361，1999)給出來自美洲駝 (llama)的Vhh結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。關(guān)于在常規(guī)VH結(jié)構(gòu)域中形成V H/\界面的一些氨基酸殘 基和在這些位置的潛在的駱駝源化（camelizing)取代的其他信息可以在上文引用的現(xiàn)有 技術(shù)中找到。
[0304] 如果在它們的全長有100%的序列同一性（如本發(fā)明所定義），那么認(rèn)為氨基酸序 列和核酸序列"完全相同"。
[0305] 當(dāng)比較兩種氨基酸序列時，術(shù)語"氨基酸差異"是指與第二序列相比，在第一序列 位置上的單個氨基酸殘基的插入、缺失或取代；應(yīng)該理解兩種氨基酸序列可以包含一個、兩 個或更多個這樣的氨基酸差異。更具體地，在本發(fā)明的氨基酸序列和/或多肽中，術(shù)語"氨 基酸差異"是指，分別與a)，d)或g)的CDR序列相比，在c)，f)或i)所指定的CDR序列的 位置的單個氨基酸殘基的插入、缺失或取代；應(yīng)該理解為，分別與a), d)或g)的CDR序列相 比，c)，f)和i)的⑶R序列可以包含一個、兩個或最多三個這樣的氨基酸差異。
[0306] "氨基酸差異"可以是任意一個、兩個或最多三個取代、缺失或插入，或其任意組 合，其改善本發(fā)明的多肽的特性或者其至少不使本發(fā)明的多肽的理想的特性或理想的特性 的平衡或組合減少太多。在這一方面，與包含所述一個或多個CDR序列而沒有所述一個、兩 個或最多三個取代、缺失或插入的多肽相比，所產(chǎn)生的本發(fā)明的多肽應(yīng)該至少以相同的、大 約相同的或更高的親和力結(jié)合PcrV，所述親和力通過表面等離子體共振測量。
[0307] 在這一方面，c)，f)和/或i)所述的氨基酸序列可以分別是通過使用本身已知的 一種或多種親和力成熟技術(shù)進行親和力成熟而來源于a)，d)和/或g)所述的氨基酸序列 的氨基酸序列。
[0308] 例如，并且取決于用來表達(dá)本發(fā)明的多肽的宿主生物體，可以以這樣的方式設(shè)計 所述缺失和/或取代，即，去除一個或多個翻譯后修飾的位點（如一個或多個糖基化位點）， 這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
[0309] 術(shù)語"表位"和"抗原決定簇"可以互換使用，是指諸如多肽或蛋白的大分子由抗 原結(jié)合分子識別的部分，所述抗原結(jié)合分子諸如本發(fā)明的免疫球蛋白、常規(guī)抗體、免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽，并且更具體地是由所述分子的抗原結(jié)合位點識別的部分。表 位限定免疫球蛋白的最少的結(jié)合位點，因此表示免疫球蛋白的特異性靶標(biāo)。
[0310] 抗原結(jié)合分子（諸如本發(fā)明的免疫球蛋白、常規(guī)抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 和/或多肽）識別表位的部分稱為"互補位"。
[0311] 認(rèn)為能夠"結(jié)合"或"特異性結(jié)合"、對特定表位、抗原或蛋白（或者對其至少一部 分、片段或表位）"具有親和性"和/或"具有特異性"的多肽（如本發(fā)明的免疫球蛋白、 抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽、或通常是抗原結(jié)合分子或其片段）是"針對""抗 (against)"或"針對（directed against)"）所述表位、抗原或蛋白的或關(guān)于所述表位、 抗原或蛋白是"結(jié)合"分子，或者認(rèn)為是"抗表位、"抗抗原或"抗蛋白的（例如， "抗" -PcrV 的）。
[0312] 術(shù)語"特異性"具有在W0 08/020079第53-56頁段落η)中給出的意思；并且如其 中提及的，是指特定的抗原-結(jié)合分子或抗原-結(jié)合蛋白（諸如本發(fā)明的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域和/或多肽）可以結(jié)合的不同類型的抗原或抗原決定簇的數(shù)目。一種抗原-結(jié)合 蛋白的特異性可以依據(jù)親和力和/或抗體親抗原性而確定，如W0 08/020079 (通過引用結(jié) 合于此）第53-56頁所述，其還記述了用于測量抗原-結(jié)合分子（諸如本發(fā)明的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽）與相關(guān)抗原之間的結(jié)合的一些優(yōu)選的技術(shù)。典型地，抗原-結(jié) 合蛋白（諸如本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽）將以1〇_ 5-1〇_12摩爾/升或更 小、并且優(yōu)選地1〇_7-1〇_12摩爾/升或更小并且更優(yōu)選地1〇_ 8-1〇_12摩爾/升的解離常數(shù)（KD) (即，以105-10 12升/摩爾或更大、并且優(yōu)選地107-1012升/摩爾或更大、且更優(yōu)選地10 8-1012 升/摩爾的締合常數(shù)（KA))而結(jié)合它們的抗原。任何大于104摩爾/升的KD值（或任何小 于10 4M<的&值）升/摩爾通常認(rèn)為指示非特異性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的單價多肽將以 小于500nM、優(yōu)選地小于200nM、更優(yōu)選地小于10nM諸如10至5nM或更小的親和力與目標(biāo)抗 原結(jié)合。抗原-結(jié)合蛋白與抗原或抗原決定簇的特異性結(jié)合可以以本身已知的任何適當(dāng)?shù)?方式確定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或競爭結(jié)合檢測，諸如放射性免疫測定（RIA)、 酶免疫測定（EIA)和夾心式（sandwich)競爭測定，和本領(lǐng)域本身已知的其不同的變化；以 及本發(fā)明提及的其他技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚，并且如W0 08/020079第53-56頁所 述，解離常數(shù)可以是實際或表觀解離常數(shù)。用于確定解離常數(shù)的方法是技術(shù)人員所清楚的， 并且例如，包括WO 08/020079第53-56頁所提及的技術(shù)。
[0313] 當(dāng)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽以是所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或 多肽與第二靶標(biāo)或抗原結(jié)合的親和力的至少10倍，如至少100倍，并且優(yōu)選至少1000倍， 并且多至10000倍以上的親和力（如上文所述，并且適當(dāng)?shù)乇硎緸镵 D值，KA值，KWiS速率和 /或Kgg速率）結(jié)合第一抗原時，與第二靶標(biāo)或抗原相比，認(rèn)為所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域和/或多肽是"特異性針對"第一靶標(biāo)或抗原。例如，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/ 或多肽可以以比所述所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽與第二靶標(biāo)或抗原結(jié)合的K D 少至少10倍，諸如少至少100倍，優(yōu)選少至少1000倍，諸如少10000倍或甚至更少的KD值 結(jié)合第一靶標(biāo)或抗原。優(yōu)選地，與第二靶標(biāo)或抗原相比，當(dāng)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或 多肽"特異性針對"第一靶標(biāo)或抗原時，其針對（如本文定義）所述第一靶標(biāo)或抗原，但是 不針對所述第二靶標(biāo)或抗原。
[0314] 術(shù)語"（交叉）阻斷（(cross)-block) "、"被（交叉）阻斷（(cross)-blocked)"、 "（交叉）阻斷（(cross)-blocking) "、"競爭性結(jié)合"、"（交叉）競爭（(cross)-compete)"、 "（交叉）競爭（(cross)-competing)"和"（交叉）競爭（(cross)-competition)" 在本文 可以互換使用，用來意指免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試 劑干擾其他免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或結(jié)合試劑與給定靶標(biāo)的結(jié) 合的能力。免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑能夠干擾另 一種對靶標(biāo)的結(jié)合的程度，且因此其能夠被認(rèn)為是本發(fā)明所述的交叉阻斷的，可以使用競 爭結(jié)合測定法確定。一種特別適當(dāng)?shù)亩拷徊孀钄鄿y定法使用Biacore機器，其可以使用 表面等離子體共振技術(shù)測量相互作用的程度。另一種適當(dāng)?shù)亩拷徊孀钄鄿y定法使用基于 ELISA的方法來測量免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑之 間對于它們與所述靶標(biāo)的結(jié)合的競爭。
[0315] 以下概括描述用于確定免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他 結(jié)合試劑是否交叉阻斷或按照本發(fā)明能夠交叉阻斷的適當(dāng)?shù)腂iacore測定法。應(yīng)該理解， 所述測定法可以與本文所述的任何免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其 他結(jié)合試劑一起使用。按照供應(yīng)商的建議使用Biacore機器（例如，Biacore3000)。因此， 在一種交叉阻斷測定法中，使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)將靶蛋白（例如PcrV)偶聯(lián)到CM5Biac 〇re 芯片上，以產(chǎn)生由所述靶標(biāo)包被的表面。典型地，200-800個共振單位的靶標(biāo)將被偶聯(lián)到芯 片上（易于給出可測量水平的結(jié)合但是易于被所用的測試試劑的濃度飽和的量）。將兩種 待檢測它們彼此交叉阻斷的能力的測試結(jié)合試劑（稱為A*和B*)以結(jié)合位點1 :1摩爾比 例混合在適當(dāng)?shù)木彌_液中，以產(chǎn)生測試混合物。當(dāng)基于結(jié)合位點計算濃度時，假設(shè)結(jié)合試劑 的分子量是所述結(jié)合試劑的總分子量除以所述結(jié)合試劑上的靶標(biāo)結(jié)合位點的數(shù)目。測試混 合物中每種結(jié)合試劑的濃度應(yīng)該足夠高，足以易于飽和所述結(jié)合試劑關(guān)于捕獲在Biacore 芯片上的靶標(biāo)分子的結(jié)合位點。在所述混合物中的結(jié)合試劑處于相同的摩爾濃度（基于結(jié) 合），且所述濃度典型地為1. 00 - 1. 5微摩爾（基于結(jié)合）。還制備僅包含A*和僅包含B* 的分開的溶液。在這些溶液中的A*和B*應(yīng)該處在與在所述測試混合物中相同的緩沖液中 和相同的濃度。將測試混合物通過靶標(biāo)-包被的Biacore芯片，且記錄結(jié)合的總量。然后， 以這樣的方式處理芯片，以在不損壞芯片-結(jié)合的靶標(biāo)的條件下去除結(jié)合的結(jié)合試劑。典 型地，這通過用30mM HC1處理芯片60秒進行。然后，將僅有A*的溶液通過靶標(biāo)-包被的 表面，并記錄結(jié)合的量。再次處理芯片，以在不損壞芯片-結(jié)合的靶標(biāo)的條件下去除所有結(jié) 合的結(jié)合試劑。然后，將僅有B*的溶液通過靶標(biāo)-包被的表面，并記錄結(jié)合的量。接著計 算A*和B*混合物的最大理論結(jié)合，并且是每種結(jié)合試劑在單獨通過靶標(biāo)表面時的結(jié)合的 總和。如果實際記錄的混合物的結(jié)合小于該理論最大值，則認(rèn)為這兩種結(jié)合試劑是彼此交 叉阻斷的。因此，通常，按照本發(fā)明的交叉阻斷的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域、多肽或其他結(jié)合試劑是一種將在上述Biacore交叉阻斷測定法中與靶標(biāo)結(jié)合的，以致 在該測定法中且在存在第二免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合 試劑時，所記錄的結(jié)合是組合的兩種免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或 結(jié)合試劑的最大理論結(jié)合（正如上文定義）的80 %-0· 1% (例如，80 %-4%)，特別地是最 大理論結(jié)合的75% -0. 1% (例如，75% -4% )，且更特別地是最大理論結(jié)合的70% -0. 1% (例如，70 % -4 % )。上述Biacore測定法是用來確定免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑是否是按照本發(fā)明彼此交叉阻斷的主要測定法。在很少的情 形中，特定的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑可能不與 通過胺化學(xué)偶聯(lián)到CM5Biac 〇re芯片上的靶標(biāo)結(jié)合（這通常在靶標(biāo)上的相關(guān)結(jié)合位點通過 與芯片的偶聯(lián)而被遮蔽或破壞時發(fā)生）。在這樣的情形中，交叉阻斷可以使用標(biāo)記形式的靶 標(biāo)，例如N端His-標(biāo)記的形式確定。以這種特定的形式，抗-His抗體將被偶聯(lián)到Biacore 芯片上，然后將His-標(biāo)記的靶標(biāo)通過芯片表面，并被所述抗-His抗體捕獲。交叉阻斷分析 將基本上按照上述進行，除了在每次芯片再生循環(huán)之后，新的His-標(biāo)記的靶標(biāo)將被重新負(fù) 載到抗-His抗體包被的表面上。除了使用N端His-標(biāo)記的靶標(biāo)給出的實例之外，可以備 選地使用C端His-標(biāo)記的靶標(biāo)。此外，本領(lǐng)域已知的各種其他標(biāo)記和標(biāo)記結(jié)合蛋白組合可 以用于這樣的交叉阻斷分析（例如，HA標(biāo)記和抗-HA抗體；FLAG標(biāo)記和抗-FLAG抗體；生 物素標(biāo)記和鏈霉抗生物素蛋白）。
[0316] 以下概括描述用于確定針對靶標(biāo)（例如PcrV)的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑是否交叉阻斷或如本文所定義那樣能夠交叉阻斷的 ELISA測定法。應(yīng)該理解，所述測定法可以與本文所述的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑中的任一種一起使用。本測定法的一般原理是使得針對 所述靶標(biāo)的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或結(jié)合試劑包被到ELISA平 板的孔上。將過量的量的第二潛在的交叉阻斷的、抗-靶標(biāo)免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑添加到溶液中（即，不與ELISA平板結(jié)合）。然后向孔 中加入有限量的靶標(biāo)。所述包被的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其 他結(jié)合試劑和溶液中的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑 競爭與有限量的靶標(biāo)分子的結(jié)合。洗滌平板，以去除未與包被的免疫球蛋白、抗體、免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑結(jié)合的過量的靶標(biāo)，且還去除第二溶液相的免疫 球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑以及在所述第二溶液相的免 疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑與靶標(biāo)之間形成的任何復(fù) 合物。然后，使用適于檢測所述靶標(biāo)的試劑測量結(jié)合的靶標(biāo)的量。相對于在不存在第二溶 液相的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑的條件下所述包 被的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑可以結(jié)合的靶標(biāo)分 子的數(shù)量，溶液中能夠交叉阻斷所包被的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多 肽或其他結(jié)合試劑的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑將 能夠引起所述包被的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑可 以結(jié)合的靶標(biāo)分子的數(shù)量的減少。在其中選擇第一免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑如Ab-X作為固定的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域、多肽或其他結(jié)合試劑的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用適當(dāng)?shù)姆忾]溶 液來封閉該平板，以最小化隨后添加的試劑的非特異性結(jié)合。然后，將過量的量的第二免疫 球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑即Ab-Y添加到該ELISA平 板中，以致在包被所述ELISA平板的過程中，每孔Ab-Y靶標(biāo)結(jié)合位點的摩爾是每孔所用的 Ab-X靶標(biāo)結(jié)合位點的摩爾至少10倍高。然后，加入靶標(biāo)，以致每孔加入的靶標(biāo)的摩爾比用 于包被每孔的Ab-X靶標(biāo)結(jié)合位點的摩爾低至少25倍。在適當(dāng)?shù)臏赜龝r間之后，洗滌ELISA 平板，且加入用于檢測所述靶標(biāo)的試劑，以測量由所述包被的抗-靶標(biāo)免疫球蛋白、抗體、 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑（在該情形中為Ab-X)特異結(jié)合的靶標(biāo)的 量。關(guān)于該測定法的背景信號定義為在使用所述包被的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑（在該情形中為Ab-X)、第二溶液相免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域、多肽或其他結(jié)合試劑（在該情形中為Ab-Y)、僅有靶標(biāo)緩沖劑（S卩，無靶標(biāo)）和靶標(biāo)檢測 試劑的孔中獲得的信號。關(guān)于該測定法的陽性對照信號定義為在使用所述包被的免疫球蛋 白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑（在該情形中為Ab-X)、僅有第二 溶液相免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑緩沖劑（即，無 第二溶液相免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑）、靶標(biāo)和靶 標(biāo)檢測試劑的孔中獲得的信號。該ELISA測定法可以以這樣的方式運行，以使得陽性對照 信號是背景信號的至少6倍。為了避免由選擇哪種免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑用作包被免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或 其他結(jié)合試劑和哪種用作第二（競爭劑）免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多 肽或其他結(jié)合試劑導(dǎo)致的任何假象（例如，Ab-X與Ab-Y之間對于靶標(biāo)的顯著不同的親和 力），該交叉阻斷測定法可以以兩種形式運行：1)形式1是其中Ab-X是包被到ELISA平板上 的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑，Ab-Y是在溶液中的 競爭免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑，和2)形式2是其 中Ab-Y是包被到ELISA平板上的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他 結(jié)合試劑，Ab-X是在溶液中的競爭免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其 他結(jié)合試劑。如果在形式1或在形式2中，與在不存在溶液相抗-靶標(biāo)免疫球蛋白、抗體、免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑的條件下（即，陽性對照孔）獲得的靶標(biāo)檢測 信號相比較，所述溶液相抗-靶標(biāo)免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其 他結(jié)合試劑能夠引起靶標(biāo)檢測信號（即，由所述包被的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑結(jié)合的靶標(biāo)的量）減少60% -100%，特別地70% -100%， 且更特別地80% -100%，則Ab-X和Ab-Y被定義為是交叉阻斷的。
[0317]用于確定針對靶標(biāo)的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié) 合試劑是否如本文定義那樣交叉阻斷、能夠交叉阻斷、競爭性結(jié)合或是交叉競爭性的其他 方法記述在，例如，Xiao-Chi Jia 等.（Journal of Immunological Methods(免疫學(xué)方法 雜志）288:91 _ 98, 2004), Miller 等·（Journal of Immunological Methods(免疫學(xué)方法 雜志）365:118 - 125,2011)中，和/或是本文中記述的方法（例如，參見實施例5.4)。
[0318] "表位庫并（Epitope binning) "是指使用競爭性結(jié)合測定或交叉結(jié)合測定來鑒定 能夠或不能夠同時結(jié)合靶標(biāo)（例如，PcrV)的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、 多肽或其他結(jié)合試劑的成對物，由此鑒定結(jié)合靶標(biāo)上相同的或重疊的表位的免疫球蛋白、 抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑。
[0319] 因此，"表位庫"用在本說明書中是具有相同或重疊結(jié)合特異性的免疫球蛋白、抗 體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑的家族。如上文所述，免疫球蛋白、抗 體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑向表位庫的分選是基于所述免疫球蛋 白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑對抗原結(jié)合的交叉-競爭（交 叉-阻斷）。所述交叉-競爭（交叉-阻斷）測定分析所述免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑與抗原的同時結(jié)合（配對）并且將具有相似的配對模 式（profile)的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、多肽或其他結(jié)合試劑分組在 一起。具有相似模式（即，屬于同一表位庫）的免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域、多肽或其他結(jié)合試劑可以結(jié)合相同的、緊密相關(guān)的和/或重疊的表位。
[0320] 如果它對于兩種不同的抗原或抗原決定簇是特異性的（如本文定義），則認(rèn)為氨 基酸序列對于這兩種不同的抗原或抗原決定簇（諸如例如，來源于兩種不同的哺乳動物物 種的血清白蛋白，諸如例如，人血清白和食蟹猴（cyno)血清白蛋白，諸如，例如，來源于不 同的銅綠假單胞菌菌株的PcrV)是"交叉反應(yīng)性的"。
[0321] 術(shù)語"PcrV"用在本文中是指在銅綠假單胞菌（P. aeruginosa)的III型分泌系統(tǒng) (TTSS)中存在的針狀蛋白PcrV。
[0322] 術(shù)語本發(fā)明的多肽的"功效"用在本文中是發(fā)生其特定的作用所需要的本發(fā)明的 多肽的量的函數(shù)。其簡單地測量為所述多肽的IC 5(I的倒數(shù)（inverse)。其是指本發(fā)明所述的 多肽中和銅綠假單胞菌的能力；諸如調(diào)節(jié)、抑制和/或防止銅綠假單胞菌的傳染性，調(diào)節(jié)、 抑制和/或防止銅綠假單胞菌對宿主的定殖，調(diào)節(jié)、抑制和/或防止銅綠假單胞菌的TTSS 毒力機制，調(diào)節(jié)、抑制和/或防止銅綠假單胞菌向宿主細(xì)胞注入各種外毒素，調(diào)節(jié)、抑制和/ 或防止銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞膜滲透性的孔-介導(dǎo)的增加，調(diào)節(jié)、抑制和/或防止 銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的寬泛的細(xì)胞防御反應(yīng)和/或調(diào)節(jié)、抑制和/或防止銅綠假單胞菌誘導(dǎo) 的組織-損傷性炎癥的引發(fā)。功效可以通過本領(lǐng)域已知的或本文所述的任意適當(dāng)?shù)臏y定 來測量，諸如，例如，體外細(xì)胞毒性測定（例如，如Frank等.，The Journal of infectious diseases (傳染病雜志）186:64-73, 2002 ;Vance 等· Infection and Immunity (傳染和免 疫性）73:1706-1713, 2005 ;E1 Solh 等· Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178:513-519, 2008 ; 和/或?qū)嵤├糠炙龅募?xì)胞毒性測定）和/或體內(nèi)測定（例如，Secher等.，Journal of Antimicrobial Chemotherapy(抗微生物化療雜志）66:1100-1109, 2011所述的急性小鼠 模型）。
[0323] 與之相反，本發(fā)明的多肽的"功效"測量在飽和的多肽濃度下效果本身的最大強 度。功效表示可由本發(fā)明的多肽獲得的最大響應(yīng)。其是指多肽產(chǎn)生需要的（治療）作用的 能力。
[0324] 本發(fā)明的多肽的"半衰期"通常可以如WO 08/020079中第57頁段〇)中所述和 如本文提及那樣定義，是指所述多肽的血清濃度在體內(nèi)減少50%所花費的時間，例如，由 于所述多肽的降解和/或通過天然機制對所述多肽的清除或螯合（sequestration)導(dǎo)致 減少。本發(fā)明的多肽的體內(nèi)半衰期可以以本身已知的任何方式確定，諸如通過藥物代謝 動力學(xué)分析確定。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的，并且例如，可以通常如 W008/020079中第57頁段〇)中所述。在W0 08/020079中第57頁段〇)中還提到，半衰期可 以用參數(shù)如tl/2-a、tl/2-0和曲線下面積（AUC)表示。例如，參考標(biāo)準(zhǔn)手冊，如Kenneth 等.(Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists (藥 物的化學(xué)穩(wěn)定性：藥劑師手冊），J〇hn Wiley&Sons Inc，1986)以及M Gibaldi和D Perron ("Pharmacokinetics (藥物代謝動力學(xué)）〃，Marcel Dekker，第 2 修訂版，1982)。術(shù) 語"半衰期增加"或"增加的半衰期"也如W0 08/020079中第57頁段〇)中定義，并且特別 是指tl/2-β的增加，具有或不具有tl/2-α和/或AUC或二者的增加。
[0325] 除非另外指明，術(shù)語"免疫球蛋白"一一不管其在本文中用來指重鏈抗體還是常規(guī) 的4-鏈抗體一一用作一般術(shù)語，包括完整大小的抗體、其單獨的鏈、及其所有部分、結(jié)構(gòu)域 或片段（包括但不限于抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段，分別諸如Vhh結(jié)構(gòu)域或V H/\結(jié)構(gòu)域）。
[0326] 術(shù)語（多肽或蛋白的）"結(jié)構(gòu)域"用在本文中是指折疊的蛋白結(jié)構(gòu)，其具有獨立于 所述蛋白的其余部分保持其三級結(jié)構(gòu)的能力。通常，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白的獨立的功能特性， 并且在多種情形中可以添加、去除或轉(zhuǎn)移到其他蛋白上，而不失去所述蛋白的其余部分和/ 或所述結(jié)構(gòu)域的功能。
[0327] 術(shù)語"免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域"用在本文中是指抗體鏈（諸如例如，常規(guī)4-鏈抗體或 重鏈抗體的鏈）的球狀區(qū)域，或是基本上由所述球狀區(qū)域組成的多肽。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 的特征在于，其保留抗體分子特有的免疫球蛋白折疊，其由以兩個β_折疊排列的約七個 反向平行的β -鏈的兩層夾心組成，任選地通過保守的二硫鍵穩(wěn)定。
[0328] 術(shù)語"免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域"用在本文中意指基本上由四個"構(gòu)架區(qū)"組成的免 疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，所述四個構(gòu)架區(qū)在本領(lǐng)域和本文下文中分別稱為"構(gòu)架區(qū)1"或"FR1"； "構(gòu)架區(qū)2"或"FR2";"構(gòu)架區(qū)3"或"FR3";和"構(gòu)架區(qū)4"或"FR4";所述構(gòu)架區(qū)通過三個"互 補補決定區(qū)"或"CDRs"中斷，所述互補補決定區(qū)在本領(lǐng)域和本文下文中分別稱為"互補補決 定區(qū)1"或"CDR1Y'互補補決定區(qū)2"或"CDR2";和"互補補決定區(qū)3"或"CDR3"。因此，免疫 球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的一般結(jié)構(gòu)或序列可以表示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。 正是免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域通過攜帶抗原-結(jié)合位點而賦予抗體針對抗原的特異性。
[0329] 術(shù)語"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域"可與"單可變結(jié)構(gòu)域"互換使用，其定義這樣的 分子，其中抗原結(jié)合位點存在于單個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中并且由單個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域形 成。這使得免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與"常規(guī)的"免疫球蛋白或其片段分開，在"常規(guī)的"免 疫球蛋白或其片段中兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，特別是兩個可變結(jié)構(gòu)域相互作用形成抗原結(jié) 合位點。典型地，在常規(guī)的免疫球蛋白中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域（VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（VL)相 互作用形成抗原結(jié)合位點。在這一情形中，VH與VL二者的互補性決定區(qū)（CDRs)將促成抗 原結(jié)合位點，即，總共有6個CDRs將參與抗原結(jié)合位點的形成。
[0330] 考慮到上述定義，常規(guī)4-鏈抗體（如IgG，IgM，IgA，IgD或IgE分子；本領(lǐng)域中是 已知的）或來源于所述常規(guī)4-鏈抗體的Fab片段，F(xiàn)(ab'）2片段，F(xiàn)v片段，如二硫鍵連接 的Fv或scFv片段，或雙抗體（均為本領(lǐng)域已知的）的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常不被認(rèn)為是 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，原因在于，在這些情形中，與抗原的各個表位結(jié)合通常不通過一 個（單個）免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)生，而是通過一對（締合的）免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域如輕鏈和 重鏈可變結(jié)構(gòu)域發(fā)生，即，通過免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的VH-VL對發(fā)生，它們共同結(jié)合所述各個 抗原的表位。
[0331] 相反，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域能夠在不與另外的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域配對的 條件下特異性結(jié)合抗原的表位。免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點由單個VH/VHH或VL 結(jié)構(gòu)域形成。因此，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點由不超過三個CDRs形成。
[0332] 因此，所述單可變結(jié)構(gòu)域可以是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，VL-序列）或其適當(dāng) 的片段；或重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，VH-序列或VHH序列）或其適當(dāng)?shù)钠危恢灰淠?夠形成單抗原結(jié)合單元（即，基本上由單可變結(jié)構(gòu)域組成的功能性抗原結(jié)合單元，以使所 述單抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不需要與另一個可變結(jié)構(gòu)域相互作用來形成功能性抗原結(jié)合單元）。
[0333] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域序 列（例如，VH-序列）；更具體地，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是來源于常規(guī)4-鏈抗 體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或是來源于重鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
[0334] 例如，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是（單）結(jié)構(gòu)域抗體（或適于用作（單） 結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸），"dAb"或dAb (或適于用作dAb的氨基酸）或納米抗體（如本文定 義，并且包括但不限于VHH);其他單可變結(jié)構(gòu)域，或其任意一種的任何適當(dāng)?shù)钠巍?br> [0335] 特別地，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是納米抗體? (如本文定義）或其適 當(dāng)?shù)钠?。[注意：納米抗體? ( Nanobody?)，納米抗體? ( Nanobodies? )和納米 克隆龍（Nanoclone?)為埃博靈克斯股份有限公司（Ablynx N.V.)的注冊商標(biāo)]。關(guān) 于納米抗體的一般描述，參考下文的進一步描述，以及本文引用的現(xiàn)有技術(shù)，如例如，在W0 08/020079 (第16頁）中所述。
[0336] "VHH結(jié)構(gòu)域"，還稱為VHHs，VhH結(jié)構(gòu)域，VHH抗體片段，和VHH抗體，最初被描述為 "重鏈抗體"（即，"缺乏輕鏈的抗體";Hamers-Casterman等· Nature (自然）363:446-448， 1993)的抗原結(jié)合免疫球蛋白（可變）結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)選擇術(shù)語"VHH結(jié)構(gòu)域"來將這些可變 結(jié)構(gòu)域與在常規(guī)的4-鏈抗體中存在的重鏈可變結(jié)構(gòu)域（其在下文中叫作"V H結(jié)構(gòu)域"或"VH 結(jié)構(gòu)域"）區(qū)分，以及與在常規(guī)4-鏈抗體中存在的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（其在下文中叫作"VL 結(jié)構(gòu)域"或"VL結(jié)構(gòu)域"）區(qū)分。關(guān)于VHH' s和納米抗體的進一步描述，參考Muyldermans 的綜述論文（Reviews in Molecular Biotechnology (分子生物技術(shù)綜述）74:277_302， 2001)，以及參考下述作為一般【背景技術(shù)】提到的專利申請：Vrije Universiteit Brussel 的 TO 94/04678，W0 95/04079 和 TO 96/34103 ;Unilever 的 TO 94/25591，TO 99/37681， TO 00/40968, TO 00/43507, TO 00/65057, TO 01/40310, TO 01/44301，EP 1134231 和 TO 02/48193 ;Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的 TO 97/49805,TO 01/21817， TO 03/035694，W003/054016 和 W0 03/055527 ;Algonomics N.V.和埃博靈克斯股份有限公 司（Ablynx N.V.)的W0 03/050531 ;加拿大國家研究委員會（National Research Council of Canada)的TO 01/90190 ;抗體研究所（Institute of Antibodies)的TO 03/025020( = EP1433793);以及埃博靈克斯股份有限公司的W0 04/041867, W0 04/041862, TO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, W006/122786, WO 06/122787和WO 06/122825,和埃博靈克斯股份有限公司的其他公布的 專利申請。還參考這些申請中提及的進一步的現(xiàn)有技術(shù)，特別是在國際申請W0 06/040153 第41-43頁提及的參考文獻(xiàn)列表，該列表和參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合于此。如在這些參考文 獻(xiàn)中所述，納米抗體（特別是VHH序列和部分人源化的納米抗體）可以特別地特征在于在 一個或多個構(gòu)架序列中存在一個或多個"標(biāo)志殘基"。關(guān)于納米抗體的進一步的描述，包括 納米抗體的人源化和/或駱駝源化，以及其他修飾，部分或片段，衍生物或"納米抗體融合 體"，多價構(gòu)建體（包括接頭序列的一些非限制性的實例）和增加納米抗體的半衰期的不同 的修飾以及其制劑，例如，可見于W0 08/101985和W0 08/142164。關(guān)于納米抗體的進一步 的一般描述，參考本文引用的現(xiàn)有技術(shù)，如例如，記述在WO 08/020079(第16頁）中。
[0337] "結(jié)構(gòu)域抗體（Domain antibodies) "，還稱為〃Dab〃s，"結(jié)構(gòu)域抗體（Domain Antibodies) "，和 "dAbs"（術(shù)語"結(jié)構(gòu)域抗體"和 "dAbs" 被 GlaxoSmithKline 集團公司 (GlaxoSmithKline group of companies)用作商標(biāo)）已經(jīng)記述在，例如，EP0368684，Ward 等·（Nature (自然）341:544_546,1989), Holt 等.（Tends in Biotechnology (生物技術(shù) 趨勢）21:484-490, 2003)和 TO 03/002609 中，以及在，例如 TO 04/068820，TO 06/030220， W0 06/003388中，和在Domantis Ltd.的其他公布的專利申請中。結(jié)構(gòu)域抗體基本上對應(yīng) 于非駱駝科哺乳動物、特別是人4-鏈抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域。為了結(jié)合作為單抗原結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的表位，即，不分別與VL或VH結(jié)構(gòu)域配對，需要對所述抗原結(jié)合特性的特異性選擇，例 如，通過使用人單VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的文庫進行。如同VHHs，結(jié)構(gòu)域抗體具有約13至約 16kDa的分子量，并且，如果來源于完整的人序列，對于例如在人中的治療應(yīng)用，不需要人源 化。
[0338] 還應(yīng)該注意到，盡管由于它們不是哺乳動物來源的而在本發(fā)明的情形中較不優(yōu) 選，但是單可變結(jié)構(gòu)域可以來源于某些鯊魚（shark)物種（例如，所謂的"IgNAR結(jié)構(gòu)域"， 參見例如W0 05/18629)。
[0339] 因此，在本發(fā)明的意思內(nèi)，術(shù)語"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域"或"單可變結(jié)構(gòu)域"包 括來源于非人來源的多肽，優(yōu)選來源于駱駝科動物的多肽，優(yōu)選駱駝重鏈抗體。其可以被 人源化，如之前所述。并且，該術(shù)語包括來源于非駱駝科動物來源的多肽，例如來源于小鼠 或人的多肽，其已被"駱駝源化"，如例如，記述在Davies和Riechmann (FEBS339:285-290， 1994 ;Biotechnol.(生物技術(shù)）13:475-479,1995 ;Prot. Eng.(蛋白質(zhì)工程）9:531-537， 1996)以及 Riechmann 和 Muyldermans (J. Immunol. Methods (免疫學(xué)方法雜志）231:25-38, 1999)中。
[0340] VHH結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基按照Kabat等（"Sequence of proteins of immunological interest(免疫學(xué)感興趣的蛋白的序列）"，美國公眾健康服務(wù)中心（US Public Health Services),NIH Bethesda,MD,出版 Νο·91)給出的關(guān)于 \^結(jié)構(gòu)域的通用編 號方式進行編號，如例如在Riechmann和Muyldermans (J. Immunol. Methods (免疫學(xué)方法雜 志）231:25-38,1999)的圖2所示，這種編號方式用于來自駱駝科動物的VHH結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng) 域中已知用于編號V H結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的備選方法，所述方法也可以以類似的方式用于 VHH結(jié)構(gòu)域。然而，在本說明書、權(quán)利要求書和附圖中，除非另外指明，遵循用于上述VHH結(jié) 構(gòu)域的根據(jù)Kabat的編號方式。
[0341] 應(yīng)該注意--如關(guān)于VH結(jié)構(gòu)域和VHH結(jié)構(gòu)域在本領(lǐng)域是公知的--每個CDRs中 的氨基酸殘基的總數(shù)可以不同，并且可以不與Kabat編號方式所示的氨基酸殘基的總數(shù)相 對應(yīng)（即，在實際序列中，按照Kabat編號方式的一個或多個位置可能不被占據(jù)，或者實際 序列可能包含比由Kabat編號方式允許的數(shù)目更多的氨基酸殘基）。這意味著，通常，按照 Kabat的編號方式可能與或可能不與實際序列中的氨基酸殘基的實際編號方式相對應(yīng)。VH 結(jié)構(gòu)域和VHH結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基的總數(shù)通常在110-120的范圍內(nèi)，通常在112-115的范 圍內(nèi)。然而，應(yīng)該注意，更短或更長的序列也可以適用于本文所述的目的。
[0342] ⑶R區(qū)的確定也可以按照不同的方法進行。在Kabat所述的⑶R確定中，VHH的 FR1包含位置1-30的氨基酸殘基，VHH的⑶R1包含位置31-35的氨基酸殘基，VHH的FR2 包含位置36-49的氨基酸，VHH的⑶R2包含位置50-65的氨基酸殘基，VHH的FR3包含位置 66-94的氨基酸殘基，VHH的⑶R3包含位置95-102的氨基酸殘基，并且VHH的FR4包含位 置103-113的氨基酸殘基。
[0343] 然而，在本申請中，CDR序列按照Kontermann和Diibel (編，Antibody Engineering(抗體改造），vol2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin,第 3 章，pp. 33-51，2010)確定。按照這種方法，F(xiàn)R1包含位置1-25的氨基酸殘基，CDR1包含位 置26-35的氨基酸殘基，F(xiàn)R2包含位置36-49的氨基酸，⑶R2包含位置50-58的氨基酸殘 基，F(xiàn)R3包含位置59-94的氨基酸殘基，⑶R3包含位置95-102的氨基酸殘基，并且FR4包含 位置103-113的氨基酸殘基。
[0344] 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域如結(jié)構(gòu)域抗體和納米抗體（包括VHH結(jié)構(gòu)域）可以進行 人源化。特別地，人源化的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，如納米抗體（包括VHH結(jié)構(gòu)域）可以 是通常如前述段落中定義的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，但是其中存在至少一個是人源化取 代（如本文定義）和/或?qū)?yīng)于人源化取代的氨基酸殘基（特別地，在至少一個構(gòu)架殘基 中）?？梢赃@樣確定潛在有用的人源化取代：通過比較天然存在的V HH序列的構(gòu)架區(qū)的序列 與一種或多種密切相關(guān)的人VH序列的相對應(yīng)的構(gòu)架序列，之后可以向所述V HH序列中引入 這樣確定的一個或多個潛在有用的人源化取代（或其組合）（以本身已知的任何方式，如本 文進一步所述），并且可以檢測所得到的人源化的V HH序列針對靶標(biāo)的親和力，穩(wěn)定性，表達(dá) 的容易性和水平，和/或其他需要的特性。以這種方式，通過利用有限的試驗和誤差程度， 熟練的技術(shù)人員可以確定其他適當(dāng)?shù)娜嗽椿〈ɑ蚱溥m當(dāng)?shù)慕M合）。此外，基于前述內(nèi) 容，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，諸如納米抗體（包括VHH結(jié)構(gòu)域）（的構(gòu)架區(qū)）可以是部分 人源化的或完全人源化的。
[0345] 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域如結(jié)構(gòu)域抗體和納米抗體（包括VHH結(jié)構(gòu)域和人源化的 VHH結(jié)構(gòu)域），還可以通過在一個或多個⑶Rs的氨基酸序列中引入一個或多個改變而進行 親和力成熟，與各自的母體分子相比，所述改變使得所產(chǎn)生的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針 對其各自的抗原的親和力提高。本發(fā)明的親和力成熟的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域分子可以 通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如，如Marks等·（Biotechnology (生物技術(shù)）10:779-783， 1992)，Barbas 等.（Proc.Nat. Acad. Sci，USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報）91:3809-3813， 1994) ，Shier 等·（Gene(基因）169:147-155,1995)，Yelton 等·（Immunol.(免疫 學(xué)）155:1994-2004，1995)，Jackson 等.（J. Immunol.(免疫學(xué)雜志）154:3310-9， 1995) ，Hawkins 等·（J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志）226:889896,1992)，Johnson 與 Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display (使用噬菌體展不的 抗體親和力成熟），Oxford University Press (牛津大學(xué)出版社），1996)所述。
[0346] 由免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域如結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體起始設(shè)計/選擇和/或制備 多肽的方法在本文中還稱為"格式化（formatting) "所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；并且 組成多肽的一部分的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是"格式化的"或采用所述多肽的"格 式"。基于本發(fā)明的公開內(nèi)容，熟練的技術(shù)人員將清楚免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以被格式 化的方法實例以及所述格式的實例；并且所述格式化的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域形成本發(fā) 明的另一個方面。
[0347] 例如，并且非限制性地，一個或多個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以用作"結(jié)合單 元"、"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"結(jié)構(gòu)單元"（這些術(shù)語可互換使用）來制備多肽，所述多肽任選地可 以包含一個或多個可以作為結(jié)合單元的其他免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（即，針對PcrV上同 一個的或另一個表位和/或針對一個或多個不同于PcrV的其他抗原、蛋白或靶標(biāo)）。
[0348] 單價多肽僅包含一個結(jié)合單元（如例如，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域）或基本上僅 由一個結(jié)合單元（如例如，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域）組成。包含兩個以上結(jié)合單元（如 例如，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域）的多肽在本文中還稱為"多價"多肽，并且存在于所述多 肽中的結(jié)合單元/免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域在本文中還稱為是"單價形式"的。例如，"二 價"多肽可以包含兩個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其任選地通過一個接頭序列連接，而"三 價"多肽可以包含三個免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其任選地通過兩個接頭序列連接；等等。
[0349] 在多價肽中，所述兩個以上的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是相同的或不同的， 并且可以是針對相同的抗原或抗原決定簇（例如，針對相同的部分或表位或針對不同的部 分或表位），或者可以備選地針對不同的抗原或抗原決定簇；或其任意適當(dāng)?shù)慕M合。包含 至少兩個結(jié)合單元的多肽（如例如，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域），其中至少一個結(jié)合單元是 針對第一抗原（即，PcrV)并且至少結(jié)合單元是針對第二抗原（即，不同于PcrV)，也稱為 "多特異性"多肽，并且存在于所述多肽中的所述結(jié)合單元（如例如，免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域）在本文中也稱為是"多特異性格式"的。因此，例如，本發(fā)明的"雙特異性"多肽是這 樣的多肽，其包含至少一個針對第一抗原（即，PcrV)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和至少一 個針對第二抗原（即，不同于PcrV)的其他免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，而本發(fā)明的"三特異 性"多肽是這樣的多肽，其包含至少一個針對第一抗原（即，PcrV)的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域，至少一個針對第二抗原（即，不同于PcrV)的其他免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，和至少 一個針對第三抗原（即，不同于PcrV和第二抗原）的其他免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；等等。
[0350] "多互補位多肽"，諸如，例如，"二互補位多肽"或"三互補位多肽"，包含兩個以上 分別具有不同的互補位（其如本文進一步所述；參見本發(fā)明的多價多肽章節(jié)）的結(jié)合單元 或基本上由兩個以上分別具有不同的互補位（其如本文進一步所述；參見本發(fā)明的多價多 肽章節(jié)）的結(jié)合單元組成。
[0351] 本發(fā)明的單價多狀
[0352] 本發(fā)明提供特別適于結(jié)合PcrV的氨基酸殘基的片段（SEQ ID NOs: 20-37, SEQ ID N0s:38-56和SEQ ID N0s:57-75;表A-6)。這些氨基酸殘基的片段可以存在于，和/或可以 結(jié)合在本發(fā)明的多肽中，特別是以它們形成本發(fā)明的多肽的抗原結(jié)合位點（的一部分）的 形式進行。這些氨基酸殘基片段已經(jīng)產(chǎn)生為針對PcrV的重鏈抗體或VHH序列的⑶R序列。 這些氨基酸殘基片段在本文中還稱為"本發(fā)明的CDR序列"（即，分別稱為"本發(fā)明的CDR1 序列"、"本發(fā)明的⑶R2序列"和"本發(fā)明的⑶R3序列"）。
[0353] 然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明在其最廣泛意義上不限于這些氨基酸殘基片段可能在 本發(fā)明的多肽中具有的特定的結(jié)構(gòu)作用或功能，只要這些氨基酸殘基片段允許本發(fā)明的多 肽以特定的親和力和效力（如本文定義）結(jié)合PcrV。因此，通常，本發(fā)明在其最廣泛意義上 提供這樣的單價多肽（在本文中還稱為"本發(fā)明的單價多肽"），其能夠以特定指定的親和 力、抗體親抗原性、功效和/或效力結(jié)合PcrV，并且其包含一種或多種本文所述的CDR序列， 并且特別是兩種以上所述CDR序列的組合，所述CDR序列通過一個或多個其他的氨基酸序 列適當(dāng)?shù)乇舜诉B接，以使整個多肽形成能夠與PcrV結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或結(jié)合單元。然 而，還應(yīng)該注意，在本發(fā)明的單價多肽中僅存在一個所述CDR序列可能本身已經(jīng)足以為本 發(fā)明的單價多肽提供與PcrV結(jié)合的能力；例如，同樣參考W0 03/050531中所述的所謂"加 速片段（Expedite fragments)，'。
[0354] 因此，在一個具體而非限制性方面，本發(fā)明的單價多肽可以包含至少一個選自由 以下組成的組的氨基酸殘基片段：
[0355] -CDR1 序列：
[0356] a)SEQ ID NOs :20-37 ；
[0357] b)與SEQ ID N0s:20_37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列的片段；
[0358] c)與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列的片段；
[0359] 和 / 或
[0360] -CDR2 序列：
[0361] d)SEQ ID NOs :38-56 ；
[0362] e)與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列的片段；
[0363] f)與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列的片段；
[0364] 和 / 或
[0365] -CDR3 序列：
[0366] g)SEQ ID NOs :57-75 ；
[0367] h)與SEQ ID N0s:57_75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列的片段；
[0368] i)與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列的片段。
[0369] 包含一個或多個上文指定的氨基酸殘基片段的單價多肽顯示出改善的特性，諸如 例如，改善的結(jié)合特征（適當(dāng)?shù)販y量的和/或表示為K D_值（實際的或表觀的），KA-值（實 際的或表觀的），速率和/或kWiS-速率，或備選地表示為IC 5(I值，如本文進一步所 述），改善的親和力和/或改善的針對PcrV的抗體親抗原性和/或改善的中和PcrV的功效 和/或效力。
[0370] 更具體地，本發(fā)明的包含一個或多個上文指定的氨基酸殘基片段的單價多肽可以 以這樣的親和力（適當(dāng)?shù)販y量的和/或表示為K D_值（實際的或表觀的），KA_值（實際的 或表觀的），速率和/或kWiS -速率，或備選地表示為IC5(I值，如本文進一步所述） 結(jié)合蛋白PcrV，優(yōu)選地以使其：-以1000nM-lnM或更小，優(yōu)選100nM-lnM或更小，更優(yōu)選 15nM-lnM，或甚至10nM-lnM或更小的解離常數(shù)（KD)與PcrV結(jié)合；
[0371] 和/或以使其：
[0372] -以104Μ?至約107Μ?優(yōu)選105Μ?至107Μ?更優(yōu)選約10 6Μ?或更大的 k結(jié)合-速率與PcrV結(jié)合；
[0373] 和/或以使其：
[0374] -以= 0.69s)至ΙΟΛΓ1 (提供具有多天的t1/2的幾乎不可逆的復(fù)合 體），優(yōu)選1〇?至1〇?或更低的kWiS速率與PcrV結(jié)合。
[0375] 關(guān)于本發(fā)明的單價多肽與PcrV結(jié)合的一些優(yōu)選的IC5Q值通過本文進一步的描述 和實施例而變得清楚。
[0376] 確定IC5(I的測定包括在ELISA中的結(jié)合，或更優(yōu)選地，在細(xì)胞毒性測定中，如在 Frank 等·（The Journal of infectious diseases (傳染病雜志）186:64-73, 2002)，Vance 等.（Infection and Immunity(傳染和免疫性）73:1706-1713, 2005)，E1 Solh 等.（Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178:513-519, 2008)所述的TTSS-依賴性的細(xì)胞毒性測定中，在 這些測定的修改版本（諸如例如在實施例4. 4中所述），或在如實施例7. 2所述的使用人肺 表皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）的細(xì)胞毒性測定中及其修改版本中的結(jié)合。
[0377] 例如，在使用平均Μ0Ι為2. 8的P3X63細(xì)胞作為靶標(biāo)的TTSS-依賴性細(xì)胞毒性測 定中，本發(fā)明的單價多肽可以具有InM至10000nM，5nM至ΙΟΟΟηΜ，優(yōu)選5nM至500nM，更優(yōu) 選5nM至200nM，諸如5nM至50nM或更小的IC50值。
[0378] 在所述TTSS-依賴性細(xì)胞毒性測定中，本發(fā)明的單價多肽可以具有50%以上，優(yōu) 選90%以上，如100%的功效抑制；參見實施例4. 4)。
[0379] 特別地，本發(fā)明的單價多肽可以是包含一個抗原結(jié)合位點的單價多肽，其中所述 抗原結(jié)合位點包含至少一個選自由上述CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列（或其任意適當(dāng) 的組合）組成的組的氨基酸殘基片段。然而，在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的單價多肽包含 多于一個，諸如兩個以上選自由以下組成的組的氨基酸殘基片段：本發(fā)明的CDR1序列，本 發(fā)明的CDR2序列，和/或本發(fā)明的CDR3序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的單價多肽包含三個分別選 自由以下組成的組的氨基酸殘基片段：本發(fā)明的CDR1序列，本發(fā)明的CDR2序列，和本發(fā)明 的CDR3序列。本文提及關(guān)于本發(fā)明的單價多肽是優(yōu)選的CDR' s的組合列在表A-6中。
[0380] 應(yīng)該注意，本發(fā)明不限制本發(fā)明的單價多肽的來源（或用于表達(dá)其的本發(fā)明的核 酸的來源），也不限制產(chǎn)生或獲得（或已經(jīng)產(chǎn)生或獲得）本發(fā)明的單價多肽或核酸的方式。 因此，本發(fā)明的單價多肽可以是天然存在的單價多肽（來源于任何適當(dāng)?shù)奈锓N）或是合成 的或半合成的單價多肽。
[0381] 此外，技術(shù)人員還應(yīng)該清楚，可以將上文提及的一個或多個⑶R's "移植"到其他 "支架"上，所述支架包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架。用于所述CDR移植的適當(dāng) 的支架和技術(shù)是技術(shù)人員所清楚的，并且在本領(lǐng)域中是公知的，例如，參見US7, 180, 370, W0 01/27160, EP0605522, EP0460167, US7, 054, 297, Nicaise 等·（Protein Science (蛋白質(zhì)科 學(xué)）13:1882_1891，2〇04)，Ewert 等·（Methods(方法）34:184-1"，2〇04)，Kettleborough 等·（Protein Eng.(蛋白質(zhì)工程）4:773-783, 1991)，0' Brien 和 Jones (Methods Mol. Biol.(分子生物學(xué)方法）207:81-100, 2003)，Skerra(J. Mol. Recognit.(分 子識別雜志）13:167-187,2000)和Saerens等·（J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜 志）352:597-607, 2005)以及其中引用的其他參考文獻(xiàn)。例如，用于將小鼠或大鼠⑶R's 移植到人構(gòu)架和支架上的本身已知的技術(shù)可以以類似的方式使用，以提供包含一種或多種 本文關(guān)于本發(fā)明的單價多肽定義的CDR序列和一種或多種人構(gòu)架區(qū)或序列的嵌合蛋白。用 于呈遞氨基酸序列的適當(dāng)?shù)闹Ъ苁羌夹g(shù)人員所清楚的，并且例如，包括，但不限于，基于或 來源于免疫球蛋白的結(jié)合支架（即，不同于本文已經(jīng)描述的免疫球蛋白序列），來源于蛋白 A結(jié)構(gòu)域的蛋白支架（諸如Affibodies?)，淀粉酶抑肽（tendamistat)，纖連蛋白，脂籠蛋 白，CTLA-4, T-細(xì)胞受體，設(shè)計的錨蛋白重復(fù)序列，avimers和PDZ結(jié)構(gòu)域（Binz等.Nat. Biotech.(自然生物技術(shù)），23:1257, 2005)，和基于DNA或RNA的結(jié)合部分，包括但不限 于 DNA 或 RNA 適體（Ulrich 等· Comb. Chem. High Throughput Screen (組合化學(xué)高通量篩 選）9:619-32,2006)。
[0382] 在本發(fā)明所述的單價多肽中，所述CDR' s可以連接到其他氨基酸序列上和/或可 以通過氨基酸序列彼此連接，其中所述氨基酸序列優(yōu)選是構(gòu)架序列或者是作用為構(gòu)架序列 的氨基酸序列，或者一起形成呈遞所述CDR' s的支架。
[0383] 按照一個優(yōu)選的但非限制性的實施方案，本發(fā)明的單價多肽包含連接到至少 兩個構(gòu)架序列上的至少三個⑶R序列，其中優(yōu)選地，所述三個⑶R序列中的至少一個是 ⑶R3序列，其余兩個⑶R序列是⑶R1或⑶R2序列，并且優(yōu)選地是一個⑶R1序列和一個 CDR2序列。按照一個特別優(yōu)選的但非限制性的實施方案，本發(fā)明的單價多肽具有結(jié)構(gòu)： FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,其中CDR1、CDR2和CDR3如本文關(guān)于本發(fā)明的單價多肽 定義，并且FR1、FR2、FR3和FR4是構(gòu)架序列。在所述本發(fā)明的單價多肽中，所述構(gòu)架序列可 以是任意適當(dāng)?shù)臉?gòu)架序列，并且適當(dāng)?shù)臉?gòu)架序列的實例將是技術(shù)人員所清楚的，例如，基于 標(biāo)準(zhǔn)手冊和本文提及的進一步的公開內(nèi)容和現(xiàn)有技術(shù)。
[0384] 因此，本發(fā)明還涉及針對PcrV的單價多肽，其基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為 FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成，其中：
[0385] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0386] a)SEQ ID N0s:20_37 的氨基酸序列；
[0387] b)與SEQ ID N0s:20_37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0388] c)與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0389] 和 / 或
[0390] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0391] d)SEQ ID NOs :38-56 的氨基酸序列；
[0392] e)與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0393] f)與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0394] 和 / 或
[0395] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0396] g)SEQ ID N0s:57-75 的氨基酸序列；
[0397] h)與SEQ ID N0s:57_75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0398] i)與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0399] 具體地，按照該優(yōu)選的但非限制性的方面，本發(fā)明涉及針對PcrV的單價多肽，其 由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成，其中 ：
[0400] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0401] a) SEQ ID NOs :20-37 的氨基酸序列；
[0402] b)與SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0403] c)與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0404] 和
[0405] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0406] d)SEQ ID NOs :38-56 的氨基酸序列；
[0407] e)與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0408] f)與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0409] 和
[0410] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0411] g)SEQ ID NOs :57-75 的氨基酸序列；
[0412] h)與SEQ ID N0s:57_75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0413] i)與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0414] 本發(fā)明還涉及這樣的單價多肽，其中所述⑶R序列與SEQ ID N0s:l-19的氨基 酸序列中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸 同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至（基本 上）100%的氨基酸同一性。
[0415] 在一個具體的但非限制性的方面，本發(fā)明的單價多肽可以是包含免疫球蛋白 折疊的單價多肽或者是在適當(dāng)?shù)臈l件下（諸如生理條件下）能夠形成免疫球蛋白折 疊（即，通過折疊）的單價多肽。尤其參考Halaby等.（J. Protein Eng.(蛋白工程雜 志）12:563-71, 1999)的綜述。優(yōu)選地，當(dāng)正確折疊形成免疫球蛋白折疊時，氨基酸殘基片 段可以能夠正確形成結(jié)合PcrV的抗原結(jié)合位點。
[0416] 因此，所述構(gòu)架序列優(yōu)選是免疫球蛋白構(gòu)架序列或已經(jīng)來源免疫球蛋白構(gòu)架序列 的構(gòu)架序列（例如，通過序列優(yōu)化，諸如人源化或駱駝源化）（的適當(dāng)?shù)慕M合）。例如，所述 構(gòu)架序列可以是來源于免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（諸如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（例如，序列）） 和/或來源于重鏈可變結(jié)構(gòu)域（例如，V H-序列）的構(gòu)架序列。在一個特別優(yōu)選的方面，所 述構(gòu)架序列是來源于VHH-序列的構(gòu)架序列（其中所述構(gòu)架序列可以任選地被部分或完全人 源化）或是已被駱駝源化的（如本文定義）常規(guī)v H序列。
[0417] 所述構(gòu)架序列可以優(yōu)選地是這樣的，以使本發(fā)明的單價多肽是免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列）；是單結(jié)構(gòu)域抗體（或適 合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸）；是"dAb"(或是適合用作dAb的氨基酸）；或是納米抗?φ.* (包括但不限于VHH)。同樣地，適當(dāng)?shù)臉?gòu)架序列應(yīng)該是技術(shù)人員所清楚的，例如，基于標(biāo)準(zhǔn)手 冊和本文提及的進一步的公開和現(xiàn)有技術(shù)。
[0418] 具體地，在本發(fā)明的單價多肽中存在的構(gòu)架序列可以包含一種或多種標(biāo)志殘基 (如W0 08/020079中定義（表A-3至A-8))，以使本發(fā)明的單價多肽是納米抗體。所述構(gòu)架 序列（適當(dāng)?shù)慕M合）的一些優(yōu)選的但非限制性的實例通過本文進一步公開將變得清楚（例 如，參見表A-6)。通常，納米抗體（特別是Vhh序列和部分人源化的納米抗體）可以特別特 征在于在一個或多個構(gòu)架序列中存在一種或多種"標(biāo)志殘基"（如例如，在W008/020079第 61頁第24行至第98頁第3行進一步所述）。
[0419] 更具體地，納米抗體可以是具有下述（通用）結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和 /或多肽：
[0420] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0421] 其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1-4,并且其中⑶R1-⑶R3分別是指互補性決定區(qū) 1-3,并且其中：
[0422] i)與SEQ ID NOs: 1-19(參見表A-4)的氨基酸序列中的至少一種具有至少80 %的 氨基酸同一性，其中為了確定氨基酸同一性的目的，忽視形成CDR序列的氨基酸殘基。在這 一方面，還參考表A-6,其列出了 SEQ ID N0s:l-19(參見表A-4)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域的構(gòu)架1序列（SEQ ID N0s:76-80),構(gòu)架2序列（SEQ ID N0s:81-93),構(gòu)架3序列（SEQ ID N0s:94-112)和構(gòu)架 4 序列（SEQ ID N0s:113-117);或
[0423] ii)表A-6所述的構(gòu)架序列的組合；
[0424] 并且其中：
[0425] iii)優(yōu)選地，在按照 Kabat 編號方式的位置 11，37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 和 108的一個或多個氨基酸殘基選自W0 08/020079的表A-3至表A-8中提及的標(biāo)志殘基。
[0426] 在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供選自SEQ ID NOs: 1-19中任一種的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域或單價多肽。
[0427] 本發(fā)明還提供與具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的任一種屬 于同一表位庫的單價多肽。因此，本發(fā)明還涉及針對PcrV的單價多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的 結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
[0428] 同樣地，所述單價多肽可以是以任何適當(dāng)?shù)姆绞絹碓从谌我膺m當(dāng)?shù)膩碓吹拿庖咔?蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，并且例如，可以是天然存在的Αν序列（即，來源于駱駝科（Camelid) 的適當(dāng)?shù)奈锓N）或是合成的或半合成的氨基酸序列，包括但不限于，"人源化的"（如本文 定義）納米抗體或VHH序列，"駱駝源化的"（如本文定義）免疫球蛋白序列（并且特別 是駱駝源化的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列），以及已經(jīng)通過下述技術(shù)獲得的納米抗體：諸如親和 力成熟（例如，由合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列起始）、CDR移植、鑲合術(shù) (veneering)、組合來源于不同的免疫球蛋白序列的片段，利用重疊的引物進行的PCR組 裝，以及專業(yè)技術(shù)人員公知的改造免疫球蛋白序列的相似技術(shù)；或如本文進一步所述的前 述任一項的任何適當(dāng)?shù)慕M合。此外，當(dāng)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包含V HH序列時，所述免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以被適當(dāng)?shù)厝嗽椿绫疚倪M一步所述，以提供一種或多種本發(fā)明 的進一步（部分或完全）人源化的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。類似地，當(dāng)免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域包含合成的或半合成的序列（諸如部分人源化的序列）時，所述免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域可以任選地被進一步適當(dāng)?shù)厝嗽椿?，同樣如本文所述，同樣提供一種或多種本發(fā) 明進一步（部分或完全）人源化的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
[0429] 本發(fā)明的這些單價多肽，并且特別是包含本發(fā)明的CDR序列的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域，特別適合用作結(jié)構(gòu)單元或結(jié)合單元用于制備多價多肽。
[0430] 因此，本發(fā)明的結(jié)合PcrV的單價多肽可以以基本上分離的形式（如本文定義）存 在，或者其可以形成蛋白或多肽的一部分，其可以包含一個或多個結(jié)合PcrV的單價多肽或 基本上由其組成，并且其可以任選地進一步包含一個或多個其他氨基酸序列（所有任選地 通過一個或多個適當(dāng)?shù)慕宇^連接）。本發(fā)明還涉及包含或基本上由一種或多種本發(fā)明的單 價多肽（或其適當(dāng)?shù)钠危┙M成的蛋白或多肽。
[0431] 所述一種或多種本發(fā)明的單價多肽由此用作所述蛋白或多肽中的結(jié)合單元或結(jié) 構(gòu)單元，以分別提供本發(fā)明的單價、多價或多互補位多肽，均如本文所述。因此，本發(fā)明還涉 及這樣的多肽，其是包含或基本上由一種本發(fā)明的單價多肽組成的單價構(gòu)建體。本發(fā)明由 此還涉及這樣的多肽，其是包含或基本上由兩種以上本發(fā)明的單價多肽組成的多價多肽， 諸如例如二價或三價多肽（關(guān)于包含一種或多種VHH結(jié)構(gòu)域的多價和多特異性多肽及其制 備，還參考Conrath等.，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志）276:7346-7350, 2001，以及參考， 例如，W0 96/34103, W0 99/23221 和 W02010/115998)。
[0432] 屬于優(yōu)詵的表位庫的免疫球蛋白
[0433] 此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)屬于特定表位庫的免疫球蛋白特別適合與PcrV結(jié)合、中和銅 綠假單胞菌和/或作為用于制備本發(fā)明的多互補位（諸如例如二互補位或三互補位）多肽 的結(jié)合單元。優(yōu)選的免疫球蛋白包括屬于表位庫1、2或3(如進一步定義）的免疫球蛋白 (諸如重鏈抗體，常規(guī)4-鏈抗體（如IgG，IgM，IgA，IgD或IgE分子），F(xiàn)ab片段，F(xiàn) (ab'）2片 段，F(xiàn)v片段，如二硫鍵連接的Fv或scFv片段，或來源于所述常規(guī)4-鏈抗體的雙抗體，其單 條鏈，以及其所有部分、結(jié)構(gòu)域或片段（包括但不限于，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段，如免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域），本發(fā)明的單價多肽或其他結(jié)合試劑）。
[0434] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及屬于表位庫1的免疫球蛋白。表位庫1包括基于 免疫球蛋白的交叉競爭（交叉阻斷）具有相同或重疊的結(jié)合特異性的免疫球蛋白的家族 (包括本發(fā)明的單價多肽）。更具體地，屬于表位庫1的免疫球蛋白交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合 被具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
[0435] 預(yù)測屬于表位庫1的免疫球蛋白結(jié)合相同的、緊密相關(guān)的和/或重疊的表位。更 具體地，屬于表位庫1的免疫球蛋白結(jié)合全長PcrV(SEQ ID N0:159)，同時表現(xiàn)出減少的 (與全長？(^相比，30_90%)或沒有（與全長？(^相比，低于30%)與嵌合體4彼〇10 N0:202)和嵌合體 6 (SEQ ID N0:204)的結(jié)合。
[0436] 優(yōu)選的屬于表位庫1的免疫球蛋白包括本發(fā)明的單價多肽（如上文定義），其中：
[0437] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0438] a) SEQ ID NOs: 22-28 的氨基酸序列；
[0439] b)與SEQ ID N0s:22_28的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0440] c)與SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0441] 和/或
[0442] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0443] d) SEQ ID NOs: 40-47 的氨基酸序列；
[0444] e)與SEQ ID N0s:40_47的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0445] f)與SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0446] 和 / 或
[0447] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0448] g) SEQ ID NOs: 59-66 的氨基酸序列；
[0449] h)與SEQ ID N0s:59_66的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0450] i)與SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0451] 更具體地，單價多肽，其中：
[0452] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0453] a) SEQ ID NOs: 22-28 的氨基酸序列；
[0454] b)與SEQ ID N0s:22_28的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0455] c)與SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0456] 和
[0457] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0458] d) SEQ ID NOs: 40-47 的氨基酸序列；
[0459] e)與SEQ ID N0s:40_47的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0460] f)與SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0461] 和
[0462] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0463] g)SEQ ID N0s:59-66 的氨基酸序列；
[0464] h)與SEQ ID N0s:59_66的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0465] i)與SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0466] 更具體地，本發(fā)明涉及屬于表位庫1的本發(fā)明的單價多肽，其中所述單價多肽的 ⑶R序列與具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具 有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸 同一性，如95 %的氨基酸同一性或更多，或甚至（基本上）100 %的氨基酸同一性。
[0467] 本發(fā)明優(yōu)選的屬于表位庫1的單價多肽選自SEQ ID NOs:3_10中的任一種。
[0468] 在另一個方面中，本發(fā)明涉及屬于表位庫2的免疫球蛋白。表位庫2包括基于免疫 球蛋白的交叉競爭（交叉阻斷）具有相同或重疊的結(jié)合特異性的免疫球蛋白的家族（包括 本發(fā)明的單價多肽）。更具體地，屬于表位庫2的免疫球蛋白交叉阻斷具有SEQ ID N0s:l 和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具 有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
[0469] 預(yù)測屬于表位庫2的免疫球蛋白結(jié)合相同的、緊密相關(guān)的和/或重疊的表位。更 具體地，屬于表位庫2的免疫球蛋白結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，同時其表現(xiàn)出減少的 (與全長PcrV相比，30-90% )或沒有（與全長PcrV相比，低于30% )與嵌合體7 (SEQ ID NO:2〇5)的結(jié)合。
[0470] 優(yōu)選的屬于表位庫2的免疫球蛋白包括本發(fā)明的單價多肽（如上文定義），其中：
[0471] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0472] a) SEQ ID NOs :20-21 的氨基酸序列；
[0473] b)與SEQ ID N0s:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0474] c)與SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0475] 和 / 或
[0476] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0477] d)SEQ ID NOs :38-39 的氨基酸序列；
[0478] e)與SEQ ID N0s:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0479] f)與SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0480] 和 / 或
[0481] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0482] g) SEQ ID NOs: 57-58 的氨基酸序列；
[0483] h)與SEQ ID N0s:57_58的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0484] i)與SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0485] 更具體地，單價多肽，其中：
[0486] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0487] a) SEQ ID NOs :20-21 的氨基酸序列；
[0488] b)與SEQ ID N0s:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0489] c)與SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0490] 和
[0491] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0492] d) SEQ ID NOs: 38-39 的氨基酸序列；
[0493] e)與SEQ ID N0s:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0494] f)與SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0495] 和
[0496] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0497] g)SEQ ID NOs :57-58 的氨基酸序列；
[0498] h)與SEQ ID N0s:57_58的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0499] i)與SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0500] 更具體地，本發(fā)明涉及屬于表位庫2的本發(fā)明的單價多肽，其中所述單價多肽的 ⑶R序列與具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具 有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸 同一性，如95 %的氨基酸同一性或更多，或甚至（基本上）100 %的氨基酸同一性。
[0501] 本發(fā)明優(yōu)選的屬于表位庫2的單價多肽選自SEQ ID NOs: 1和2中的任一種。
[0502] 在另一個方面中，本發(fā)明涉及屬于表位庫3的免疫球蛋白。表位庫3包括基于免疫 球蛋白的交叉競爭（交叉阻斷）具有相同或重疊的結(jié)合特異性的免疫球蛋白的家族（包括 本發(fā)明的單價多肽）。更具體地，屬于表位庫3的免疫球蛋白交叉阻斷具有SEQ ID N0s:ll 和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被 具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
[0503] 預(yù)測屬于表位庫3的免疫球蛋白結(jié)合相同的、緊密相關(guān)的和/或重疊的表位。更 具體地，屬于表位庫3的免疫球蛋白結(jié)合全長PcrV (SEQ ID N0:159)，同時其表現(xiàn)出減少的 (與全長PcrV相比，30-90% )或沒有（與全長PcrV相比，低于30% )與嵌合體2 (SEQ ID NO:200)的結(jié)合。
[0504] 優(yōu)選的屬于表位庫3的免疫球蛋白包括本發(fā)明的單價多肽（如上文定義），其中：
[0505] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0506] a)SEQ ID N0s:29_30 的氨基酸序列；
[0507] b)與SEQ ID N0s:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0508] c)與SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0509] 和 / 或
[0510] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0511] d)SEQ ID NOs :48-49 的氨基酸序列；
[0512] e)與SEQ ID N0s:48_49的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0513] f)與SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0514] 和/或
[0515] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0516] g)SEQ ID NOs :67-68 的氨基酸序列；
[0517] h)與SEQ ID N0s:67-68的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0518] i)與SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0519] 更具體地，單價多肽，其中：
[0520] -⑶R1選自由以下組成的組：
[0521] a) SEQ ID NOs :29-30 的氨基酸序列；
[0522] b)與SEQ ID N0s:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0523] c)與SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0524] 和
[0525] -⑶R2選自由以下組成的組：
[0526] d)SEQ ID NOs :48-49 的氨基酸序列；
[0527] e)與SEQ ID N0s:48_49的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0528] f)與SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0529] 和
[0530] -⑶R3選自由以下組成的組：
[0531] g)SEQ ID NOs :67-68 的氨基酸序列；
[0532] h)與SEQ ID N0s:67_68的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0533] i)與SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0534] 更具體地，本發(fā)明涉及屬于表位庫3的本發(fā)明的單價多肽，其中所述單價多肽的 ⑶R序列與具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列 具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基 酸同一性，如95%的氨基酸同一性或更多，或甚至（基本上）100%的氨基酸同一性。
[0535] 本發(fā)明優(yōu)選的屬于表位庫3的單價多肽選自SEQ ID NOs: 11和12中的任一種。
[0536] 本發(fā)明的多價多狀
[0537] 本發(fā)明還涉及包含或（基本上）由兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域（或其適當(dāng)?shù)钠危┙M成的多價多肽（還稱為"本發(fā)明的多價多肽"）。本發(fā)明的多價多 肽優(yōu)選地是多互補位多肽（在本文中還稱為"本發(fā)明的多互補位多肽"），諸如例如，"本發(fā) 明的二互補位多肽"或"本發(fā)明的三互補位多肽"。術(shù)語"多互補位"（抗原_)結(jié)合分子或 "多互補位"多肽用在本文中應(yīng)該意指包含至少兩種（即，兩種以上）免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域的多肽，其中"第一"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對PcrV，并且"第二"免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域針對PcrV，并且其中這些"第一"和"第二"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有不同的 互補位。因此，所述多互補位多肽包含兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或由 兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中至少一種"第一"免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域是針對PcrV上的第一表位，并且至少一種"第二"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是 針對PcrV上不同于PcrV上第一表位的第二表位。
[0538] 在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的多肽是二互補位多肽。術(shù)語"二互補位"（抗原_) 結(jié)合分子或"二互補位"多肽用在本文中應(yīng)該意指包含針對PcrV的"第一"免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域和針對PcrV的"第二"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽，其中這些"第一"和"第 二"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有不同的互補位。因此，所述二互補位多肽包含兩種以上針 對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或由兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組 成，"第一"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對PcrV上的第一表位，"第二"免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域針對PcrV上不同于PcrV上第一表位的第二表位。
[0539] 本發(fā)明的二互補位多肽表現(xiàn)出改善的特性，諸如例如，改善的結(jié)合特征（適當(dāng)?shù)?測量的和/或表示為K D_值（實際的或表觀的），KA-值（實際的或表觀的），速率和 /或klw-速率，或備選地表示為IC 5(I值，如本文進一步所述），改善的親和力和/或改善的 針對PcrV的抗體親抗原性和/或改善的中和PcrV的功效和/或效力。
[0540] 更具體地，本發(fā)明的二互補位多肽可以以這樣的親和力（適當(dāng)?shù)販y量的和/或表 示為KD_值（實際的或表觀的），K A-值（實際的或表觀的），kg@-速率和/或kWiS-速率， 或備選地表示為IC 5(I值，如本文進一步所述）結(jié)合PcrV，優(yōu)選地以使其：
[0541] -以ΙΟΟΟηΜ-ΙηΜ或更小，優(yōu)選ΙΟΟηΜ-ΙηΜ或更小，更優(yōu)選15nM_lnM,或甚至 10nM-lnM或更小的解離常數(shù)（KD)與PcrV結(jié)合；
[0542] 和/或以使其：
[0543] -以ΚΛ?至約優(yōu)選105Μ?至ΚΛ?，更優(yōu)選約ΙΟΙΥ1或更大的 k結(jié)合-速率與PcrV結(jié)合；
[0544] 和/或以使其：
[0545] -以= 0.69s)至ΙΟΛΓ1 (提供具有多天的t1/2的幾乎不可逆的復(fù)合 體），優(yōu)選1〇?至1〇?或更低的kWiS速率與PcrV結(jié)合；
[0546] 關(guān)于本發(fā)明的二互補位多肽與PcrV結(jié)合的一些優(yōu)選的IC5Q值通過本文進一步的 描述和實施例而變得清楚。
[0547] 確定IC5(I的測定包括在ELISA中的結(jié)合，或更優(yōu)選地，在細(xì)胞毒性測定中，如在 Frank 等·（The Journal of infectious diseases (傳染病雜志）186:64-73, 2002)，Vance 等.（Infection and Immunity(傳染和免疫性）73:1706-1713, 2005)，E1 Solh 等.（Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178:513-519, 2008)所述的TTSS-依賴性的細(xì)胞毒性測定中，在 該測定的修改版本（諸如例如在實施例4. 4中所述），或在如實施例7. 2所述的使用人肺表 皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）的細(xì)胞毒性測定中及其修改版本中的結(jié)合。
[0548] 例如，在使用平均Μ0Ι為12的P3X63細(xì)胞作為靶標(biāo)的TTSS-依賴性細(xì)胞毒性測定 中，本發(fā)明的二互補位多肽可以具有〇. OlnM至50nM，0. OlnM至10nM，優(yōu)選0. OlnM至5nM， 更優(yōu)選0. OlnM至InM，諸如0. OlnM至0. InM或更小的IC5Q值。
[0549] 除此之外和/或另外，在所述TTSS-依賴性的細(xì)胞毒性測定中，本發(fā)明的二互補位 多肽具有100%的功效（％抑制；參見實施例4. 4)。
[0550] 此外，本發(fā)明的二互補位多肽在存在彈性蛋白酶時表現(xiàn)為穩(wěn)定的并且保持功能 性。
[0551] 在存在銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的條件下24小時后，本發(fā)明的二互補位多肽功 效上可以具有最大10倍、優(yōu)選最大5倍、如3倍、2倍、1倍或更低的減少。在存在人嗜中 性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的條件下24小時后，本發(fā)明的二互補位多肽功效上可以具有最大100 倍、優(yōu)選最大30倍、如15倍、10倍、5倍、3倍、2倍或更低的減少。
[0552] 在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的多肽是三互補位多肽。術(shù)語"三互補位"（抗 原_)結(jié)合分子或"三互補位"多肽用在本文中應(yīng)該意指包含針對PcrV的"第一"免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域，針對PcrV的"第二"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，進而針對PcrV的"第三" 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中這些"第一"、"第二"和"第三"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具 有不同的互補位。因此，所述三互補位多肽包含三種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域或由三種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中"第一"免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域是針對PcrV上的第一表位，"第二"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是針對PcrV上不 同于PcrV上第一表位的第二表位，并且"第三"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是針對PcrV上不 同于PcrV上第一和第二表位的第三表位。
[0553] 在本發(fā)明的多互補位多肽中存在的兩種以上的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以由 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，序列）組成或由重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，V H_序列） 組成；其可以由來源于常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列組成或者由來源于重鏈抗體 的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列組成。在一個優(yōu)選的方面中，其由結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作結(jié)構(gòu)域 抗體的氨基酸）組成，由單結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸）組成，由 〃dAb〃（或適合用作dAb的氨基酸）組成或由納米抗體（包括但不限于V HH)組成。所述兩 種以上的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域由部分或完全人源化的納米抗體或部分或完全人源化 的VHH組成。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，包含在本發(fā)明的多互補位多肽中的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域是一種或多種本發(fā)明的單價多肽，如本文定義。
[0554] 在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，在本發(fā)明的多互補位（優(yōu)選二互補位或三互補位）多肽 中存在的第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域彼此不（交叉）競 爭與PcrV的結(jié)合，并且因此，屬于不同的表位庫。因此，本發(fā)明涉及包含兩種以上免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域的多互補位（優(yōu)選二互補位或三互補位）多肽，其中每種免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域?qū)儆诓煌谋砦粠臁Ｒ虼?，本發(fā)明這一優(yōu)選的多互補位（優(yōu)選二互補位或三互補 位）多肽的第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域不交叉阻斷本發(fā)明的這一優(yōu)選的多互補位（優(yōu)選 二互補位或三互補位）多肽的第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合和/或第一免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合不被第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷。
[0555] 已經(jīng)在本發(fā)明的單價多肽中鑒定了不同的表位庫（1至3)(見表B-4和B-10)。因 此，本發(fā)明涉及包含兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多互補位多肽，其中每種免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域?qū)儆诒疚亩x的不同的表位庫。在一個優(yōu)選的方面中，在本發(fā)明的多互 補位（優(yōu)選二互補位或三互補位）多肽中考慮下述兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組 合：
[0556]

【權(quán)利要求】
1. 多肽，其包含兩種以上針對PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或由兩種以上針對 PcrV的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成，其中至少一個"第一"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對 PcrV上的第一表位，和至少一個"第二"免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對不同于PcrV上的第 一表位的PcrV上的第二表位。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其在使用MOI為12的P3X63細(xì)胞作為靶標(biāo)的細(xì)胞毒性 測定中，能夠以100%的功效和以5·0χ10-10Μ或更低的IC50中和PcrV。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述的多肽，對于其，在存在銅綠假單胞菌 (P. aeruginosa)彈性蛋白酶（3ug/ug多肽）的條件下，24小時后效力減少最大5倍（例如， 5倍、3倍、2倍或以下）。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的多肽，對于其，在存在人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白 酶（l-2ug/ug多肽）條件下，24小時后的效力減少最大15倍（例如，10倍、5倍、3倍、2倍 或以下）。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽，其中所述兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域由輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，'-序列）組成或由重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，V H-序 列）組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的多肽，其中所述兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域由來源于常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列組成或者由來源于重鏈抗體的重鏈可變 結(jié)構(gòu)域序列組成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的多肽，其中所述兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域由結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸）組成，由單結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作 單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸）組成，由"dAb"(或適合用作dAb的氨基酸）組成或由納米抗體 (包括但不限于V。組成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的多肽，其中所述兩種以上免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域由部分或完全人源化的納米抗體或部分或完全人源化的VHH組成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至 少一種由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成， 其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID N0s:57-75的氨基酸序列； h) 與SEQ ID N0s:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的 至少一種由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成， 其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID NOs :20-37的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -CDR2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs :38-56的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID NOs :57-75的氨基酸序列； h) 與SEQ ID N0s:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的多肽，其中，在至少一種所述免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域中，所述⑶R序列與具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少 一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至 少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100%的氨基酸 同一I"生。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的 至少一種交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種與PcrV 的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的 至少一種交叉阻斷。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的 至少一種選自SEQ ID NOs :1-19。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的多肽，其中兩種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域都是 權(quán)利要求9-13任一項中限定的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的多肽，其中所述兩種針對PcrV的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域中的每一種屬于不同的表位庫。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的多肽，其中所述第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 不交叉阻斷所述第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合和/或其中所述第一免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合不被所述第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽，其中： -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫 2] 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種交叉阻斷； -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位 庫3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種交叉阻斷； -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1] 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 3-10的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種交叉阻斷； -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫 3] 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種交叉阻斷； -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫 1] 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 3-10的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種交叉阻斷；或 -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種交叉阻斷；并且第二免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫 2] 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種交叉阻斷。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽，其中： -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求47-53中任一項的多肽[表位庫1];并 且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求40-46中任一項的多肽[表位庫2]; -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求47-53中任一項的多肽[表位庫1];并 且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求54-60中任一項的多肽[表位庫3]; -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求40-46中任一項的多肽[表位庫2];并 且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求47-53中任一項的多肽[表位庫1]; -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求40-46中任一項的多肽[表位庫2];并 且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求54-60中任一項的多肽[表位庫3]; -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求54-60中任一項的多肽[表位庫3];并 且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求47-53中任一項的多肽[表位庫1];或 -第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求54-60中任一項的多肽[表位庫3];并 且第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求40-46中任一項的多肽[表位庫2]。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項所述的多肽，其選自SEQ ID N0s:124-141中的任一 種。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的多肽，其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域為 SEQ ID N0:12〇
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的多肽，其中第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID NOs: 1和10中的任一種。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的多肽，其選自SEQ ID NOs: 129和134中的任一種。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的多肽，其中第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域為 SEQ ID N0:1。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的多肽，其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID NOs:3和12中的任一種。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的多肽，其選自SEQ ID NOs: 129和137中的任一種。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的多肽，其中所述兩種以上針對PcrV的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域?qū)儆谙嗤谋砦粠臁?br> 27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的多肽，其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷第二免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合和/或其中第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的 結(jié)合被第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的多肽，其中： -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或第一和第二免疫球蛋白單可 變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫1] 中的至少一種交叉阻斷； -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或第一和第二免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫2]中 的至少一種交叉阻斷；或 -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫3]中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或第一和第二免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11-12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域[表位庫 3]中的至少一種交叉阻斷。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的多肽，其中： -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求47-53中任一項的多肽[表位庫 1]; -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求40-46中任一項的多肽[表位庫 2] ;或 -第一和第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域選自權(quán)利要求54-60中任一項的多肽[表位庫 3] 。
30. 根據(jù)權(quán)利要求26-29中任一項所述的多肽，其選自SEQ ID NOs: 118-123中的任一 種。
31. 根據(jù)權(quán)利要求26-30中任一項所述的多肽，其中至少一種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域是 SEQ ID N0:3。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多肽，其選自SEQ ID NOs :118, 120和121中的任一種。
33. 根據(jù)權(quán)利要求26-30中任一項所述的多肽，其中至少一種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域是 SEQ ID N0:1。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的多肽，其選自SEQ ID NOs: 122和123中的任一種。
35. 基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3) 組成的多肽，其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID NOs :20-37的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs :38-56的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID NOs:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID NOs :57-75的氨基酸序列； h) 與SEQ ID N0s:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的多肽，其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID NOs :20-37的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:20-37的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs :38-56的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID N0s:38-56的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID NOs :57-75的氨基酸序列； h) 與SEQ ID N0s:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:57-75的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35或36任一項所述的多肽，其中所述多肽的CDR序列與具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同 一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基 酸同一性或更多，或甚至基本上100%的氨基酸同一性。
38. 針對PcrV的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 1-19的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
39. 根據(jù)權(quán)利要求35-38中任一項所述的多肽，其選自SEQ ID NOs: 1-19中的任一種。
40. 根據(jù)權(quán)利要求35-39中任一項所述的多肽，其屬于表位庫2。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的多肽，其與全長PcrV(SEQ ID NO: 159)結(jié)合并且表現(xiàn)出與 嵌合體7 (SEQ ID NO: 205)減少的結(jié)合（30-90% )或不結(jié)合。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40或41任一項所述的多肽，其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID N0s:20-21的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs :38-39的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID N0s:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID NOs :57-58的氨基酸序列； h) 與SEQ ID N0s:57-58的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的多肽，其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID NOs :20-21的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:20-21的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs :38-39的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID NOs:38-39的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID N0s:57-58的氨基酸序列； h) 與SEQ ID N0s:57-58的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:57-58的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
44. 根據(jù)權(quán)利要求40-43中任一項所述的多肽，其中所述多肽的CDR序列與具有SEQ ID NOs: 1和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同 一性，優(yōu)選至少80 %的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90 %的氨基酸同一性，諸如95 %的氨基 酸同一性或更多，或甚至基本上100%的氨基酸同一性。
45. 針對PcrV的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID N0s:l和2的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
46. 根據(jù)權(quán)利要求40-45中任一項所述的多肽，其選自SEQ ID N0s:l和2。
47. 根據(jù)權(quán)利要求35-39中任一項所述的多肽，其屬于表位庫1。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的多肽，其與全長PcrV (SEQ ID NO: 159)結(jié)合并且表現(xiàn)出與 嵌合體4 (SEQ ID NO: 202)和嵌合體6 (SEQ ID NO: 204)減少的結(jié)合（30-90% )或不結(jié)合。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47或48任一項所述的多肽，其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID N0s:22-28的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:22-28的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs: 40-47的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:40-47的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID N0s:40-47的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID NOs :59-66的氨基酸序列； h) 與SEQ ID NOs :59-66的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:59-66的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的多肽，其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID N0s:22-28的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:22-28的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:22-28的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs: 40-47的氨基酸序列； e) 與SEQ ID NOs :40-47的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID NOs:40-47的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID NOs :59-66的氨基酸序列； h) 與SEQ ID NOs :59-66的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID N0s:59-66的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
51. 根據(jù)權(quán)利要求47-50中任一項所述的多肽，其中所述多肽的CDR序列與具有SEQ ID NOs :3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同 一性，優(yōu)選至少80 %的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90 %的氨基酸同一性，諸如95 %的氨基 酸同一性或更多，或甚至基本上100%的氨基酸同一性。
52. 針對PcrV的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID N0s:3-10的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 3-10的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
53. 根據(jù)權(quán)利要求47-52中任一項所述的多肽，其選自SEQ ID N0s:3-10中的任一種。
54. 根據(jù)權(quán)利要求35-39中任一項所述的多肽，其屬于表位庫3。
55. 根據(jù)權(quán)利要求54所述的多肽，其與全長PcrV (SEQ ID NO: 159)結(jié)合并且表現(xiàn)出與 嵌合體2 (SEQ ID NO: 200)的減少的結(jié)合（30-90% )或不結(jié)合。
56. 根據(jù)權(quán)利要求54或55任一項所述的多肽，其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID NOs :29-30的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs: 48-49的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:48-49的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID N0s:48-49的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID NOs :67-68的氨基酸序列； h) 與SEQ ID NOs :67-68的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的多肽，其中： -⑶R1選自由以下組成的組： a) SEQ ID NOs :29-30的氨基酸序列； b) 與SEQ ID N0s:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NOs:29-30的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R2選自由以下組成的組： d) SEQ ID NOs: 48-49的氨基酸序列； e) 與SEQ ID N0s:48-49的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； f) 與SEQ ID NOs:48-49的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R3選自由以下組成的組： g) SEQ ID NOs :67-68的氨基酸序列； h) 與SEQ ID N0s:67-68的氨基酸序列中的至少一種具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NOs:67-68的氨基酸序列中的至少一種具有3、2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
58. 根據(jù)權(quán)利要求54-57中任一項所述的多肽，其中所述多肽的CDR序列與具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種的⑶R序列具有至少70%的氨基酸 同一性，優(yōu)選至少80 %的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90 %的氨基酸同一性，諸如95 %的氨 基酸同一性或更多，或甚至基本上100%的氨基酸同一性。
59. 針對PcrV的多肽，其交叉阻斷具有SEQ ID NOs: 11和12的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域中的至少一種與PcrV的結(jié)合和/或其與PcrV的結(jié)合被具有SEQ ID NOs: 11和12的免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一種交叉阻斷。
60. 根據(jù)權(quán)利要求54-59中任一項所述的多肽，其選自SEQ ID NOs: 11和12中的任一 種。
61. 根據(jù)權(quán)利要求35-60中任一項所述的多肽，其基本上由選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列 (例如，序列）和重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，V H-序列）的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組 成。
62. 根據(jù)權(quán)利要求35-61中任一項所述的多肽，其基本上由選自來源于常規(guī)四鏈抗體 的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和來源于重鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域組成。
63. 根據(jù)權(quán)利要求35-62中任一項所述的多肽，其基本上由選自以下的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域組成：結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸），單結(jié)構(gòu)域抗體（或適合 用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸），"dAb"(或適合用作dAb的氨基酸）或納米抗體（包括但不 限于V HH或人源化的V。。
64. 根據(jù)權(quán)利要求35-63中任一項所述的多肽，其基本上由部分或完全人源化的納米 抗體組成，如由部分或完全人源化的VHH組成。
65. 根據(jù)權(quán)利要求35-64中任一項所述的多肽在制備權(quán)利要求1-34中任一項所述的多 肽中的應(yīng)用。
66. 根據(jù)權(quán)利要求35-64中任一項所述的多肽作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合單元在制備權(quán)利 要求1-34中任一項所述的多肽中的應(yīng)用。
67. 根據(jù)權(quán)利要求1-64中任一項所述的多肽，其還包含任選地通過一個或多個肽接頭 連接的一種或多種其他基團、殘基、結(jié)構(gòu)部分或結(jié)合單元。
68. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的多肽，其中所述一種或多種其他基團、殘基、結(jié)構(gòu)部分或結(jié) 合單元選自由以下組成的組：結(jié)構(gòu)域抗體，適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸，單結(jié)構(gòu)域抗體， 適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸，"dAb' s"，適合用作dAb的氨基酸，或納米抗體。
69. 根據(jù)權(quán)利要求67或68任一項所述的多肽，其與權(quán)利要求1-64中任一項所述的相 應(yīng)的多肽本身相比具有增加的半衰期。
70. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的多肽，其中，與權(quán)利要求1-64中任一項所述的相應(yīng)的多肽 本身相比，所述一種或多種其他基團、殘基、結(jié)構(gòu)部分或結(jié)合單元為所述多肽提供增加的半 衰期。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一種或多 種其他基團、殘基、結(jié)構(gòu)部分或結(jié)合單元選自由以下組成的組：血清蛋白或其片段，能夠結(jié) 合血清蛋白的結(jié)合單元，F(xiàn)c部分，以及能夠結(jié)合血清蛋白的小蛋白或肽。
72. 根據(jù)權(quán)利要求70或71任一項所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所 述一種或多種其他基團、殘基、結(jié)構(gòu)部分或結(jié)合單元選自由人血清白蛋白或其片段組成的 組。
73. 根據(jù)權(quán)利要求70或71任一項所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所 述一種或多種其他結(jié)合單元選自由能夠結(jié)合血清白蛋白（如人血清白蛋白）或血清免疫球 蛋白（如IgG)的結(jié)合單元組成的組。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一種或多 種其他結(jié)合單元選自由以下組成的組：結(jié)構(gòu)域抗體，適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸，單結(jié)構(gòu) 域抗體，適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸，"dAb"' s，適合用作dAb的氨基酸，或能夠結(jié)合血 清白蛋白（如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG)的納米抗體。
75. 根據(jù)權(quán)利要求70-74中任一項所述的多肽，其具有的血清半衰期是權(quán)利要求1-64 中任一項所述的相應(yīng)的多肽本身的半衰期的至少1. 5倍、優(yōu)選至少2倍、如至少5倍、例如 至少10倍或多于20倍。
76. 根據(jù)權(quán)利要求70-75中任一項所述的多肽，與權(quán)利要求1-64中任一項所述的相應(yīng) 的多肽本身相比，其血清半衰期增加超過1小時、優(yōu)選超過2小時、更優(yōu)選超過6小時、如超 過12小時、或甚至超過24、48或72小時。
77. 根據(jù)權(quán)利要求70-76中任一項所述的多肽，其在人中具有至少約12小時、優(yōu)選至 少24小時、更優(yōu)選至少48小時、甚至更優(yōu)選至少72小時或更多的血清半衰期；例如，具有 至少5天（諸如約5-10天）、優(yōu)選至少9天（諸如約9-14天）、更優(yōu)選至少約10天（諸如 約10-15天）、或至少約11天（諸如約11-16天）、更優(yōu)選至少約12天（諸如約12-18天 或更多）、或超過14天（諸如約14-19天）的血清半衰期。
78. 編碼權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽的核酸或核苷酸序列。
79. 根據(jù)權(quán)利要求78所述的核酸或核苷酸序列，其為遺傳構(gòu)建體的形式。
80. 根據(jù)權(quán)利要求78所述的核酸或核苷酸序列在制備編碼權(quán)利要求1-34中任一項所 述的多肽的遺傳構(gòu)建體中的應(yīng)用，所述核酸或核苷酸序列編碼權(quán)利要求35-64中任一項所 述的多肽。
81. 宿主或宿主細(xì)胞，其表達(dá)或者其在適當(dāng)?shù)那闆r下能夠表達(dá)權(quán)利要求1-64和67-77 中任一項所述的多肽；和/或其包含權(quán)利要求78所述的核酸或核苷酸序列或權(quán)利要求79 所述的遺傳構(gòu)建體。
82. 包含至少一種權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽或權(quán)利要求78和79中 任一項所述的核酸或核苷酸序列的組合物。
83. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的組合物，其是藥物組合物。
84. 根據(jù)權(quán)利要求83所述的組合物，其是藥物組合物，其還包含至少一種藥用載體、稀 釋劑或賦形劑和/或輔藥，并且其任選地包含一種或多種其他藥物活性多肽和/或化合物。
85. 根據(jù)權(quán)利要求84所述的組合物，其包含：至少一種權(quán)利要求1-64和67-77中任一 項所述的多肽或權(quán)利要求78和79中任一項所述的核酸或核苷酸序列，以及適于肺部遞送 的載體。
86. 適于肺部遞送至少一種權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽或權(quán)利要求 78和79中任一項所述的核酸或核苷酸序列的藥物裝置，其包含至少一種權(quán)利要求1-64和 67-77中任一項所述的多肽，或權(quán)利要求78和79中任一項所述的核酸或核苷酸序列。
87. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的藥物裝置，其選自用于液體（例如，精細(xì)固體顆粒或液滴的 混懸液）的吸入器，噴霧器，定量吸入器，氣霧劑和干粉劑吸入器。
88. 用于制備權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括 下述步驟： a)在適宜的宿主細(xì)胞或宿主生物體中或在另一種適宜的表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)權(quán)利要求 78所述的核酸或核苷酸序列或權(quán)利要求79所述的遺傳構(gòu)建體； 任選地接著： b)分離和/或純化這樣獲得的權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽。
89. 用于制備權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括 下述步驟： a) 在下述條件下培養(yǎng)和/或維持權(quán)利要求80所述的宿主或宿主細(xì)胞，所述條件是這樣 的，以使所述宿主或宿主細(xì)胞表達(dá)和/或生產(chǎn)至少一種權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所 述的多肽； 任選地接著： b) 分離和/或純化這樣獲得的權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽。
90. 用于制備權(quán)利要求1-34中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括將兩種以 上權(quán)利要求35-64中任一項所述的多肽以及任選地一種或多種接頭連接的步驟。
91. 用于預(yù)防和/或治療銅綠假單胞菌（P. aeruginosa)感染的方法，所述方法包括： 向有此需要的受試者施用藥物活性量的至少一種權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的 多肽，和/或權(quán)利要求83和84中任一項所述的組合物。
92. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其用于預(yù)防和/或治療在以下的至少一種中的銅綠 假單胞菌感染：通風(fēng)器相關(guān)性肺炎（VAP)，燒傷受害者，機械通氣的患者，囊性纖維化（CF) 患者，造血細(xì)胞移植患者，骨髓移植患者，外科手術(shù)，慢性阻塞性肺疾?。–0PD)，支氣管擴 張，敗血癥，癌癥相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥，所述方法包括：向有此需要的受試者施用藥物 活性量的至少一種權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽，和/或權(quán)利要求83和84 中任一項所述的組合物。
93. 根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其用于預(yù)防和/或治療銅綠假單胞菌感染，所述方法 包括：向有此需要的受試者的肺部組織施用藥物活性量的至少一種權(quán)利要求1-64和67-77 中任一項所述的多肽，和/或權(quán)利要求83-85中任一項所述的組合物。
94. 用于預(yù)防和/或治療在以下的至少一種中的銅綠假單胞菌感染的方法：通風(fēng)器相 關(guān)性肺炎（VAP)，燒傷受害者，機械通氣的患者，囊性纖維化（CF)患者，造血細(xì)胞移植患者， 骨髓移植患者，外科手術(shù)，慢性阻塞性肺疾?。–0PD)，支氣管擴張，敗血癥，癌癥相關(guān)的中性 粒細(xì)胞減少癥，所述方法包括：向有此需要的受試者的肺部組織施用藥物活性量的至少一 種權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽，和/或權(quán)利要求83-85中任一項所述的組 合物。
95. 權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽和/或權(quán)利要求83-85中任一項所述 的組合物在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物用于預(yù)防和/或治療銅綠假單胞菌 感染；和/或用于權(quán)利要求91-94所述的方法中的一種或多種。
96. 權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽和/或權(quán)利要求83和85中任一項 所述的組合物在制備用于預(yù)防和/或治療在以下的至少一種中的銅綠假單胞菌感染的藥 物組合物中的應(yīng)用：通風(fēng)器相關(guān)性肺炎（VAP)，燒傷受害者，機械通氣的患者，囊性纖維化 (CF)，造血細(xì)胞移植患者，骨髓移植患者，外科手術(shù)，慢性阻塞性肺疾病（C0PD)，支氣管擴 張，敗血癥，癌癥相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥。
97. 根據(jù)權(quán)利要求1-64和67-77中任一項所述的多肽和/或根據(jù)權(quán)利要求83-85中任 一項所述的組合物，其用于預(yù)防和/或治療銅綠假單胞菌感染。
98.根據(jù)權(quán)利要求1-67和67-77中任一項所述的多肽和/或根據(jù)權(quán)利要求83-85中任 一項所述的組合物，其用于預(yù)防和/或治療以下的至少一種中的銅綠假單胞菌感染：通風(fēng) 器相關(guān)性肺炎（VAP)，燒傷受害者，機械通氣的患者，囊性纖維化（CF)，造血細(xì)胞移植患者， 骨髓移植患者，外科手術(shù)，慢性阻塞性肺疾病（COPD)，支氣管擴張，敗血癥，癌癥相關(guān)的中性 粒細(xì)胞減少癥。
【文檔編號】A61P31/04GK104144945SQ201380012001
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月2日
【發(fā)明者】埃弗蘭·德塔韋尼耶, 安·尤尼奧, 布魯諾·東布雷克特, 蓋伊·赫爾曼斯, 埃麗卡·莫里齊奧 申請人:埃博靈克斯股份有限公司