膜聯(lián)蛋白a2作為制備治療骨質(zhì)疏松藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及膜聯(lián)蛋白A2作為制備治療骨質(zhì)疏松藥物的應(yīng)用。膜聯(lián)蛋白A2自1982年研究勞氏肉瘤病毒時作為酪氨酸蛋白激酶的作用底物被發(fā)現(xiàn)，公認(rèn)為是一種鈣離子依賴的磷脂和細(xì)胞膜結(jié)合蛋白，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞，并可游離存在于胞漿中或在胞內(nèi)連接于細(xì)胞膜上，與包括腫瘤、心血管疾病、腎臟疾病等人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)，并已用于對腫瘤的治療。本發(fā)明將膜聯(lián)蛋白A2用于骨質(zhì)疏松治療，效果優(yōu)于目前世界公認(rèn)的治療骨質(zhì)疏松有效藥物甲狀旁腺激素（PTH），表明了其作為骨質(zhì)疏松治療藥物的良好應(yīng)用前景。
【專利說明】膜聯(lián)蛋白A2作為制備治療骨質(zhì)疏松藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種膜聯(lián)蛋白A2作為制備治療骨質(zhì)疏松藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膜聯(lián)蛋白A2(膜聯(lián)蛋白 A2, ANXA2 ;又名 P36、P39、calpactin I heavy chain 等),是膜聯(lián)蛋白超家族中的一員，脊椎動物的膜聯(lián)蛋白s被命名為膜聯(lián)蛋白A家族，是在1982年研究勞氏肉瘤病毒時，作為酪氨酸蛋白激酶的作用底物而被發(fā)現(xiàn)的。1986年首次被克隆后引起了大量學(xué)者的廣泛關(guān)注。ANXA2是一類受鈣離子活化和調(diào)節(jié)的、能結(jié)合到膜磷脂上的蛋白，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞，并可游離存在于胞衆(zhòng)中，或在胞內(nèi)連接于細(xì)胞膜上(Gerke V, Creutz CE, Moss SE.Annexins:linking Ca2+ signalling to membrane dynamics [J].Nature Reviews Molecular CellBiology, 2005; 6 (6): 449-461)。
[0003]人的膜聯(lián)蛋白現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)13個成員即膜聯(lián)蛋白AfA13 (Gerke V，Moss SE.Annexins: from structure to function [J].Physiol Rev, 2002; 82 (2): 331-71),其基因定位于15q21_q22，編碼的蛋白有339個氨基酸，分子量為36KD，有13個外顯子。其分子結(jié)構(gòu)由33KD保守的羧基端和3KD較靈活的氨基端組成。其C端結(jié)構(gòu)域包含4個同源的重復(fù)序列區(qū)，每個重復(fù)序列由約70個氨基酸構(gòu)成的a -螺旋繞成右手超螺旋結(jié)構(gòu)，其凸面面向細(xì)胞膜，含有Ca2+、磷脂、肝素、DNA及F-actin的結(jié)合位點(diǎn)(Filipenko NR, Waisman DM.TheC terminu s of annexin II mediates binding to F-actin [J].J Biol Chem, 2001;276
(7): 5310-5315)。與肌動蛋白相連后可影響其組裝。凹面則面向細(xì)胞外，含有自身N端和其他胞質(zhì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。N端結(jié)構(gòu)域也稱尾區(qū)(tail)較為靈活，是膜聯(lián)蛋白A2分子的調(diào)節(jié)區(qū)，具有蛋白水解位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)Tyr23、Serll和Ser25，可與鈣結(jié)合蛋白S100A10 (Pll)結(jié)合(Gerke V, Creutz CE, Moss SE.Annexins: linking Ca2+ signalling to membranedynamics [J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2005; 6 (6): 449-461),并可與TRPV5，TRPV6，TASK-1, ASICla等多種細(xì)胞通道結(jié)合并調(diào)控這些通道的功能。
[0004]膜聯(lián)蛋白A2以單體、同源二聚體、異源四聚體和異源八聚體四種結(jié)構(gòu)形式存在。單體和異源四聚體是其存在的主要形式。它的形成過程是:首先由S100A10 (pll)形成同源二聚體，再結(jié)合兩分子膜聯(lián)蛋白A2形成異源四聚體(Allt)。而pll被證實(shí)是異四聚體膜聯(lián)蛋白A2分子與細(xì)胞膜錨合的重要位點(diǎn)(Madureira PA, Surette AP, Phipps KD,Taboski MA, Miller VA, Waisman DM.The role of the annexin A2 heterotetramer invascular fibrinolysis [J].Blood, 2011 Nov 3; 118 (18):4789-97),調(diào)節(jié)A2 的多種功倉泛。
[0005]傳統(tǒng)上認(rèn)為膜聯(lián)蛋白A2為一種鈣離子依賴的磷脂和細(xì)胞膜結(jié)合蛋白，隨著鈣離子濃度提高，膜聯(lián)蛋白A2與pll的相互結(jié)合增強(qiáng)，鈣離子水平下降則會造成膜聯(lián)蛋白A2和磷脂的結(jié)合喪失。但Filipenko等發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A2中鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變或失活時，蛋白可在沒有鈣離子的環(huán)境下與磷脂結(jié)合。因此膜聯(lián)蛋白A2上形成鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸或許阻斷了蛋白與磷脂的結(jié)合。當(dāng)其與鈣離子結(jié)合，或者發(fā)生突變或失活時，膜聯(lián)蛋白A2才可結(jié)合于磷脂分子上(Filipenko NR, Kang HM, Waisman DM.Characterization of the Ca2+_binding sites of annexin II tetramer [J].BiolChem, 2000,275,38877-38884)。
[0006]膜聯(lián)蛋白A2基因的表達(dá)可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。在腫瘤細(xì)胞中，一些生長因子如胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子可調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。過去對膜聯(lián)蛋白A2的研究主要集中在胞吞胞吐、細(xì)胞骨架及腫瘤方面，而近年的研究更清楚地揭示了膜聯(lián)蛋白A2，特別是其與pll形成異四聚體后，在人體內(nèi)更多的病理生理過程如纖溶系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、感染等的重要角色，與人類許多疾病如腫瘤、心血管疾病、腎臟疾病等的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。近年來越來越多的研究表明膜聯(lián)蛋白A2與骨骼系統(tǒng)有著密切的關(guān)系。許多蛋白在骨的礦化過程中有重要作用，如I型膠原蛋白和堿性磷酸酶(ALP)。I型膠原蛋白為骨的形成和礦物質(zhì)沉積提供骨架，并增強(qiáng)骨的拉伸強(qiáng)度；而ALP在堿性條件下催化磷酸單酯酶的水解，降解焦磷酸鹽，促進(jìn)細(xì)胞外磷酸鈣的沉積。Jennifer M等發(fā)現(xiàn)，在Sa0SLM2(人骨肉瘤細(xì)胞系)類成骨樣細(xì)胞膜上兩倍高表達(dá)膜聯(lián)蛋白A2，導(dǎo)致堿性磷酸酶活性增加，同時使礦化作用增強(qiáng)；而這并不是因?yàn)锳LP的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平增加，而是因?yàn)榧?xì)胞膜上包含的完整膜聯(lián)蛋白A2脂閥對于ALP的活性非常重要作用，從而促進(jìn)成骨樣的礦化過程(JenniferM.Gillette.The role of annexin 2 in osteoblastic mineralization[J].Journal ofCell Science, 2004, 117:441-449)D
[0007]此外，膜聯(lián)蛋白A2可由破骨細(xì)胞分泌，同時刺激破骨細(xì)胞的形成(BragaS，dalLago L,Bernard C，et al.Use of trastuzumab for the treatment of earlystage breast cancer [J].Expert Rev Anticancer Ther, 2006，6 (8):1153—1164)。月莫聯(lián)蛋白A2可能通過1，25- 二羥維生素D3上調(diào)基因表達(dá)，從而增加破骨細(xì)胞樣多核細(xì)胞的形成。外周血中的單核細(xì)胞是破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，可在骨表面分化成破骨細(xì)胞。通過定量蛋白組學(xué)研究，Deng FY發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)密度較低的白種人體內(nèi)外周血單核細(xì)胞表面的膜聯(lián)蛋白A2基因表達(dá)為骨質(zhì)密度高者的兩倍(Deng FY, Lei SF.Peripheral bloodmonocyte-expressed ANXA2 gene is involved in pathogenesis of osteoporosis inhumans [J].#o7 Cell Proteomics, 2011 Nov; 10 (11)011700)。提不膜聯(lián)蛋白 A2 或許為骨質(zhì)疏松癥的易感基因。
[0008]人甲狀旁腺激素(human parathyroid hormone, hPTH)是由人甲狀旁腺主細(xì)胞合成的一種單鏈多肽激素，成熟hPTH含84個氨基酸殘基。它的主要功能是調(diào)節(jié)脊椎動物體內(nèi)鈣和磷的代謝，促使血鈣水平升高，血磷水平下降，并調(diào)節(jié)骨的合成和分解代謝。甲狀旁腺激素(PTH)對骨代謝的調(diào)節(jié)具有雙重性，大劑量溶骨，小劑量成骨；對鈣磷代謝調(diào)節(jié)的總效應(yīng)是升高血鈣，降低血磷，骨代謝與鈣磷代謝密切相關(guān)。PTH的N端1-34是其主要的活性區(qū)域，具有成骨作用，現(xiàn)已制成用于骨質(zhì)疏松治療的成品藥物(特立帕肽)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種膜聯(lián)蛋白A2作為制備治療骨質(zhì)疏松藥物的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膜聯(lián)蛋白A2能明顯增加大鼠成骨樣肉瘤細(xì)胞UMR106堿性磷酸酶(ALP)的活性，促進(jìn)鈣化結(jié)節(jié)的形成。增加促進(jìn)成骨細(xì)胞活性的堿性磷酸酶(ALP)的活性方面優(yōu)于世界公認(rèn)的治療骨質(zhì)疏松疾病的有效藥物PTH ;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，應(yīng)用膜聯(lián)蛋白A2治療骨質(zhì)疏松的大鼠(特別是以注射制劑形式給藥)，其骨密度的增高，同樣優(yōu)于使用PTH治療的骨質(zhì)疏松的大鼠，從而為將膜聯(lián)蛋白A2用于作為治療骨質(zhì)疏松的藥物提供了更良好的廣闊應(yīng)用前景。
[0010]根據(jù)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，本發(fā)明膜聯(lián)蛋白A2對骨質(zhì)疏松的治療，是由膜聯(lián)蛋白A2作為配體直接作用于UMR106細(xì)胞，通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，刺激細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的功能的結(jié)果；并不是通過目前已有文獻(xiàn)報道的是由于細(xì)胞膜上包含膜聯(lián)蛋白A2的完整的脂筏對于ALP的活性的作用促進(jìn)成骨樣的礦化過程機(jī)制。因此其促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP活性和礦化能力增強(qiáng)的效果均優(yōu)于目前世界公認(rèn)的治療骨質(zhì)疏松疾病的PTH。
[0011]以下結(jié)合附圖所示實(shí)施例的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是膜聯(lián)蛋白A2和PTH對大鼠成骨細(xì)胞UMR106堿性磷酸酶(ALP)活性影響示意圖。
[0013]圖2是膜聯(lián)蛋白A2對大鼠成骨細(xì)胞UMR106生成礦化結(jié)節(jié)的影響示意圖。
[0014]圖3是膜聯(lián)蛋白A2和PTH對大鼠成骨細(xì)胞UMR106增殖活性(MTT法)影響的示意圖。
[0015]圖4是膜聯(lián)蛋白A2和PTH對骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨密度的影響。
[0016]圖5是膜聯(lián)蛋白A`2和PTH對骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織堿性磷酸酶活性影響的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
商品化膜聯(lián)蛋白A2 (ProSpec，PR0-777)及PTH (ProSpec，H0R-263)對大鼠成骨細(xì)胞UMR106堿性磷酸酶(ALP)活性影響的實(shí)驗(yàn)。
[0018]1.復(fù)蘇大鼠成骨樣肉瘤UMR 106細(xì)胞:從液氮中取出凍存的大鼠成骨樣肉瘤UMR106細(xì)胞，投入約38°C的水浴中解凍，期間不斷振蕩，直至剛好完全解凍，轉(zhuǎn)移至已加入預(yù)熱至37°C的8 ml無血清DMEM培養(yǎng)基中混勻。1000 rpm離心沉淀5 min,棄上清，沉淀物中加入約5 ml的含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中懸浮；轉(zhuǎn)移至100 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C、5%C02的飽和濕度二氧化碳孵箱中培養(yǎng)。次日倒置生物顯微鏡下觀察并換液，適時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，直至細(xì)胞數(shù)達(dá)實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。同實(shí)施例2。
[0019]2.誘導(dǎo)ALP:按常規(guī)用0.25%的胰蛋白酶消化收集大鼠成骨樣肉瘤UMR106細(xì)胞，1000 rpm離心沉淀5 min。棄上清液，細(xì)胞沉淀物加入無酚紅的DMEM培養(yǎng)液懸浮，1000rpm離心沉淀5 min洗滌細(xì)胞兩次。細(xì)胞沉淀物再次用50 ml的無酚紅的DMEM培養(yǎng)液，置37°C、5%C02的飽和濕度二氧化碳孵箱中孵育2 h，使細(xì)胞的ALP的活性本底降低。1000 rpm離心沉淀5 min，再次用無酚紅的DMEM培養(yǎng)液懸浮，苔盼蘭染色計數(shù)。存活細(xì)胞> 95%，調(diào)細(xì)胞濃度為2X105/mlo分別加入已經(jīng)加入IOOu I不同濃度(10000、1、0.1,0.01,0.001、
0U g/ml，每一濃度均作4復(fù)孔)梯度的商品膜聯(lián)蛋白A2及PTH的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔IOOu 10 37°C、5%C02的飽和濕度二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；棄上清液，每孔加入含1%的Triton X-100的生理鹽水200 U I/孔，置_20°C冷凍過夜。
[0020]3.檢測ALP及采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度:取出冷凍的細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫解凍，超聲洗滌器中超聲5 min，使其充分混勻。每孔取出50 Ul細(xì)胞裂解上清到兩個新的96孔細(xì)胞板中，其中一板每孔再加入50 Ul的堿性磷酸酶檢測試劑，用于測定ALP活性；另一板加入BCA蛋白檢測試劑用于測定其蛋白質(zhì)濃度。置酶標(biāo)儀檢測不同時間點(diǎn)OD4tl5值。用不同時間點(diǎn)的OD4tl5值，根據(jù)公式(OD2-OD1) / A t/蛋白濃度分別計算出每毫克蛋白所對應(yīng)的堿性磷酸酶(ALP)活性。
[0021]4.結(jié)果 隨著膜聯(lián)蛋白A2濃度升高ALP活性增加，呈正相關(guān)，p值< 0.05 ;PTH在一定濃度范圍內(nèi)與ALP的活性成正相關(guān)，在一定濃度范圍內(nèi)隨著PTH濃度增加，ALP活性下降，且膜聯(lián)蛋白A2組的ALP活性高于PTH組的ALP活性。結(jié)果對比如圖1所示。
[0022]5.結(jié)論
膜聯(lián)蛋白A2可促進(jìn)大鼠成骨樣肉瘤UMR106細(xì)胞堿性磷酸酶活性；且ALP活性增高明顯高于PTH。而成骨細(xì)胞的礦化與ALP的活性呈正相關(guān)，由此推測，膜聯(lián)蛋白A2具有促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的功能，且促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的能力優(yōu)于PTH。
[0023]實(shí)施例2
商品化膜聯(lián)蛋白A2 (ProSpec,PR0-777)及PTH (ProSpec，H0R_263)對大鼠成骨細(xì)胞UMR106生成礦化結(jié)節(jié)的影響實(shí)驗(yàn)。
[0024]1.復(fù)蘇大鼠成骨樣肉瘤UMR 106細(xì)胞:同實(shí)施例1。
[0025]2.成骨誘導(dǎo):成骨細(xì)胞培養(yǎng)液配制(成骨誘導(dǎo)液為含50mg/L抗壞血酸、
0.1 u mmol/L地塞米松、0.5mmol/L ^ -甘油磷酸鈉、體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)基)。用0.25%胰蛋白酶消化收集處于對數(shù)生長期的大鼠成骨樣肉瘤UMR106細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2X105/mL。取Iml接種于直徑90mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分三組，每組兩皿。其中一組加入100 ii l、lmg/ml的商品膜聯(lián)蛋白A2組(實(shí)驗(yàn)組),一組加入100 ii 1、lmg/ml的商品PTH組(對照組)，另一組僅加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(空白組)。膜聯(lián)蛋白A2組和PTH組每皿均加入成骨細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)足至10 ml，空白組加入含5%胎牛血清的DMEM補(bǔ)足至10 ml。在37°C、5%C02的飽和濕度二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，約2~3天實(shí)驗(yàn)組和對照組用新鮮的成骨細(xì)胞培養(yǎng)液，空白組用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液換液一次，直至大約21天。倒置生物顯微鏡下觀察，可見折光性較強(qiáng)的結(jié)節(jié)狀沉積物。經(jīng)茜素紅染色，蘇木素復(fù)染后采集鈣結(jié)節(jié)圖片。
[0026]3.結(jié)果
加入商品化膜聯(lián)蛋白A2的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)大量的紅色結(jié)節(jié)狀影(平均每4X倍視野3-5個)，對照組偶見紅色結(jié)節(jié)狀影(平均每4X倍視野1-2個)，空白組未見紅色結(jié)節(jié)狀影。結(jié)果對比如圖2所示(圖2中的空白對照值為0).4.結(jié)論:膜聯(lián)蛋白A2蛋白能促進(jìn)鈣的沉積，促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化。
[0027]實(shí)施例3分別以商品化膜聯(lián)蛋白A2商品(ProSpec，PR0-777)及PTH (ProSpec，H0R-263)，進(jìn)行對大鼠成骨細(xì)胞UMR106增殖活性影響(MTT法)的實(shí)驗(yàn)。
[0028]試劑:D-Hank’s液，小牛血清，DMEM營養(yǎng)液，雙抗(青霉素、鏈霉素)，0.25%胰酶，二甲基亞砜(DMSO)，MTT溶液:稱取250 mg MTT，放入小燒杯中，加50 ml培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機(jī)上攪拌30 min，用0.22 y m的微孔濾器除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆?，兩周?nèi)有效。
[0029]操作步驟:
1.復(fù)蘇大鼠成骨樣肉瘤UMR 106細(xì)胞:同實(shí)施例1。
[0030]2.接種UMR106細(xì)胞:用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔103~104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 ill。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37°C、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。
[0031]3.加入蛋白刺激細(xì)胞增殖:調(diào)細(xì)胞濃度為2X105/ml。分別加入已經(jīng)加入100 yl不同濃度(10、1、0.1,0.01,0.0OUOiI g/ml，每一濃度均作4復(fù)孔)梯度的商品化膜聯(lián)蛋白A2及PTH的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 yl。37°C、5%C02的飽和濕度二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時。
[0032]4.呈色:每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)10 yl，37°C孵箱中繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 ill DMS0，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。
[0033]5.比色:選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。
`[0034]結(jié)果:
商品化膜聯(lián)蛋白A2組的OD57tl值明顯高于PTH組，說明膜聯(lián)蛋白A2可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞的的礦化，其作用強(qiáng)于PTH。PTH組的OD57tl值則并未隨著濃度的改變有明顯改變。結(jié)果對比如圖3所示。
[0035]實(shí)施例4
對實(shí)驗(yàn)鼠骨質(zhì)疏松的治療實(shí)驗(yàn)。
[0036]1.膜聯(lián)蛋白A2對大鼠骨質(zhì)疏松模型治療的效果
實(shí)驗(yàn)方法:60只5周齡Wistar健康雌性大鼠，其中40只行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，20只做假手術(shù)。8周后各處死10只證實(shí)骨質(zhì)疏松造模成功。剩余30只骨質(zhì)疏松模型鼠隨機(jī)分為3個治療組，每組10只，其它10只假手術(shù)組作對照。
[0037]膜聯(lián)蛋白A2治療組:商品化膜聯(lián)蛋白A2 50 y g/kg，每日皮下注射I次；
PTH對照組:PTH 50 u g /kg劑量，每日皮下注射I次；
安慰劑組:生理鹽水，每日皮下注射I次；
假手術(shù)對照組:生理鹽水，每日皮下注射I次。
[0038]治療4個月后，測定并比較股骨骨密度、及勻漿后股骨組織中堿性磷酸酶(ALP)活性。
[0039]各組動物于治療后16周部放血處死后取股骨標(biāo)本。測定:①去除左側(cè)股骨周圍軟組織，稱濕重，以每克組織加入I毫升勻漿液(配方:去污劑裂解緩沖液50 mmol/L Tris.Cl(pH 8.0) ；150mmol/L NaCL ；0.02% 疊氮鈉 100 u g/ml ;苯甲基磺酰氟(PMSF) I u g/ml ；Aprotinin 1% Triton x-100或NP-40),離心,取上清液,用堿性磷酸酶試劑盒測定骨組織中堿性磷酸酶(ALP)活性；②取右側(cè)側(cè)股骨中段，盡量剔除周圍軟組織，采用法國DMS公司CHALLENGER雙能X線吸收儀進(jìn)行掃描測定，DMS公司CHALLENGER分析動物軟件進(jìn)行分析。
[0040]統(tǒng)計學(xué)處理:使用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果以Meanis表示，組間比較采用單因素方差分析。
[0041 ] 2.膜聯(lián)蛋白A2及PTH對骨質(zhì)疏松大鼠股骨的影響
大鼠雙側(cè)卵巢摘除8周后，其左側(cè)股骨密度試驗(yàn)顯示，各指標(biāo)均較假性手術(shù)組降低，分別為(0.236±0.026) g /mm2、( 0.266±0.025) g /mm2 ( P〈0.05)，提示骨質(zhì)疏松模型造模成功。
[0042]對照組大鼠股骨明顯低于假性手術(shù)組。商品化膜聯(lián)蛋白A2組的股骨骨密度高于PTH組，具有顯著性差異。(P〈0.05)。結(jié)果對比如圖4所示。
[0043]3.膜聯(lián)蛋白A2及PTH對骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織勻漿后每克組織堿性磷酸酶活性 商品化膜聯(lián)蛋白A2組和PTH組ALP值均明顯高于安慰劑組和假性手術(shù)組(P〈0.05)，
并且商品化膜聯(lián)蛋白A2組ALP值高于PTH組。結(jié)果對比如圖5所示。
[0044]4.結(jié)果
雙側(cè)卵巢摘除8周后，大鼠 股骨骨密度明顯低于假手術(shù)組(P〈0.05)。4個月治療后，膜聯(lián)蛋白A2組和PTH組大鼠股骨骨密度明顯高于安慰劑組，并且膜聯(lián)蛋白A2組的骨密度高于PTH組；膜聯(lián)蛋白A2組股骨組織ALP活性高于PTH組。
[0045]5.結(jié)論
商品膜聯(lián)蛋白A2均對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠有明顯治療作用，并且治療效果優(yōu)于目前公認(rèn)的治療骨質(zhì)疏松藥物PTH。
【權(quán)利要求】
1.膜聯(lián)蛋白A2作為制備治療骨質(zhì)疏松藥物的應(yīng)用。
2.如權(quán) 利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所說的藥物為注射制劑。
【文檔編號】A61K38/17GK103690932SQ201310730428
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】陳雨雪, 孟玉坤, 彭曉東 申請人:四川大學(xué)