豬呼吸與繁殖綜合征病毒復(fù)制缺陷性病毒疫苗株的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，具體涉及一種豬呼吸與繁殖綜合征病毒復(fù)制缺陷性病毒疫苗株的構(gòu)建及應(yīng)用。本發(fā)明中將豬呼吸與繁殖綜合征病毒（PRRSV）Jiangxi-3株缺失部分Nsp9基因，得到復(fù)制缺陷性的Jiangxi-3株感染性克隆，同時將PRRSV的Nsp9基因克隆入Marc-145細(xì)胞，使其穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白，將復(fù)制缺陷的PRRSV?Jiangxi-3株感染性克隆轉(zhuǎn)染表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞，拯救出具有復(fù)制能力的rVJiangxi-3毒株，獲得復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。本發(fā)明所獲得的疫苗具有良好的免疫原性，可同時保護(hù)PRRSV經(jīng)典株和高致病性變異株的感染。
【專利說明】豬呼吸與繁殖綜合征病毒復(fù)制缺陷性病毒疫苗株的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，具體涉及一種利用Nsp9基因缺失構(gòu)建PRRSV(porCinereproductive and respiratory syndrome virus,豬呼吸與繁殖綜合征病毒)復(fù)制缺陷性病毒疫苗株的方法及其在疫苗生產(chǎn)方法中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(porcine!^productive and respiratory syndrome,PRRS)是20世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)的一種高度傳染性疾病，引起妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等生殖障礙，以及各種年齡豬(特別是仔豬)的呼吸道疾病。1987年美國首先報道了該病的發(fā)生。隨后短短幾年時間內(nèi)，迅速遍及全球各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)。1996年，哈爾濱獸醫(yī)研究所首次從國內(nèi)疑似PRRS病例中分離到PRRS病毒，從而證實了本病在我國的存在。1991年,Lelystad的荷蘭中央獸醫(yī)研究所的Wensvoort博士用豬肺泡巨卩遼細(xì)胞首次分離到病原，并命名為Lelystad病毒(PRRSV歐洲型代表株)。1992年美國研究人員用CL2621細(xì)胞也分離到PRRSV美洲型代表株(VR-2332)。通過對這種病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和抗原性等的研究，證明其為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒。
[0003]其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, PRRSV),屬于新成立的尼多病毒目(order Nidovirales)、動脈炎病毒科(family Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(genus Arterivirus)。PRRSV 不同分離株核苷酸序列存在廣泛而明顯的變異，依據(jù)血清學(xué)試驗及結(jié)構(gòu)基因序列分析結(jié)果可將PRRSV劃分為兩種基本的基因型 :歐洲型(I型)和美洲株(II型)，前者主要流行于歐洲地區(qū)，而后者主要流行于美洲和亞太地區(qū)。但丹麥、斯洛伐克、加拿大已分別出現(xiàn)了兩型PRRSV的感染。并且，丹麥發(fā)生的美洲型PRRSV的流行是由于美洲型PRRSV弱毒苗毒力返強(qiáng)的結(jié)果。雖然二個基因型的基因組核苷酸一致性僅55%~70%，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)、復(fù)制特點、細(xì)胞嗜性、流行傳播方式及其引發(fā)的疾病特征等生物學(xué)特性均相同。
[0004]我國自2006年以來，由PRRSV變異株引起的“豬高致病性藍(lán)耳病”是一種新型烈性傳染病，它以流行廣、傳播快、發(fā)病率和致死率高、現(xiàn)行疫苗無保護(hù)作用為特征，而與經(jīng)典豬藍(lán)耳病截然不同，截止目前，本病已在我國20多個省份流行，最近我省部分中小豬場也未能幸免，沉重地打擊了我國我省的養(yǎng)豬業(yè)，其經(jīng)濟(jì)損失已達(dá)到億萬元計。2008年高致病性豬藍(lán)耳病在全國的流行較少，但2009下半年開始又出現(xiàn)了高致病性豬藍(lán)耳病的爆發(fā)流行，在我國的北方省份如河南、安徽、山東等流行嚴(yán)重，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005]在PRRSV中，ORFl是最大的I個閱讀框，長約12kb，包括ORFla和ORFlb，約占病毒基因組的80%，為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，Nsp9基因位于ORFlb上主要編碼RNA依賴性的RNA聚合酶(RNA — dependent RNA polymerase, RdRp),參與病毒復(fù)制過程，高度保守。Nsp9的生物學(xué)功能與病毒的生物學(xué)以及臨床特征有何關(guān)系尚不清楚。反向遺傳技術(shù)為研究RNA病毒的復(fù)制、致病性、蛋白功能、病毒與宿主的相互作用以及開發(fā)新型疫苗和病毒載體提供了一個很好的技術(shù)平臺。Siao-Kun Wan Welch等構(gòu)建了分別缺失0RF2和0RF4的PRRSV復(fù)制缺陷性病毒疫苗株，但免疫豬后只產(chǎn)生較弱的免疫反應(yīng)(Welch, S.K.，et al., Construction and evaluation of genetically engineeredreplication-defective porcine reproductive and respiratory syndrome virusvaccine candidates.Vet Immunol Immunopathol, 2004.102(3):p.277-90.X
[0006]豬繁殖與呼吸綜合征(或豬藍(lán)耳病)疫苗的研發(fā)是一個世界性難題，活疫苗普遍存在毒力偏強(qiáng)的問題，而滅活疫苗存在的主要問題是免疫效力欠佳。盡管目前針對PRRS的疫苗研究種類繁多，但沒有一種疫苗可對豬體產(chǎn)生理想的安全保護(hù)作用。因此當(dāng)前迫切需要研究出一種安全有效，免疫譜廣的疫苗。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題及缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種構(gòu)建病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法。發(fā)明所應(yīng)用的菌株為PRRSV Jiangx1-3株(GenBank Accession Number:EU200961.1),通過將 Nsp9 (Nonstructural protein9)基因進(jìn)行部分缺失，實現(xiàn)PRRSV的復(fù)制性缺陷特性。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法制備獲得的病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。
[0009]本發(fā)明的再一目的在于提供上述病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種構(gòu)建病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，具體包含為dfPRRSV Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因，得到復(fù)制缺陷性的Jiangx1-3株感染性克隆，同時將PRRSV Jiangx1-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145細(xì)胞，使其穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白，將復(fù)制缺陷的PRRSV Jiangx1-3株感染性克隆轉(zhuǎn)染表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞，拯救出具有復(fù)制能力的rVJiangxi_3毒株，獲得復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。
[0011]所述的PRRSV Jiangx1-3株來源于2006年“高熱病”期間從江西省豬場分離鑒定(GenBank Accession Number:EU200961.1),該菌株已發(fā)表文獻(xiàn)為:豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行株Jiangx1-3的全基因組序列分析，上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)院)，2009年2期。
[0012]所述的將PRRSV Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因為運(yùn)用反向遺傳操作和基因重組技術(shù)實現(xiàn)。
[0013]所述的缺失部分Nsp9基因優(yōu)選為缺失PRRSV Jiangx1-3株基因組序列GenBankAccession Number EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段；
[0014]優(yōu)選的，在將Jiangx1-3株Nsp9基因缺失102nt核苷酸的基礎(chǔ)上，再在GenBankAccession Number EU200961.1的自5，末端第8241至8342位中插入限制性內(nèi)切酶位點；所述的限制性內(nèi)切酶位點優(yōu)選為限制性內(nèi)切酶Sbf I位點；
[0015]所述的rVJiangx1-3毒株可在穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞上穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，但不能在豬體內(nèi)或不表達(dá)Nsp9基因的細(xì)胞系中復(fù)制傳代。
[0016]一種病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株由上述方法制備獲得，該病毒疫苗株可在穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞上穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，但不能在豬體內(nèi)或不表達(dá)Nsp9基因的細(xì)胞系中復(fù)制傳代。
[0017]上述病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株在制備預(yù)防和/或治療豬呼吸與繁殖綜合征疫苗中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0019]1.本發(fā)明通過CMV啟動子控制下的體外轉(zhuǎn)錄和脂質(zhì)體介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞，獲得了穩(wěn)定傳代的復(fù)制缺陷性的PRRSV Jiangx1-3株拯救病毒rVJiangx1-3，其基因組的Nsp9編碼區(qū)中缺失長度為102nt的核苷酸片段。在缺失區(qū)中引入了限制性酶切位點Sbf I使建立血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法成為可能。引入的唯一限制性酶切位點Sbf I也使后續(xù)分子操作更加方便。所以rVJiangx1-3可成為PRRS標(biāo)記疫苗和動脈炎病毒載體的理想候選對象，有效解決了此類疫苗存在的上述問題。
[0020]2.拯救的PRRSV克隆病毒rVJiangx1-3在體外具有良好的遺傳穩(wěn)定性，與親本病毒PRRSV Jiangx1-3相比，在穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞上的復(fù)制與增殖沒有顯著差別，而在不表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)不增殖不產(chǎn)生病變。 [0021]3.動物感染試驗表明，rVJiangx1-3株的致病性比親本病毒低，對豬不產(chǎn)生任何臨床癥狀，由于在豬體內(nèi)病毒不能復(fù)制，但可以表達(dá)其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白刺激豬體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在構(gòu)建的復(fù)制缺陷性的rVJiangx1-3株在其Nsp9基因內(nèi)缺失了 34個氨基酸，可以缺失的多肽開發(fā)鑒別診斷方法。
[0022]4.疫苗效力試驗顯示，本發(fā)明利用病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株制備獲得的疫苗具有高的疫苗效力，病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗第5代( 105 5TCID50)經(jīng)5倍稀釋后，仍然對豬繁殖與呼吸綜合征(或豬藍(lán)耳病)的防治具有顯著的效果。
[0023]5.發(fā)明構(gòu)建的豬呼吸與繁殖綜合征病毒復(fù)制缺陷性病毒具有良好的免疫原性，可同時保護(hù)豬呼吸與繁殖綜合征病毒經(jīng)典株和高致病性變異株的感染。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為Jiangx1-3株復(fù)制缺陷性病毒感染性克隆構(gòu)建示意圖。
[0025]圖2為Jiangx1-3株拯救病毒間接免疫熒光鑒定圖。其中，A為rVJiangXi_3dl02感染Marc-145細(xì)胞36小時后IFA鑒定結(jié)果；B為rVJiangxi_3dl02感染Marc-145_Nsp9細(xì)胞36小時后IFA鑒定結(jié)果。
[0026]圖3為PRRSV分別在Marc-145細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)Nsp9的Marc-145細(xì)胞上的生長曲線。
[0027]圖4為rVJiangx1-3(第20代)與PRRSV Jiangxi_3Nsp9編碼區(qū)的部分序列比較。
[0028]圖5為拯救病毒免疫仔豬抗體的動態(tài)變化。
[0029]【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0031 ] 本發(fā)明的PRRSV Jiangx1-3株復(fù)制缺陷性病毒疫苗株，所使用的原始毒株Jiangx1-3株來源于2006年“高熱病”期間從江西省某豬場分離鑒定(GenBank AccessionNumber:EU200961.1)，(已發(fā)表文獻(xiàn)為:豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行株Jiangx1-3的全基因組序列分析，上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)院)，2009年2期)，利用反向遺傳操作和基因重組技術(shù)將Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因,得到復(fù)制缺陷性的Jiangx1-3株感染性克隆，同時將Jiangx1-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145細(xì)胞,使其穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白，復(fù)制缺陷性PRRSV Jiangx1-3株感染性克隆轉(zhuǎn)染表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞，拯救出具有復(fù)制能力的rVJiangx1-3毒株,此毒株可在穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞上穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，但不能在豬體內(nèi)或不表達(dá)Nsp9基因的細(xì)胞系中復(fù)制傳代。
[0032]實施例1:含有Nsp9缺失編碼區(qū)的重組載體pACYC-Jiangx1-3dl02的構(gòu)建
[0033]本實施例是PRRSV Jiangx1-3基因組全長cDNA將Nsp9編碼區(qū)中缺失長度為102bp的核苷酸片段，并將其克隆到質(zhì)粒PACYC177載體中得到重組載體。所述核苷酸片段的核昔酸序列如GenBank Accession Number EU200961的自5’未端第8241至8342位所
/Jn o
[0034]1、含有Nsp9缺失編碼區(qū)的核苷酸片段的重組載體的構(gòu)建
[0035]根據(jù)Jiangx1-3全序列(GenBank序列號EU200961)和質(zhì)粒載體pACYC177的限制性酶切位點，用軟件設(shè)計克隆和檢測引物(如表1)，引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。
[0036]表1用于構(gòu)建PRRSV Jiangx1-3株感染性克隆的引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于具體包含為:將PRRSV Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因，得到復(fù)制缺陷性的Jiangx1-3株感染性克隆，同時將PRRSV Jiangx1-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145細(xì)胞，使其穩(wěn)定表達(dá)Nsp9蛋白，將復(fù)制缺陷的PRRSV Jiangx1-3株感染性克隆轉(zhuǎn)染表達(dá)Nsp9蛋白的Marc-145細(xì)胞，拯救出具有復(fù)制能力的rVJiangx1-3dl02毒株，獲得復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的PRRSV Jiangx1-3株來源于2006年“高熱病”期間從江西省豬場分離鑒定，其GenBank Accession Number:EU200961.1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的將PRRSV Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因為運(yùn)用反向遺傳操作和基因重組技術(shù)實現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的缺失部分Nsp9基因為缺失PRRSV Jiangx1-3株基因組序列GenBank AccessionNumber EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的缺失部分Nsp9基因為缺失PRRSV Jiangx1-3株基因組序列GenBank AccessionNumber EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段，并且在第8241至8342位中插入限制性內(nèi)切酶位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的限制性內(nèi)切酶位點為限制性內(nèi)切酶Sbf I位點。
7.—種病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株由權(quán)利要求1~6任一項所述的方法制備獲得。`
8.權(quán)利要求1所述的病毒復(fù)制缺陷性PRRSV病毒疫苗株在制備預(yù)防和/或治療豬呼吸與繁殖綜合征疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/12GK103773740SQ201310703956
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】宋長緒, 蔣智勇, 蔡汝健, 李艷, 劉燕玲, 張樂宜 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所