人凝血因子Ⅷ凍干保護劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種不含人血白蛋白不含糖的人凝血因子Ⅷ凍干保護劑配方，該凍干保護劑組成(濃度mol/L)：氯化鈉10-200、枸櫞酸鈉2-50、甘氨酸50-600、氯化鈣1-30、鹽酸賴氨酸1-200。采用本配方，應(yīng)用干熱法可有效滅活人凝血因子Ⅷ制品中指示病毒，且在凍干熱滅活過程中及長期儲存過程中有效保護血源性人凝血因子Ⅷ的活性，具有病毒滅活效果好、未添加人血白蛋白其它動物源性成分可避免隱性污染、配方成份簡單能有效降低生產(chǎn)成本、氯化鈉濃度及制品滲透壓與人體相容性好、本配方中氯化鈉濃度有利于凍干及制品長期儲存、賦型甘氨酸有氨基和羧基而使凍干及制品具有強緩沖性、不含糖、耐熱性好和復(fù)溶時間短等優(yōu)點。
【專利說明】人凝血因子WI凍干保護劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體屬于屬于血液制品生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，內(nèi)容涉及人凝血因子VDI凍干保護劑。
技術(shù)背景
[0002]人凝血因子VDKF VID是正常血漿的一種糖蛋白，在正常人血漿中的含量為100-200ng/ml,相當于InM。其功能異?；蛉笔?dǎo)致血友病A (血友病甲)。全世界約有400，000血友病患者，血友病在男性中有1/5000-1/10000的發(fā)病率。由正常人血漿分離純化制備的人凝血因子珊制品主要用于血友病的治療。由于F VDI不穩(wěn)定，凍干時通常需要加入保護劑，Gringeri, A.的研究數(shù)據(jù)顯示全球血漿來源的29個F VDI制品中有17個采用含白蛋白的穩(wěn)定劑(Mark Brooker.Registry of Clotting Factor Concentrates.EighthEdition, 2008, World Federation of Hemophilia)。國內(nèi)亦有米用人白蛋白和或糖醇類作為人凝血因子珊凍干保護劑的專利，但是，出于制品安全角度考慮，穩(wěn)定劑的發(fā)展方向是盡量避免使用生物源性成分。目前，各種成分如鹽類、糖類醇類、聚體、氨基酸等引入凍干配方，尤其是氨基酸類備受親睞。
[0003]2012年I月9日，中國健康教育中心公布的“中國慢病監(jiān)測及糖尿病專題調(diào)查”結(jié)果顯示，我國18歲及以上居民糖尿病患病率為9.7%，60歲以上老年人患病率高達19.6%，目前，全國約有成年糖尿病患者已經(jīng)達到1.14億。占全球患者三分之一。因此，研究和探索不含白蛋白，不含糖的凍干保護劑配方具有積極意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的任務(wù)是提供一種人凝血因子珊凍干保護劑，使其具有不含人血白蛋白、不含糖、不含其它動物源性成分`，能有效避免由于人血白蛋白可能對制品造成的隱性污染問題等特點。
[0005]本發(fā)明的另一個任務(wù)是提供這種一種人凝血因子VDI凍干保護劑的制備方法。
[0006]本發(fā)明的又一個任務(wù)是提供一種凍干人凝血因子珊的制備方法。即使用本發(fā)明人凝血因子珊凍干保護劑制備凍干人凝血因子珊的方法。
[0007]實現(xiàn)本發(fā)明的具體方案是:
[0008]本發(fā)明提供的這種人凝血因子VDI凍干保護劑，是在注射用水中溶解有下濃度組分形成的緩沖液:
[0009]氯化鈉10-200mol/L
[0010]枸櫞酸鈉2_50mol/L
[0011]甘氨酸50-600mol/L
[0012]氯化鈣l_30mol/L
[0013]鹽酸賴氨酸l_200mol/L。
[0014]上述人凝血因子VDI凍干保護劑的pH為6.5-7.5。[0015]上述人凝血因子珊凍干保護劑的制備方法，包括以下步驟:
[0016]步驟一:將氯化鈉、枸櫞酸鈉、甘氨酸、氯化鈣、鹽酸賴氨酸充分溶解于滅菌注射用水中，使各成分終濃度為:氯化鈉10-200mol/L ;枸櫞酸鈉2-50mol/L ;甘氨酸50-600mol/L ;氯化鈣l_30mol/L ;鹽酸賴氨酸l_200mol/L ；
[0017]步驟二:調(diào)整pH至6.5-7.5定容，具體可用6mol/L鹽酸溶液調(diào)整pH ;除菌過濾即得人凝血因子VDI凍干保護劑。如可采用0.22 y m的微孔濾膜進行除菌過濾。
[0018]采用上述本發(fā)明提供的人凝血因子VDI凍干保護劑制備凍干人凝血因子珊的方法是:用上述本發(fā)明提供的人凝血因子珊凍干保護劑對人凝血因子珊原液進行超濾透析得到人凝血因子VDI半成品，經(jīng)除菌過濾、分裝、凍干后，進行熱滅活。熱滅活具體可采用100°C 30分鐘滅活。采用該方法制備的凍干人凝血因子珊可用滅菌注射用水作稀釋劑進行復(fù)溶。
[0019]本發(fā)明提供的人凝血因子珊凍干保護劑不含人血白蛋白，可避免由于人血白蛋白可能對制品造成的隱性污染問題。本發(fā)明提供的人凝血因子珊凍干保護劑不含糖，可避免糖尿病患者使用時可能對患者血糖造成負擔問題。本發(fā)明提供的人凝血因子VDI凍干保護劑玻璃轉(zhuǎn)化溫度為大于140°C，故可避免在100°C 30min滅活過程中凍干微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在加熱滅活的條件下即有效保護了目的蛋白的活性，又使指示病毒得以有效地滅活；
[0020]本發(fā)明公開一種不含人血白蛋白不含糖的人凝血因子VDI凍干保護劑配方，該凍干保護劑組成(濃度mol/L):氯化鈉10-200、枸櫞酸鈉2-50、甘氨酸50-600、氯化鈣1_30、鹽酸賴氨酸1-200。采用本配方，應(yīng)用干熱法可有效滅活人凝血因子珊制品中指示病毒，且在凍干熱滅活過程中及長期儲存過程中有效保護血源性人凝血因子珊的活性。本發(fā)明的凍干保護劑配方的創(chuàng)新點在于以下幾個方面:1.病毒滅活效果好，采用本凍干保護配方應(yīng)用干熱法可有效滅活人凝血因子VDI制品中指示病毒HIV-1達到4.0Olog以上，且經(jīng)細胞培養(yǎng)盲傳三代，均未出現(xiàn)細胞病變(中國人民解放軍艾滋病檢測確認實驗室檢測報告.報告編號:B2012MH018)。采用本凍干保護配方應(yīng)用干熱法可有效滅活三批人凝血因子VDI制品中指示病毒 PPV 分別為大于 4.18LgTCID50/0.lml, 4.24LgTCID50/0.1ml 和 4.26LgTCID50/0.lml,滅活三批人凝血因子VDI制品中指示病毒EMCV分別為大于4.75LgTCID50/0.1ml，
4.68LgTCID50/0.1ml和4.68LgTCID50/0.1ml (中國食品藥品檢定研究院中檢生檢函[2013J924號關(guān)于人凝血因子VDI病毒滅活驗證結(jié)果的函);2.未添加人血白蛋白其它動物源性成分，白蛋白在凍干配方中具有良好的支架作用，能有效地保護目的蛋白活性，加入人白蛋白成分是傳統(tǒng)配方選擇方式，但是白蛋白同時具有保護病毒的作用，干擾病毒滅活效果，在成為產(chǎn)品方面存在缺陷，本配方還避免了由于人血白蛋白等可能對制品造成的隱性污染問題；3.本發(fā)明的凍干保護劑配方成份簡單，能有效降低生產(chǎn)成本。4.本配方中合理調(diào)節(jié)氯化鈉濃度及制品滲透壓，使制品與人體相容性好，避免給合并有心臟疾病的患者增加心功能負擔；5.本配方中氯化鈉濃度有利于凍干及制品長期儲存，高氯化鈉濃度會在制品的長期儲存中吸收水分，使殘留水分含量增加，影響制品的穩(wěn)定性，因此合理的氯化鈉濃度，可增強凍干制品在長期儲存時的穩(wěn)定性；6.配方中的主要賦型成分為甘氨酸，是20種蛋白氨基酸中分子量最小的一個，因甘氨酸為具有氨基和羧基的兩性離子，有很強的緩沖性，故提升了對活性不穩(wěn)定的目的蛋白的保護作用；7.本凍干保護劑配方不含糖，便于合并有糖尿病的患者使用，避免由于輸注含糖制劑引起的糖尿病患者血糖水平升高；8.耐熱性好，經(jīng)檢測本凍干配方玻璃轉(zhuǎn)化溫度大于140°C， 故可避免在100°C 30min滅活過程中凍干微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在加熱滅活的條件下有效保護了目的蛋白的活性，且指示病毒得以有效地滅活；9.復(fù)溶時間短，采用本配方的人凝血因子珊成品，用滅菌注射用水溶解時間〈lmin，遠優(yōu)于藥典30min內(nèi)溶解的要求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1:熱滅活前人凝血因子VDI制品；
[0022]圖2:熱滅活后人凝血因子VDI制品；
[0023]圖3:實驗例4之各配方(共15組)凍干后外觀，配方編號(每排編號從左到右):第一排:10、11 ;第二排:7、8、9、15、12 ;第三排:1、2、3、4、5、6、13、14。[0024]圖4:干熱法滅活人凝血因子VDI制品中PPV動力曲線；
[0025]圖5:干熱法滅活人凝血因子VDI制品中EMCV動力曲線；
[0026]圖6:干熱法滅活人凝血因子VDI制品中HIV動力曲線。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]1.配制凍干保護劑緩沖液。使用滅菌注射用水充分溶解氯化鈉、枸櫞酸鈉、甘氨酸、氯化鈣、鹽酸賴氨酸，并用6!1101/1鹽酸溶液調(diào)整？11至6.9，定容。使各成分終濃度為:氯化鈉102mmol/L、枸櫞酸鈉10mmol/L、甘氨酸266mmol/L、氯化韓lmmol/L、鹽酸賴氨酸34mmol/L,除菌過濾即得本凍干保護劑緩沖液。
[0029]2.得到人凝血因子VDI原液，采用上述凍干保護劑緩沖液進行超濾透析得到人凝血因子VDI半成品
[0030]3.步驟2所得人凝血因子珊半成品除菌過濾、分裝、凍干。
[0031]4.步驟3所得樣品，進行100 °C 30min滅活。
[0032]以下實驗例表明本發(fā)明的積極效果。
[0033]實驗例I
[0034]制備人凝血因子VDI原液，將原液分為2份，其中一份以實施例1步驟1、2制備I批人凝血因子VDI半成品(表7中以配方M代表)；另一份采用一種含有人血白蛋白的凍干保護劑配方(表7以配方N代表)制備成半成品。參照實施例1步驟3進行凍干，進行80°C 72小時滅活，留取凍干后(即熱滅活前)和滅活后樣品。比較外觀，結(jié)果見圖1和圖2。
[0035]由實驗結(jié)果可知，含白蛋白組在干熱滅活后明顯萎縮(見圖2 )，而本專利配方組制品滅活后依然是乳白色疏松體。(見圖2)
[0036]測定兩組配方的玻璃轉(zhuǎn)化溫度，經(jīng)檢測:配方M的玻璃轉(zhuǎn)化溫度測定結(jié)果<80°C ；配方N的玻璃轉(zhuǎn)化溫度測定結(jié)果為>140°C。
[0037]凍干后制品的微觀結(jié)構(gòu)有玻璃狀態(tài)、粘彈狀態(tài)和熔融狀態(tài)。隨著加熱進行，將從玻璃狀態(tài)轉(zhuǎn)換為粘彈狀態(tài)和熔融狀態(tài)。期間變換點分別為玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg)和熔點(Tm)。其中玻璃態(tài)是最為堅固的狀態(tài)，分子不能自由移動。而粘彈狀態(tài)時非結(jié)晶部分可以有一定的流動性(可以變形)，但玻璃態(tài)和粘彈狀態(tài)在宏觀表現(xiàn)均為固態(tài)。這也就解釋了為什么配方M在滅活后會發(fā)生變形，即當加熱到大于配方M的Tg溫度(<80°C )后，配方M的微觀結(jié)構(gòu)由玻璃狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檎硰棤顟B(tài)，樣品具有一定流動性和變形性。微觀結(jié)構(gòu)不再穩(wěn)定，微觀改變引起宏觀變化，即發(fā)生萎縮，導(dǎo)致制品不易復(fù)溶或復(fù)溶后外觀不合格，而復(fù)溶后外觀是產(chǎn)品質(zhì)量的重要考核指標。但是本發(fā)明的配方經(jīng)檢測其Tg>140°C，保證其在滅活過程中，不會引起微觀結(jié)構(gòu)變化，復(fù)溶后外觀完好。因此證明了本配方的優(yōu)越性。
[0038]實驗例2
[0039]制備人凝血因子VDI原液，將原液分為2份，其中一份以實施例1步驟1、2制備I批人凝血因子VDI半成品(表1中以配方M代表)；另一份采用一種含有人血白蛋白的凍干保護劑配方(表1以配方N代表)制備成半成品。兩組樣品均按照樣品:指示病毒(9:1)的比例加入指示病毒PRV，留取凍干前樣品。參照實施例1步驟3進行凍干，進行80°C 72小時滅活，留取凍干后和滅活后樣品。所得樣品進行殘余病毒滴度檢測，評價病毒滅活效果，結(jié)果見表1。
[0040]表180°C 72h滅活人凝血因子VDI中指示病毒PRV的效果
【權(quán)利要求】
1.一種人凝血因子VDI凍干保護劑，其特征在于，它是在注射用水中溶解有下濃度組分形成的緩沖液: 氯化鈉 10-200mol/L 枸櫞酸鈉2-50mol/L 甘氛酸 50-600mol/L 氯化 1丐 l-30mol/L 鹽酸賴氨酸l_200mol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人凝血因子珊凍干保護劑，其特征在于，該凍干保護劑的PH為 6.5-7.5。
3.一種人凝血因子VDI凍干保護劑的制備方法，包括以下步驟: 步驟一:將氯化鈉、枸櫞酸鈉、甘氨酸、氯化鈣、鹽酸賴氨酸充分溶解于滅菌注射用水中，使各成分終濃度為:氯化鈉10-200mol/L ;枸櫞酸鈉2-50mol/L ;甘氨酸50-600mol/L ；氯化鈣l_30mol/L ;鹽酸賴氨酸l_200mol/L ； 步驟二:調(diào)整pH至6.5-7.5定容，除菌過濾即得人凝血因子珊凍干保護劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟二中，是用6mol/L鹽酸溶液調(diào)整pH。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟二中，所述的除菌過濾的具體方法是采用0.22 ii m的微孔濾膜`除菌過濾。
6.一種凍干人凝血因子珊的制備方法，其特征在于，用權(quán)利要求1或2所述的人凝血因子珊凍干保護劑對人凝血因子珊原液進行超濾透析得到人凝血因子VDI半成品，經(jīng)除菌過濾、分裝、凍干后進行熱滅活。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的凍干人凝血因子珊的制備方法，其特征在于，進行熱滅活的具體方法是采用100°c 30分鐘滅活。
【文檔編號】A61K38/37GK103611162SQ201310674256
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】李策生, 鄒莉, 胡勇, 李陶敬, 邢延濤, 周志軍, 林連珍, 彭焱, 周雁翔, 高少陽, 方亮, 陳克金, 鄧志軍, 李娟 , 鄒煒, 鄒光榮 申請人:武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司