抑制血管內皮生長因子受體基因表達的脫氧核酶的制作方法

抑制血管內皮生長因子受體基因表達的脫氧核酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制血管內皮生長因子受體基因表達的脫氧核酶。所述脫氧核酶包括一個催化功能序列GGCTAGCTACAACGA，及連接在其兩端的5’端和3’端結合序列；催化功能序列切割靶序列的任一嘌呤核苷酸與嘧啶核苷酸的連接鍵，而5’端和3’端結合序列與靶序列切割位點兩側的序列互補。本發(fā)明的脫氧核酶以血管表皮生長因子受體1（VEGFR-1）為靶基因，通過特異性切割VEGFR-1的mRNA或pre-mRNA，降低VEGFR-1基因的表達，抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤生長。
【專利說明】抑制血管內皮生長因子受體基因表達的脫氧核酶
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一類靶向腫瘤血管新生血管基因的脫氧核酶，具體地說涉及一類可抑制血管內皮生長因子受體VEGFRl基因表達，抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤生長的脫氧核酶。
【背景技術】
[0002]新生血管生成是指從既存的脈管系統(tǒng)上經(jīng)過多步驟、在多因素的作用下形成的新的血管系統(tǒng)，是促血管形成因子和血管生成抑制因子相互調控的結果。正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡打破就會激活血管系統(tǒng)，促進血管生成或抑制血管系統(tǒng)。正常的血管生成只在某些特定的生理過程中出現(xiàn)，如胚胎發(fā)育、傷口愈合、月經(jīng)周期等，而異常的血管生成則是腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、動脈粥樣硬化等疾病的病理表現(xiàn)之一。
[0003]腫瘤血管不同于正常組織的血管[I]，生長不具可控性，結構異常，分布紊亂，缺乏正常的微循環(huán)的功能，但仍具旺盛的提供營養(yǎng)和氧氣、排泄廢物的能力，是腫瘤生長和轉移的病理基礎，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要地位。目前，腫瘤血管已成為腫瘤分子靶向治療中最重要的靶點。自Folkman首次提出靶向血管生成可以抑制腫瘤生長成為一種治療方式以來[2]，大量的實驗研究與臨床實驗證實抑制腫瘤介導的血管生成可以有效地抑制腫瘤的生長和轉移[3-5]，已有數(shù)十個靶向血管的抗癌藥物進入臨床，他們與放化療的聯(lián)合應用顯示出良好的應用前景。針對腫瘤血管的靶向治療主要分為兩類[6]，一是抗血管新生制劑(ant1-angiogenic inhibitors, Al),即抑制腫瘤血管的生成,主要作用于腫瘤的早期治療階段或者用來預防有轉移潛能的腫瘤治療；二是腫瘤血管阻斷制劑(vascular-disruptingagents, VDA)，即破壞已生成的血管，利用該制劑特異性結合腫瘤血管的配體或者選擇性破壞異常的血管相關因子，主要用來治療已經(jīng)形成的體積較大腫瘤?；贏l和VDA的不同作用特點，兩者聯(lián)用可以有效提高療效[7]。
[0004]在眾多的促血管生成因子中，血管內皮生長因子(VEGF)是最早發(fā)現(xiàn)的作用最強的促血管生長和增加血管通透性的因子，越來越多的研究顯示[8]，血管內皮生長因子家族(vascular endothelial growth factor family,VEGFs)通路在腫瘤的生長和轉移中起著重要作用。VEGF通過與血管內皮生長因子受體(VEGFR)的結合使VEGFR 二聚體化，形成同源二聚體或異源二聚體，磷酸化的酪氨酸殘基可以調控激酶的活力，參與內皮細胞的分化、增殖和遷移，也可為胞漿中的信號分子提供結合結構域，參與下一級的細胞信號傳導[9]。
[0005]VEGFR-1屬三個酪氨酸蛋白激酶受體家`族之一 [10]，分子量約為180kDa，其蛋白質結構分為胞內區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)三個部分，其中胞外區(qū)負責與配體結合，具有7個免疫球蛋白樣袢，配體結合域位于氨基端3個loop內口。在人類，編碼VEGFR-1的基因位于染色體13ql2_ql3，基因全長7680bp，編碼1338個氨基酸。VEGFR-1是VEGF的三個酪氨酸激酶受體之一，是結合VEGF-A的細胞膜錨定的酪氨酸激酶受體，也是結合VEGF-B和PlGF的唯一酪氨酸激酶受體[11]。VEGFR-1介導的信號通路，尤其是與配體PIGF結合引起的信號主要介導病理性血管的形成。大量研究發(fā)現(xiàn)該激酶域對于單核巨噬細胞調節(jié)血管的滲透性以及PIGF誘導的血管新生是必不可少的，靶向VEGFR-1的小分子抑制劑均能有效抑制腫瘤的血管新生[12]。
[0006]VEGFR-1陽性的骨髓造血祖細胞能調節(jié)VEGFR-2陽性內皮祖細胞的招募和外滲，促進VEGFR-2進入血管參與新生血管的形成，為腫瘤細胞的傳播共同建立轉移微環(huán)境
[13]。選擇性抑制VEGFR-1消除了腫瘤微小轉移龕的形成，從而降低了腫瘤的微轉移。綜上所述，VEGFR-1信號通路在炎癥和轉移、調節(jié)和促進腫瘤血管生成方面有至關重要的作用，以VEGFR-1為靶點的抗腫瘤治療是一個應用前景可觀的領域。
[0007]脫氧核酶是利用體外分子進化技術獲得的一種具有催化功能的短片段單鏈DNA，具有高效的催化活性和結構識別能力。脫氧核酶將高效的催化降解能力與反義的靶向識別能力結合，能夠特異地針對靶標從mRNA水平關閉靶基因，從而調控目標蛋白質的表達，是一種高效特異的靶向基因治療的新策略[14]。脫氧核酶獨特的化學本質為脫氧寡核苷酸，性質相對穩(wěn)定；分子量小，結構相對簡單，對底物的趨近性好；催化效率及特異性高，副作用低；靶位點選擇的限制更少；易于合成，價格低廉。利用脫氧核酶靶向VEGFR-1將提供一種新型抗腫瘤血管生成并抑制腫瘤生長的制劑。
[0008]參考文獻
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【發(fā)明內容】

[0023]本發(fā)明的目的是提供一類下調血管內皮生長因子受體I (VEGFR-1)表達的，通過抑制腫瘤血管生成治療腫瘤的脫氧核酶靶向藥物。
[0024]本發(fā)明所提供的脫氧核酶是通過下調血管內皮生長因子受體I的表達，從而抑制腫瘤的生長。脫氧核酶是一種新型的基因抑制劑，其具有反義寡核苷酸的化學穩(wěn)定性，同時又具有核酶的催化切割RNA的功能，且其合成費用很低?；谶@些獨特的優(yōu)點，該技術已被廣泛用于體內和體外的基因調控。
[0025]所述脫氧核酶是一種DNA分子，可特異性地識別并切割靶mRNA或pre-mRNA，其結構如圖1所示。其中N=G, U，C，A ;R*Y為切割位點；R=A或G ；Y=U或C。脫氧核酶包括:
[0026](I)一個催化功能序列GGCTAGCTACAACGA，以此切割靶基因mRNA或pre-mRNA的任一嘌呤核苷酸與嘧啶核苷酸的連接鍵；
[0027](2)5’端和3 ’端結合序列，各為5~12個核苷酸，分別與靶序列切割位點兩側的序列互補；5’端和3’端結合序列由催化功能序列連接。
[0028]脫氧核酶的5’端和3’端結合序列又稱為其兩臂，優(yōu)選的，在選擇靶向切割位點時，調整脫氧核酶兩臂的長度使每條臂與靶序列結合的？G° ( -lOkcal/mol。
[0029]本發(fā)明脫氧核酶的靶基因是人VEGFR-1基因。VEGFR-1在眾多腫瘤中高表達，對VEGFR-1的基因表達的抑制可有效抑制腫瘤生長。
[0030]脫氧核酶由27~39個核苷酸殘基組成，自5'到3'的方向，由磷酸酯鍵連接。為增強脫氧核酶的穩(wěn)定性，可對其磷酸酯鍵進行化學修飾以提高脫氧核酶的抗酸和抗酶降解的能力，例如，以硫代磷酸酯鍵代替磷酸酯鍵，形成鎖核酸(Locked nucleic acids,LNA)或肽核酸(peptide nucleic acids, PNA)。優(yōu)選硫代磷酸酯鍵修飾,在所述脫氧核酶的5’端和/或3’端結合序列中可含有1-6個硫代磷酸酯鍵。
[0031]穩(wěn)定性的增強還可以通過其他化學修飾實現(xiàn)，包括:
[0032]I)對堿基、糖基和主干結構的修飾。對堿基的修飾，例如，甲基化堿基、羥甲基化的堿基等。對糖基的修飾，例如2’位3’位取代脫氧核糖核酸。核糖基和單核苷酸之間的連接鍵稱為核酸的主干結構。對主干結構的修飾包括連接鍵以及其它可以增強穩(wěn)定性和親和性的修飾，及增加一些取代基，例如，二胺(diamine)、膽固醇或其它親脂性基團，2’ -O-甲基磷酸二酯鍵，2’-0-(CH2)n-0CH3，2’-氟，雜合連接鍵，其它主干結構的修飾。具體的例子有，在堿基相對于天然右旋異構體糖為反向時，可使用左旋(L-)異構體脫氧核糖；或將糖基的2’ -位以2’ -鹵素兀素,2’ -0-烷基,2’ -0-(亞烷基)n_0-烷基取代；或者使用下列連接鍵:2’ -0-甲基磷酸二酯鍵。本發(fā)明的脫氧核酶可具有部分修飾，或全部修飾，或是不同修飾的組合。優(yōu)選的是糖基2’-0-甲基修飾。
[0033]2)末端保護:在分子的末端加入保護基因，以防止分子的降解。這種保護可以是5’端，也可以是3’端，或是兩端均被保護。例如，反向連接堿基，雙脫氧核苷酸，甲憐酸基，烷基、芳基，cordycepin, cytosine arabanoside, 2’ -甲氧基、乙氧基核苷酸、phosphorothioate連接鍵,3’ _0_甲基堿基,突光素,肽鍵連接,二氮苯基,膽固醇,生物素，acridine, rhodaminepsoralen, glyceryl, 丁醇基,丁基，已醇基和 3’ -0-烷基。優(yōu)選的是3’端反向連接堿基。
[0034]在本發(fā)明的一個實施例中，靶向VEGFR-1的脫氧核酶的設計是通過分析靶基因的mRNA序列，篩選出AU和⑶位點，進一步分析自由能水平，選出靶向位點。針對這些位點設計出對應的脫氧核酶。應用DNA合成儀器，合成所設計的脫氧核酶，并進行體外切割實驗，獲得具有高切割活性的脫氧核酶。
[0035]靶向VEGFR-1脫氧核酶的抗血管生成的生物學活性可以利用體內外模型進行驗證；抗腫瘤效應利用腫瘤細胞模型和小鼠移植瘤模型進行實驗驗證。
[0036]靶向VEGFR-1脫氧核酶的生物安全性通過常規(guī)藥理學和毒理學方法進行評價。
[0037]實驗證明，本發(fā)明的靶向VEGFR-1的脫氧核酶通過特異性地切割VEGFR-1的mRNA，降低VEGFR-1基因的表達，抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤生長。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1是脫氧核酶序列與結`構示意圖。
[0039]圖2顯示了靶向VEGFR-1脫氧核酶的脫氧核酶體外切割活性分析結果。
[0040]圖3顯示了靶向VEGFR-1脫氧核酶對脫氧核酶對微管形成的影響。
[0041]圖4顯示了靶向VEGFRl脫氧核酶DT18及對照體外切割動力學。
[0042]圖5顯示了靶向VEGFRl脫氧核酶DT18及對照體外切割定量結果。
[0043]圖6顯示了脫氧核酶DT18抑制VEGFR-1在細胞中的表達。
[0044]圖1顯示了脫氧核酶DT18對體內對角膜血管形成的影響。
[0045]圖8是脫氧核酶抑制角膜新生血管形成的定量分析結果。
[0046]圖9顯示了脫氧核酶DT18對新生黑色素瘤生長的抑制作用(n=8)。
[0047]圖10顯示了脫氧核酶DT18抑制裸鼠移植人鼻咽癌生長(n=5)。
[0048]圖11顯示了脫氧核酶DT18抑制腫瘤組織中VEGFR-1的表達。
[0049]圖12顯示了脫氧核酶DT18對移植瘤內血管通透性的影響。
[0050]圖13顯示了脫氧核酶DT18對主要臟器組織形態(tài)學的影響。
【具體實施方式】
[0051]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內。
[0052]實施例1:靶向VEGFR-1mRNA脫氧核酶切割位點的分析與設計
[0053]VEGFR-1在許多腫瘤組織中均為高表達，靶向抑制VEGFR-1表達可抑制腫瘤的新生血管生成，從而促進腫瘤細胞死亡。
[0054]本實施例中，將利用人HUVEC細胞篩選脫氧核酶，并在小鼠模型中加以分析與驗證。為保證靶向VEGFR-1的脫氧核酶在鼠和人中都有效，必須設計針對小鼠/大鼠和人的VEGFR-1mRNA保守區(qū)域的脫氧核酶。在高度同源區(qū)選取潛在的靶位點，運用nearestneighbor方程計算候選脫氧核酶與靶序列結合的自由能(AG。)，略微調整核酶兩臂的長度使每條臂與靶序列結合的AG。S-lOkcal/mol。另外因為小鼠/大鼠和人的序列同源性存在差異，所以脫氧核酶的兩條臂序列可能為對稱或者非對稱鏈。根據(jù)以上原則共篩選到11個潛在的靶位點，并針對11個靶位點構建了靶向VEGFR-1的脫氧核酶(表1)。同時，將脫氧核酶的底物識別序列不變，而催化中心的堿基序列改變?yōu)?’AGCAACATCGATCGG3’ (SEQID如-口^構建成無酶活性的對照工附-以!^。為了提高脫氧核酶的穩(wěn)定性，將脫氧核酶及對照分子的兩端各2個堿基進行硫代磷酸化修飾；為了檢測脫氧核酶的轉染效率及其在細胞內的分布情況，將脫氧核酶5’端用FITC標記。進行細胞外實驗的脫氧核酶均經(jīng)PAGE純化，進行細胞內實驗的均經(jīng)HPLC純化。
[0055]表1:靶向VEGFR-1脫氧核酶的靶位點及核苷酸序列
[0056] 脫氧核酶~革巴位點結合臂脫氧核酶序列(5’—3’)# 序列號
DT102509/7 agctgaccaggctagctacaacgaggtgagc SEQID No: I
DT113539/7 ccttttaaaggctagctacaacgatcagttc SEQID No； 2
DT128438/9 tcttt^au^cta^ctacaac^a^tt^cattt SEQID No: 3
DT139438/5 tatttggaggctagctacaacgaatctaSEQID No: 4
DT1413247/6 gccttcaggctagctacaacgatttcatSEQID No: 5
DT1515927/7 ttgtctgggctagctacaacgatgcccagSEQ ID No: 6
DT1617539/9 tgctctcaaggctagctacaacgatctgtttcc SEQID No: 7
DT1719106/6 ggcacaggctagctacaacgactgtgaSEQID No: 8
DT1820987/5 agagtgaggctagctacaacgaggagtSEQID No: 9
DT1921617/6 ttcctggggctagctacaacgatctgcaSEQID No: 10
DT2023239/7 accaagtgaggctagctacaacgactuaguc SEQID No: 11
[0057]#根據(jù)同源序列長短和自由能計算，脫氧核酶分別包含對稱或不對稱結合臂。催化活性序列以下劃線標注。
[0058]實施例2:祀向VEGFR-1脫氧核酶的體外切割活性
[0059]脫氧核酶具有自身催化和高效、靶向序列特異性的功能，因此，體外的切割反應直接反應它在體外的活性。使用I7RNA聚合酶進行體外轉錄翻譯來準備體外切割實驗所需要的模板。體外轉錄反應使用HAmpliscribe體外轉錄試劑盒(Epicentre, Wisconsin),操作按試劑盒說明書進行。以帶T7啟動子編碼VEGFR-1的可溶性部分的線性化質粒(PI7-VEGFR1)為模板，I7RNA聚合酶轉錄出VEGFR-1RNA片段，作為脫氧核酶切割反應的底物。切割反應體系含MgC12 (IOmM)，Tris-Cl (50mM，pH=7.5)，體外轉錄的底物RNAl ill (Ipmol)，脫氧核酶I ill (Ipmol)，0.1%DEPC水補足至10 yl。反應體系放置于85°C，30秒；37°C，5分鐘；再次溫育60分鐘，然后加入等體積的終止緩沖液終止反應(98%甲酰胺，IOmM的EDTA和0.1%上樣染料)。產(chǎn)物通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳I小時，75W。將凝膠在PhosphorImager (磷屏)曝光，條帶使用ImageQuant軟件進行分析。
[0060]通過圖2可以看出，除DT20外，脫氧核酶DT10、DT11、DT12、DT13、DT14、DT15、DT16、DT17、DT18、DT19均出現(xiàn)條帶明顯的切割產(chǎn)物，切割產(chǎn)物大小集中在0.30-2.32kb之間。
[0061]實施例3:祀向VEGFR-1脫氧核酶體外抑制血管形成[0062]內皮細胞在經(jīng)過長期培養(yǎng)后會自行排列成微血管樣結構，可通過相位差顯微鏡以及穿透式電子顯微鏡來進行觀察。微管形成實驗是目前常用于腫瘤血管生成的一種體外實驗的方法，研究中常利用此現(xiàn)象來觀察和評估藥物及生長因子對于血管生成的影響。該方法是在原有的二維培養(yǎng)系統(tǒng)中加入細胞外基質。使得內皮細胞生長在基質中形成三維培養(yǎng)，以便于進行組織學切片與觀察微管的結構。
[0063]為了篩選靶向VEGFR-1mRNA效果最佳的脫氧核酶，通過微管形成實驗分別分析已設計合成的11種脫氧核酶抑制小管形成的能力。轉染前一天，HUVEC以1-1.4*104/孔均勻鋪板，六孔板置于37°C過夜，次日細胞密度接近80-90%。脫氧核酶通過轉染試劑TMP進行轉染，脫氧核酶:TMP以1:3的比例在轉染前混合15min，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時后換成完整培基過夜，轉染后48小時，胰酶消化，完整培基終止消化后2000rpm離心6min，完全培基洗一遍再次離心一遍，大約以30000個細胞/孔種植于96孔板內，下面鋪有100 u I的基底膜膠，2小時候后培基換成低血清培基，37°C培養(yǎng)過夜，4-6小時至次日拍照。
[0064]通過圖3及表2可以看出，靶向VEGFR-1mRNA脫氧核酶DT18處理的內皮細胞幾乎沒有看見完整的微管形成^了川^了口^”么口了^^”了^了…處理的內皮細胞可見微管形成部分被阻斷；DT11、DT13、DT16、DT20組均可見相對完整的微管形成，但相對于未處理組，微管的形態(tài)稍差。因此，DT18被選為先導分子(Lead molecule),進一步加以研究。
[0065]表2:脫氧核酶影響微管形成結果匯總*
[0066]
【權利要求】
1.一種特異性抑制血管內皮生長因子受體基因表達的脫氧核酶，該脫氧核酶以血管內皮生長因子受體VEGFR-1基因的mRNA或pre-mRNA為靶序列，包括:一個催化功能序列GGCTAGCTACAACGA，及連接在其兩端的5’端結合序列和3’端結合序列；其中，所述催化功能序列用于切割靶序列的任一嘌呤核苷酸與嘧啶核苷酸的連接鍵；5’端結合序列和3’端結合序列各為5~12個核苷酸，分別與靶序列切割位點兩側的序列互補。
2.根據(jù)權利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶由27~39個核苷酸殘基組成。
3.根據(jù)權利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶的5’端結合序列和3’端結合序列各自與靶序列結合的AG。^-10kcal/molo
4.根據(jù)權利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述靶序列的切割位點是AU或GU的連接鍵。
5.根據(jù)權利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶選自序列表中SEQIDNo:1 至 SEQ ID No:11 之一。
6.根據(jù)權利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶的5’端結合序列和/或3’端結合序列中含有1-6個硫代磷酸酯鍵。
7.根據(jù)權利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶具有以下一種或多種化學修飾:3’ -3’反向連接堿基、鎖核酸、肽核酸和糖基2’ -甲氧基修飾。
8.根據(jù)權利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶靶向的VEGFR-1基因是人和/或鼠的VEGFR-1基因。
9.權利要求1~8任一 所述脫氧核酶在制備抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103627709SQ201310655835
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權日:2013年12月6日
【發(fā)明者】孫侖泉, 楊力芳 申請人:孫侖泉, 楊力芳