補(bǔ)體拮抗劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及補(bǔ)體拮抗劑及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種單鏈反義低聚物，其長(zhǎng)度為約10至50個(gè)核苷酸，并且具有與編碼由SEQ?ID?NO:1表示的補(bǔ)體成分6（C6）序列的核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域具有至少80%的序列同一性的鄰核苷堿基序列；其中，低聚物靶向于從SEQ?ID?NO:1的（從“A”處開始）ATG起始位點(diǎn)處開始的大約112-152、433-473、546-586、706-746、或1015-1055個(gè)核苷酸，并且能夠降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)的C6mRNA表達(dá)水平。本發(fā)明的應(yīng)用包括在哺乳動(dòng)物中發(fā)生急性或慢性神經(jīng)損傷后制備促進(jìn)神經(jīng)再生的藥物的應(yīng)用。另外的應(yīng)用包括單獨(dú)使用或與其他藥物聯(lián)用來治療多發(fā)性硬化癥。
【專利說明】補(bǔ)體拮抗劑及其應(yīng)用
[0001]本發(fā)明是申請(qǐng)日2009年7月10日、標(biāo)題為“補(bǔ)體拮抗劑及其應(yīng)用”申請(qǐng)?zhí)?00980135430.1的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)的引用
[0003]本申請(qǐng)為于2008年7月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/079，501號(hào)的繼續(xù)申請(qǐng)。本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/079，501號(hào)以及于2008年7月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/079，554號(hào)、第61/079，497號(hào)和第61/079，488號(hào)的優(yōu)先權(quán)。美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/079，501號(hào)、第61/079，554號(hào)、第61/079，497號(hào)、和第61/079，488號(hào)的公開內(nèi)容均以引
用的方式結(jié)合于本發(fā)明中作為參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及例如用于調(diào)控補(bǔ)體成分6 (C6)的表達(dá)的組合物和方法。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及減少或阻斷該蛋白質(zhì)表達(dá)的拮抗劑。本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用，包括用于在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)受到急性或慢性損傷后促進(jìn)神經(jīng)再生。
【背景技術(shù)】
[0005]補(bǔ)體系統(tǒng)包括一組約三十(30)種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被認(rèn)為是免疫應(yīng)答的一個(gè)重要部分。該系統(tǒng)可由經(jīng)典途徑(通常依賴于抗體)或旁路途徑(通常依賴于抗體)所激活。通過任何一種途徑的激活都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一種被稱為C5轉(zhuǎn)化酶的酶。該轉(zhuǎn)化酶有助于形成一種被稱為C5b的蛋白質(zhì)，相對(duì)于其他的功能，這種蛋白質(zhì)可以啟動(dòng)經(jīng)常被稱為末端補(bǔ)體途徑(的激活途徑)。這種途徑的目的是在侵入病原體的膜內(nèi)形成膜攻擊復(fù)合物(MAC)，從而導(dǎo)致溶胞作用。MAC—般通過補(bǔ)體蛋白C6、C7、C8、(C9)n以及C5b的連續(xù)組裝而形成。一般可參見 ffalport, M.J.2001.N.Engl.J.Med.344:1058-1066 ；以及 1140-1144。
[0006]已經(jīng)報(bào)道了補(bǔ)體系統(tǒng)的天然抑制劑和合成抑制劑。這些抑制劑包括，例如，某些小分子、蛋白質(zhì)、抗體、黃酮類化合物、和多糖。參見Bureeva等人，(2005)Drug DiscoveryTodaylO:1535。
[0007]神經(jīng)元變性是許多急性和慢性神經(jīng)病的標(biāo)志。軸突變性的一種模式(被稱為華勒變性(沃勒變性，Wallerian Degeneration, WD))是一個(gè)高度破壞的過程，其中傷口的軸突遠(yuǎn)端的部分死亡。在受傷后的幾小時(shí)就能夠看到最初的異常，在一天或兩天后會(huì)出現(xiàn)更加明顯的 WB (Ba llin RH 以及 Thomas PK(1969)Acta Neuropathol (Berl) 14:237)。例如，髓鞘崩解并被清除細(xì)胞所吞曬(Leonhard等人，(2002)Eur.J.Neurosc1.16:1654)。這些過程最終伴有神經(jīng)的修復(fù)和再生。有報(bào)告稱，某些補(bǔ)體成分可以調(diào)節(jié)髓磷脂的吞噬作用(Dailey等人，(2002) J.Neuroscil8:6713 ;和 Liu (1999) J.Peripher.Nerv.Syst.4:123)。雖然需要用來調(diào)節(jié)這些過程的補(bǔ)體分子存在某些不確定性，但是已經(jīng)有報(bào)告顯示，MAC的形成對(duì)于快速 WD 是必要的(Ramaglia, V.等人，(2007) J.Neurosc1.27:7663)。
[0008]已知存在各種核酸拮抗劑。例如，各種反義低聚物，它們都已經(jīng)顯示出在治療、診斷、和研究應(yīng)用等幾個(gè)方面的用途(參見例如Cheson，BD(2007)Ther Clin RiskManag.3(5):855 (例如討論對(duì)奧利默森(oblimersen)有促進(jìn)作用的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)))。短干擾RNA (siRNA)是一種類型的RNA拮抗劑，其已被建議作為一種有用的治療和研究工具(McManus 和 Sharp, (2002)Nature Reviews Genetics3:737)。也報(bào)告了存在其他的 RNA拮抗劑，例如具有中斷的過客鏈(隨從鏈，passenger strand)的RNAi誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(Leuschner 等人,(2006)EMBO Reports7:314)。
[0009]人們期望獲得例如具有阻斷或抑制哺乳類動(dòng)物的補(bǔ)體成分6 (C6)蛋白活性的拮抗劑。人們更期望獲得能夠用于預(yù)防、治療已知的或疑似的與MAC形成有關(guān)的神經(jīng)病，或使其嚴(yán)重程度減小的拮抗劑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明涉及例如降低或阻斷哺乳動(dòng)物補(bǔ)體成分6 (C6)蛋白質(zhì)活性的拮抗劑?？梢允褂檬纠缘霓卓箘﹣眍A(yù)防、治療已知的或疑似的與MAC形成有關(guān)的神經(jīng)病，或減小其嚴(yán)重程度。特定的拮抗劑的特征在于其具有阻斷或降低哺乳動(dòng)物補(bǔ)體6 (C6)蛋白表達(dá)的單鏈核酸和多鏈核酸(通 常為約為一條鏈、兩條鏈或約三條鏈)。本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用，包括用于在哺乳動(dòng)物中發(fā)生急性或慢性神經(jīng)損傷后促進(jìn)神經(jīng)再生。
[0011]一方面，本發(fā)明提供了一種低聚物，其長(zhǎng)度為約10至50個(gè)核苷酸之間，其具有與編碼由SEQ ID NO:1 (人)、SEQ ID NO:402 (大鼠)或SEQID NO:403 (小鼠)表示的補(bǔ)體成分6 (C6)序列或其天然存在的等位基因變異體的核酸的相應(yīng)區(qū)域具有至少80%序列同一性的鄰核苷堿基序列(contiguous nucleobase sequence)。優(yōu)選的低聚物包括至少一種核苷酸類似物，并且能夠使例如通過PCR試驗(yàn)所確定的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的C6mRNA表達(dá)水平降低至少約20%。
[0012]為簡(jiǎn)便起見，除非另外具體說明，詞組“哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體成分6 (C6)”將被簡(jiǎn)稱為“C6”、“哺乳動(dòng)物C6蛋白”等。
[0013]另一方面，本發(fā)明提供了一種優(yōu)選包括第一低聚物(過客鏈)和第二低聚物(反義鏈)的雙鏈核酸化合物，其優(yōu)選地靶向于編碼哺乳動(dòng)物C6蛋白(特別是人、大鼠或小鼠的C6)的核酸分子。在一種實(shí)施方式中，該化合物的各條鏈包括約12至約35個(gè)核苷堿基,且反義鏈由與編碼由SEQ ID NO:1 (人)、SEQ ID NO:402 (大鼠)或SEQ ID NO:403 (小鼠)或其天然存在的等位基因變異體表示的補(bǔ)體成分6 (C6)序列的核酸的相應(yīng)區(qū)域具有至少80%序列同一'I"生的鄰核苷堿基序列組成。優(yōu)選的低聚物包括至少一種寡核苷酸類似物。
[0014]另一方面，本發(fā)明提供了一種包括具有核心雙鏈區(qū)域的RNA復(fù)合物的組合物，該核心雙鏈區(qū)域包括由與編碼由SEQ ID NO:1 (人)、SEQ IDNO:402 (大鼠)或SEQ ID NO:403(小鼠)或天然存在的等位基因變異體表示的補(bǔ)體成分6 (C6)序列的核酸的相應(yīng)區(qū)域具有至少80%序列同一性的鄰核苷堿基序列組成的反義鏈。優(yōu)選地，該低聚物包括至少一種寡核苷酸類似物，RNA復(fù)合物還包括與該反義鏈雜交的中斷過客鏈。
[0015]本發(fā)明還提供了一種減少或抑制細(xì)胞或組織中的諸如人C6的哺乳動(dòng)物C6表達(dá)的方法。在一種實(shí)施方式中，該方法包括使細(xì)胞或組織與本發(fā)明的至少一種低聚物、雙鏈化合物或其他組合物接觸的步驟，其中本發(fā)明的至少一種低聚物、雙鏈化合物或其他組合物接觸的量足以減少或抑制細(xì)胞或組織中的C6蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0016]本發(fā)明還提供了一種用于治療、預(yù)防或減少由補(bǔ)體系統(tǒng)的不希望活性，尤其是由MAC的不希望形成介導(dǎo)的病癥癥狀的方法。在一種實(shí)施方式中，該方法包括向有需要的哺乳動(dòng)物(治療有效地或預(yù)防地)給予本發(fā)明的組合物的步驟，且該組合物的量足以減少或阻斷哺乳動(dòng)物體內(nèi)MAC的形成。本發(fā)明的范圍內(nèi)的優(yōu)選紊亂是神經(jīng)再生有缺陷或其他異常中的一種。
[0017]本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)再生的方法，該方法包括向哺乳動(dòng)物(治療有效地或預(yù)防地)給予至少一種本發(fā)明的組合物，該組合物的量足以減少或抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)的C6表達(dá)，并增強(qiáng)其中的神經(jīng)再生。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物體內(nèi)的MAC形成也減少或受到抑制。
[0018]本發(fā)明的實(shí)踐提供了重要的優(yōu)點(diǎn)。
[0019]例如，有報(bào)告稱，基于用肝臟外靶標(biāo)進(jìn)行的治療，肝臟有時(shí)候能夠螯合核酸并降低核酸的活性。
[0020]但是，肝臟是補(bǔ)體蛋白質(zhì)合成的主要部位，因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明化合物的螯合會(huì)有利地減少或阻斷C6蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0021]此外，本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)使用或與其他藥劑(包括至少一種其他的本發(fā)明組合物)聯(lián)用，以減少或抑制疑似或懷疑患有急性或慢性神經(jīng)病的哺乳動(dòng)物體內(nèi)MAC的形成。應(yīng)該認(rèn)為，在受傷前、受傷期間或受傷后，使用本發(fā)明將有助于促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的神
經(jīng)再生。
[0022]下文將進(jìn)一步討論本發(fā)明的其他應(yīng)用和優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是示出了用補(bǔ)體反義LNA治療3天后小鼠體內(nèi)的C6補(bǔ)體mRNA水平的圖表。在實(shí)施例2中解釋了批次的數(shù)目(Y軸)。
[0024]圖2是示出了在用靶向于補(bǔ)體蛋白質(zhì)C6、C8a、或C8b的LNA-修飾的寡核苷酸進(jìn)行治療后，小鼠血清中膜攻擊復(fù)合物(MAC)活性的效力的圖表。持續(xù)一周給予寡核苷酸。
[0025]圖3是示出了對(duì)小鼠給予不同量的寡核苷酸1010 (SEQ ID N0.413)與C6mRNA的校正水平之間的對(duì)比的圖表。還示出了相應(yīng)siRNA構(gòu)建體(construct)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026]如所討論的，本發(fā)明涉及例如優(yōu)選地阻斷或抑制哺乳動(dòng)物C6活性的拮抗劑。本文中提到的“核酸拮抗劑”是指包括核酸并優(yōu)選本文中披露的一種或多種核酸類似物或由核酸并優(yōu)選本文中披露的一種或多種核酸類似物組成的化合物。“RNA類似物”是預(yù)期功能為減少或阻斷特定的RNA(S)表達(dá)的核酸類似物。
[0027]—方面，本發(fā)明提供了用于降低編碼哺乳動(dòng)物C6的核酸分子的功能，優(yōu)選減少所產(chǎn)生的C6的量的低聚化合物(低聚物)。一個(gè)實(shí)例是反義化合物。這個(gè)目的是通過，例如，提供與編碼哺乳動(dòng) 物C6的一種或多種核酸特異性雜交的反義化合物來達(dá)到的。如本文中所使用的，術(shù)語“靶核酸”和“編碼C6的核酸”包含編碼哺乳動(dòng)物C6的DNA、從這樣的DNA轉(zhuǎn)錄得到的編碼哺乳動(dòng)物C6 (包括pre-mRNA和mRNA)的RNA、以及從這樣的RNA衍生的cDNA。感興趣的特定哺乳動(dòng)物C6是由表3 (SEQ ID NO:1)中示出的cDNA序列所編碼的人補(bǔ)體成分6 (C6)。另外一種感興趣的哺乳動(dòng)物C6序列是分別由SEQ ID N0.402和SEQ IDN0.403表示的大鼠C6和小鼠C6。
[0028]正如本文中所使用的，“寡核苷酸”是指本發(fā)明的化合物的成分，例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的低聚物或聚合物或它們的類似物。這一術(shù)語包括由天然存在的核苷堿基、糖類和共價(jià)核苷間(主鏈)鍵以及具有非天然存在部分的寡核苷酸所構(gòu)成的寡核苷酸。這種修飾的或取代的寡核苷酸經(jīng)常優(yōu)選具有天然的形式，原因在于其具有所期望的特性，例如，增加的細(xì)胞攝取、對(duì)核酸靶標(biāo)的親和力增加以及在例如核酸酶的存在下穩(wěn)定性增加。因此，符合本發(fā)明的要求的“低聚物”(包括復(fù)數(shù)形式)是一種包括天然存在的核苷堿基、糖類和共價(jià)主鏈鍵以及包括它們的一種或多種類似物的構(gòu)建體的寡核苷酸。
[0029]在本文中，術(shù)語“核苷酸”是指2-脫氧核糖(DNA)單元或核糖(RNA)單元，其通過其第一個(gè)碳連接于諸如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶(U)的含氮堿基上，并且通過其第五個(gè)碳原子連接于核苷間連接基團(tuán)(如下文中所定義的)或末端基團(tuán)(如本文中所定義的)。因此，當(dāng)本文中使用時(shí)，術(shù)語“核苷酸”包括RNA單元(或單體)，該RNA單元(或單體)包含通過其第一個(gè)碳連接于諸如A、C、T、G或U的含氮堿基，并且通過其第五個(gè)碳原子連接于磷酸基或末端基團(tuán)的核糖單元。類似地，術(shù)語“核苷酸”也包括DNA單元(或單體)，該DNA單元(或單體)包含通過其第一個(gè)碳連接于諸如A、C、T、G或U的含氮堿基，并且通過其第五個(gè)碳原子連接于磷酸基或末端基團(tuán)的2-脫氧核糖單元。術(shù)語“核苷酸”還包括如在本文中所描述的這樣的RNA和DNA單體的變體或類似物。
[0030]“核苷酸”意指單元通過其第一個(gè)碳連接于諸如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T )、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶(U)的含氮堿基的2-脫氧核糖(DNA)單元或核糖(RNA)單元。因此，當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“核苷酸”包括RNA單元(或單體),該RNA單元(或單體)包含通過其第一個(gè)碳連接于諸如A、C、T、G或U的含氮堿基的核糖單元。類似地，術(shù)語“核苷酸”還包括DNA單元(或單體), 該DNA單元(或單體)包含通過其第一個(gè)碳連接于諸如A、C、T、G或U的含氮堿基的2-脫氧核糖單元。術(shù)語“核苷酸”還包括如在本文中所提供的這樣的RNA和DNA單體的變體或類似物。應(yīng)該理解的是，通過諸如本文中提供的那些天然存在的和合成的鍵的核苷間連接基團(tuán)將各核苷酸連接在一起。
[0031]反義低聚物
[0032]不希望受到理論的約束，應(yīng)該認(rèn)為具有其靶核酸的低聚化合物的特異性雜交干擾了核酸的正常功能。通過與靶核酸特異性雜交的化合物對(duì)靶核酸的功能進(jìn)行的調(diào)節(jié)通常被稱為“反義”。被干擾的DNA功能包括，例如，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的RNA的功能包括至少一些重要的功能，例如，將RNA易位到蛋白質(zhì)翻譯的位置處、翻譯來自RNA的蛋白質(zhì)、剪接RNA從而產(chǎn)生一種或多種mRNA物質(zhì)、以及RNA參與或促進(jìn)的催化活性。對(duì)靶核酸功能所進(jìn)行的這種干擾的總體效果是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物C6蛋白質(zhì)的表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，“調(diào)節(jié)”是指增加(刺激)或減少(抑制)與適當(dāng)控制有關(guān)的基因表達(dá)，例如在不存在低聚物時(shí)的表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，抑制是調(diào)芐基因表達(dá)的優(yōu)選形式，而mRNA是一個(gè)靶標(biāo)。
[0033]如本文中所使用的，“雜交”通常是指氫鍵結(jié)合，其可以是在補(bǔ)體核苷或核苷堿基之間的Watson-Crick氫鍵結(jié)合、Hoogsteen氫鍵結(jié)合或反向Hoogsteen氫鍵結(jié)合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互補(bǔ)核苷堿基，它們通過形成氫鍵來進(jìn)行配對(duì)。本文中所使用的“互補(bǔ)”是指能在兩個(gè)核苷酸之間進(jìn)行精確配對(duì)的能力。例如，如果在寡核苷酸的某一位置處的核苷酸能夠與DNA或RNA分子的相同位置處的核苷酸形成氫鍵，則寡核苷酸和DNA或RNA就被視為在該位置是彼此互補(bǔ)的。當(dāng)彼此間能夠形成氫鍵的核苷酸占據(jù)每一個(gè)分子中足夠數(shù)量的相應(yīng)的位置時(shí)，寡核苷酸與DNA或RNA就是彼此互補(bǔ)的。因此，“特異性雜交”和“互補(bǔ)”是用于表明足夠程度的互補(bǔ)或精確配對(duì)的術(shù)語，以使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶標(biāo)之間發(fā)生穩(wěn)定的并且特異性的雜交。
[0034]應(yīng)該理解的是，本發(fā)明化合物的序列與其將要特異性雜交的靶核酸的序列之間不需100%互補(bǔ)。例如，當(dāng)將該化合物結(jié)合于靶DNA分子或RNA分子時(shí)干擾了靶DNA或RNA的正常功能從而導(dǎo)致效用喪失，以及在需要特異性結(jié)合的情況下，即，在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況下的生理?xiàng)l件下，以及在實(shí)施體外測(cè)定的情況下，具有足夠程度的互補(bǔ)性從而避免反義化合物與非靶標(biāo)序列產(chǎn)生非特異性結(jié)合，反義化合物就是可特異性雜交的。
[0035]本發(fā)明的優(yōu)選低聚物通常通過電腦模擬(in siIico)設(shè)計(jì)(在某些情況下,通過體外測(cè)試和/或體內(nèi)測(cè)試)來識(shí)別。與本發(fā)明的優(yōu)選序列互補(bǔ)的靶位點(diǎn)在下文中被稱為“活性部位”，因此其是優(yōu)選的靶位點(diǎn)。因此，本發(fā)明的另一種實(shí)施方式包含與這些活性部位雜交的化合物。
[0036]本發(fā)明的一個(gè)目的是，例如，利用特定的低聚物作為反義化合物。將反義化合物或本發(fā)明的其他化合物“靶向于”特定的核酸是一個(gè)多步驟的過程。靶向過程經(jīng)常從確定其功能被調(diào)節(jié)的核酸序列的鑒定開始。例如，這可以是其表達(dá)與特定紊亂或疾病狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞基因(或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA),或者是來自病原體(infectious agent)的核酸分子。在本發(fā)明中，靶是編碼在表3中示出的哺乳動(dòng)物C6蛋白質(zhì)(尤其是人、大鼠和小鼠C6序列)(SEQ ID N0.1、402和403)的核酸分子。該靶向過程還包括確定在該基因內(nèi)發(fā)生反義相互作用的一個(gè)或多個(gè)部位，該反義相互作用包括，但不限于，蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)或調(diào)節(jié)。
[0037]另外需要考慮的包括低聚物的選擇，該低聚物與不希望的靶標(biāo)雜交的能力下降并且假定在溶液中難以形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。選擇本發(fā)明的更優(yōu)選的低聚物來降低毒性、減少miRNA樣種子區(qū)基因座和減少過客鏈調(diào)節(jié)的脫靶。例如，表4A-表4E和表5A-表5F示出了根據(jù)本發(fā)明其他優(yōu)選的低聚物。
[0038]現(xiàn)在參見表4A-表 4E, SEQ ID N0.2，24，46，68，90，112，134，156，178，200 是由表3表示的人C6序列(SEQ ID NO:1)的優(yōu)選祀標(biāo),表4中的序列以優(yōu)先性(preference)下降的順序在示出的每一種低聚物下方排列。因此，SEQ ID NO:2是具有由優(yōu)選的SEQ IDNo:3-SEQ ID No:23所示出的低聚物的人C6的一個(gè)優(yōu)選靶標(biāo)，其以靶向于該位置的優(yōu)先性下降的順序排列。再次參見表4A-表4E，其他優(yōu)選的靶包括在每一靶下方示出的由SEQID No:222、225、228、231、234、237、240、243、246 和 249 以及 RNA 和反向補(bǔ)體形式(reversecomplement version)所示出的那些序列。大鼠C6和小鼠C6有望具有相同或非常類似的靶位。
[0039] 某些實(shí)施方式的其他優(yōu)選的低聚物示出了人序列、大鼠序列和小鼠序列(例如，表5A-表5F;SEQ ID N0:292)之間具有100%的序列同一性。正如所了解的，這樣的低聚物可以用于人、大鼠和小鼠，而不會(huì)出現(xiàn)實(shí)質(zhì)的錯(cuò)配問題并且也不需要為每一種哺乳動(dòng)物設(shè)計(jì)多種低聚物。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的更加特定的低聚物與靶標(biāo)充分地互補(bǔ)，即，其與靶標(biāo)充分雜交且具有足夠的特異性，從而得到期望的結(jié)果。優(yōu)選地，所期望的效果是減少或完全抑制諸如人C6蛋白質(zhì)、大鼠C6蛋白質(zhì)或小鼠的C6蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物的C6的表達(dá)，其表現(xiàn)為減少或全面抑制如所確定的相應(yīng)C6mRNA的量，例如，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和/或使用抗-C6抗體的免疫方法來監(jiān)控蛋白質(zhì)。
[0041]在一種PCR方法中，可以設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中使用的寡核苷酸引物，以從任何感興趣的有機(jī)體中提取的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。合適的cDNA的實(shí)例是由表1表示的人C6序列(SEQ ID NO:1)。設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域中公知的，并且在 Sambrook 等人的《Molecular Cloning:A Laboratory Manual)) (1989)(第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Plainview,紐約)中公開，在下文中簡(jiǎn)稱為“Sambrook”。還可以參見 Innis 等人編著的《PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications》(1990) (Acdemic Press,紐約)；Innis 和 Gelfand 等人編著的《PCR Strategies)) (1995)(Acdemic Press,紐約);以及 Innis 和 Gelfand 等人編著的《PCR Methods Manual)) (1999)(Acdemic Press,紐約)。PCR的已知方法包括,但不限于,使用配對(duì)引物、巢式引物(nestedprimer)、單特異性引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等的方法。在實(shí)施例部分中描述了實(shí)施qPCR的方法。
[0042]如果需要的話，可以通過使用被認(rèn)為總?cè)苎栽囼?yàn)((CH50)試驗(yàn))的測(cè)試來測(cè)試并選擇性地定量化特定低聚物的其他功能。在這種方法中，從已接受一種或多種低聚物給藥的哺乳動(dòng)物中分離血漿、血液或其他合適的生物樣本。該試驗(yàn)測(cè)量了測(cè)試樣本使包覆有抗紅細(xì)胞抗體的綿羊紅細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化懸液溶解50%的能力。如果任何成分都是有缺陷的，那么總的補(bǔ)體活性就 被認(rèn)為是不正常的。參見例如Kabat，E.A和Mayer，Μ.Μ.(1961)Experimental Immunochemistry 中的 Complement and Complement Fixations,第二版，Charles C.Thomas, Springfield, IL.p.133-240。
[0043]在另一種方法中，如果想要使用Ramaglia, V.等人，(2007) J.Neurosc1.27:7663所描述的免疫方法，則能夠檢測(cè)并定量化MAC的形成。
[0044]此外，本發(fā)明的其他優(yōu)選低聚物顯示出良好的阻斷或減少編碼人C6、大鼠C6或小鼠C6的mRNA的能力。更具體地說，如合適的PCR試驗(yàn)(優(yōu)選qPCR)所確定的，這樣的低聚物能夠使諸如人、大鼠或小鼠的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的特定C6mRNA水平降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和99%，高達(dá)約100%。其他的優(yōu)選低聚物在諸如嚙齒動(dòng)物的哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)基本上沒有毒性。也就是說，在試驗(yàn)過程中它們不會(huì)使該哺乳動(dòng)物死亡，在試驗(yàn)中向該哺乳動(dòng)物給予治療有效量的低聚物持續(xù)一段合適的時(shí)間(例如，每天約lmg/kg IP至約10mg/kgIP,持續(xù)長(zhǎng)達(dá)幾天或幾周),從該哺乳動(dòng)物切除肝臟并將用作核酸(通常是RNA)的來源。使用標(biāo)準(zhǔn)程序從肝臟中制備核酸，并根據(jù)制造商的推薦使用RocheLightcycler480和通用探針qPCR來測(cè)量C6mRNA水平。實(shí)施例1中提供了示例性的試驗(yàn)，其中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的幾種低聚物相對(duì)地?zé)o毒，并且能夠使小鼠的C6mRNA降低至少約20%、30%和40% ;至少約50%、60%和70% ;至少約80%或超過約90%、95%，達(dá)到約99%或100%。本文中參考“低聚物確認(rèn)測(cè)試”就應(yīng)該參考前述的特異性試驗(yàn)，從而確定其無毒性和在體內(nèi)抑制C6mRNA的表達(dá)的能力。
[0045]低聚物的優(yōu)選應(yīng)用在于預(yù)防、治療已知的或疑似與MAC的形成有關(guān)的神經(jīng)病，或降低其嚴(yán)重程度。
[0046]雖然本發(fā)明提供了一種適合的低聚物或多種適合低聚物的組合，但通常優(yōu)選的低聚物是長(zhǎng)度為約10個(gè)核苷堿基至約50個(gè)核苷堿基之間的低聚物，例如，長(zhǎng)度為約12至約45個(gè)核苷堿基、長(zhǎng)度為約15至約40個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為約16至約35個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為約18至約30個(gè)核苷酸的低聚物可用于許多應(yīng)用。優(yōu)選地，該低聚物包括總長(zhǎng)度為10至50個(gè)核苷堿基，例如，長(zhǎng)度為約12至約45個(gè)核苷堿基、長(zhǎng)度為約15至約40個(gè)核苷堿基、長(zhǎng)度為約16至約35個(gè)核苷堿基、長(zhǎng)度為約18至約30個(gè)核苷堿基的鄰核苷堿基序列，這些低聚物具有許多有用的用途，其中鄰核苷堿基序列與編碼所感興趣的哺乳動(dòng)物C6的核酸的相應(yīng)區(qū)域具有至少80%的序列同一性，例如，約85%，約90%，約95%，或約98%的序列同一性。所感興趣的特定的序列是由SEQ ID NO:1表示的人C6、由SEQ ID N0:402表示的大鼠C6以及由SEQ ID N0:403表示的小鼠C6 (以及SEQ ID No: 1、402和403的天然存在的等位基因變異體)?？梢酝ㄟ^使用諸如本文中描述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)等公知的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定“天然存在的等位基因變異體”。
[0047]通過一種策略或多種策略的組合，能夠確定一對(duì)核酸之間同源性的程度。在一種方法中，序列的同一'丨生百分比是通檢查(inspection)來確定的。用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域公知的。因此，可以利用數(shù)學(xué)算法來確定任意兩個(gè)序列之間的同一性百分比。這樣的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Myers和Miller提出的算法(1988)，CAB10S4:11-17 ；Smith等人提出的局部同源性算法(1981), Adv.Appl.Math.2:482 ；Needleman和Wunsch提出的同源性比對(duì)算法(1970)，J.Mol.Biol.48:443-453 ；Pearson和Lipman提出的搜索類似性的方法(search-for-similarity-method) (1988), Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444-2448 ；Karlin 和 Altschul 提出的算法(1993)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877。
[0048]可以利用在計(jì)算機(jī)上執(zhí)行這些數(shù)學(xué)算法來比較序列，從而確定序列的同一性。這種執(zhí)行包括 ，但不限于:PC/Gene中的CLUSTAL程序(其可獲自Intelligenetics, MountainView, Calif.);ALIGN 程序(版本 2.0);ALIGNPLUS 程序(版本 3.0，版權(quán) 1997);以及 GeneticsComputer Group 的 Wisconsin 遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA，版本 10 (可獲自 Accelrys，9685Scranton Road,San Diego, Calif.92121，USA);Wisconsin遺傳學(xué)軟件包的版本10中所使用的評(píng)分矩陣是BL0SUM62(參見 Henikoff 和 Henikoff (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915)?？衫萌笔?shù)來實(shí)施使用這些程序的比對(duì)。其他的比對(duì)也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的考慮范圍之內(nèi)。參見美國(guó)專利第7，378，499號(hào)，其在本文中以引用方式作為參考。
[0049]除非另外指出，否則本文中所提供的核苷酸和氨基酸序列的同一性值/類似性值是指利用具有缺省參數(shù)的GAP或任何等效程序而獲得的值。通過“等效程序”，可以意圖獲得任何序列比較程序，對(duì)于所提出的任意兩個(gè)序列，當(dāng)與由優(yōu)選程序所產(chǎn)生的相應(yīng)的比對(duì)值(alignment)相比時(shí)，可以獲得具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配的比對(duì)值以及相同的百分比序列同一性。更多的信息請(qǐng)參見Needleman和Wunsch(1970) J.Mol.Biol.48:443-453。
[0050]對(duì)于本發(fā)明的目的，用于確定本文中描述的人C8序列、大鼠C8序列和小鼠C8序列的序列同一性百分比的核苷酸序列或蛋白質(zhì)序列的比較優(yōu)選是通過使用Wisconsin遺傳學(xué)軟件包(版本10或更新的版本)的GAP程序或任何等效的程序進(jìn)行的。對(duì)于核苷酸序列的GAP分析，使用重量(Weight)為50、長(zhǎng)度(Length)為3的GAP程序。
[0051 ] 如本文中所使用的，本文中的兩個(gè)核苷酸序列或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”是指當(dāng)通過特異性比較窗口對(duì)最大對(duì)應(yīng)性進(jìn)行比對(duì)時(shí)兩個(gè)相同序列中的殘基。當(dāng)使用有關(guān)蛋白質(zhì)的序列同一性的百分比時(shí)，應(yīng)該認(rèn)為不相同的殘基所在的位置經(jīng)常隨著氨基酸的保守置換的不同而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，帶電或憎水性)的其他氨基酸殘基所置換，并因此不改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)保守置換中的序列不同時(shí)，可以上調(diào)百分比序列同一性從而校正置換的保守性質(zhì)。隨著這種保守置換的不同而不同的序列被認(rèn)為具有“序列類似性”或“類似性”。實(shí)施這種調(diào)節(jié)的方式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是非常熟悉的。這通常涉及作為部分錯(cuò)配而不是全部錯(cuò)配的保守置換的得分，從而提高了序列同一性的百分比。因此，例如，在對(duì)相同的氨基酸的得分是I而保守的置換的得分是O的情況下，保守的置換的得分為O至I之間。計(jì)算保守置換的得分，例如，在PC/GENE程序中所計(jì)算的(Intelligenetics, Mountain View, Calif.)。
[0052]如在本文中所使用的，“序列同一性的百分比”是指通過比較窗口對(duì)兩個(gè)最佳比對(duì)的序列進(jìn)行比較而確定的值，其中，當(dāng)與兩個(gè)序列的最佳比對(duì)的基準(zhǔn)序列(其不包括增加部分或刪除)進(jìn)行比較時(shí)，比較窗口中的多核苷酸序列部分可以包含增加部分或刪除部分(即，間隙(gap))。通過確定位置的數(shù)量來計(jì)算百分比，其中，在兩個(gè)序列中出現(xiàn)了相同的核酸堿基或氨基酸殘基從而獲得匹配位置的數(shù)量，用配比位置的數(shù)量除以比較窗口中位置的總數(shù)，然后將結(jié)果乘以100，從而獲得序列同一性的百分比。
[0053]另外還要指出的是，如果兩個(gè)分子在嚴(yán)格的條件下彼此雜交，那么其核苷酸序列基本上是相同的。一般來說，所選擇的嚴(yán)格的條件是溫度大約為5°C，低于所限定的離子強(qiáng)度和PH值處的特異性序列的熱熔點(diǎn)(Tm)。但是，嚴(yán)格的條件包括溫度范圍為約1°C至約20°C之間，其具體取決于所需的嚴(yán)格性程度，如本文中另外要求的。如果它們編碼的多肽基本是相同的，那么在嚴(yán)格條件下彼此雜交的核酸也基本相同。例如，當(dāng)使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并來產(chǎn)生核酸副本時(shí)，這種情況就會(huì)發(fā)生。兩個(gè)核酸序列基本上相同的一種情況是當(dāng)由第一核酸編碼的多肽與由第二核酸編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應(yīng)時(shí)。
[0054]在前述的低聚物的一種實(shí)施方式中，對(duì)于編碼感興趣的哺乳動(dòng)物C6的核酸的相應(yīng)區(qū)域，尤其是SEQ ID N0:1，鄰核苷堿基序列包括不超過大約3個(gè)錯(cuò)配，例如不超過約I個(gè)或約2個(gè)錯(cuò)配。例如，對(duì)于編碼感興趣的哺乳動(dòng)物C6的核酸的相應(yīng)區(qū)域，鄰核苷堿基可以包括不超過一個(gè)錯(cuò)配。可替代地，對(duì)于編碼感興趣的哺乳動(dòng)物C6的核酸的相應(yīng)區(qū)域，鄰核苷堿基不包括任何錯(cuò)配(例如，其與該相應(yīng)區(qū)域完全互補(bǔ))。在另一種實(shí)施方式中，低聚物的核苷堿基序列由鄰核苷堿基序列組成。
[0055]本發(fā)明的實(shí)踐與包括在本文中詳細(xì)說明的那些人序列、大鼠序列和小鼠序列的廣大哺乳動(dòng)物的C6序列是相容的。這種蛋白質(zhì)的核酸序列和蛋白質(zhì)序列可從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心((NCBI)-遺傳序列數(shù)據(jù)銀行(GeneBank))獲得。特別地，可以從美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館(National Libruary of Medicine) (38A, 8N05, RockvillePike, Be thesda, Md.20894.)的GeneBank獲得序列表。還可以通過網(wǎng)絡(luò)來獲得Genebank?？傮w上請(qǐng)參見Benson, D.A.等人(1997)Nucl.Acids.Res.25:1中對(duì)基因銀行的描述。沒有具體引用的蛋白質(zhì)序列和核酸序列可以在Genebank中或在本文中公開的其他來源找到。例如，請(qǐng)參見公開的大鼠C6序列(NM_176074)以及公開的小鼠C6序列(ΝΜ_016704)。
[0056]其他低聚物的實(shí)施方式都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，在一種實(shí)施方式中，低聚物的鄰核苷堿基序列包括至少6個(gè)，例如，約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29個(gè)或約30-32個(gè)核苷堿基殘基的鄰子序列，例如，當(dāng)這些殘基與互補(bǔ)的人C6靶RNA、大鼠C6靶RNA以及小鼠C6靶RNA形成雙鏈體時(shí)，能夠募集RNA酶H?！澳技疪NA酶H”是指酶與由能夠檢測(cè)并定量該酶的活性的一個(gè)試驗(yàn)或多個(gè)試驗(yàn)的組合所確定的復(fù)合物接觸。舉例而言，RNA酶H是分離RNA =DNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞核酸內(nèi)切酶。RNA酶H的激活因此造成了 RNA靶的分離，從而極大地提高了寡核苷酸抑制基因表達(dá)的效率。RNA靶的分離能夠常規(guī)通過凝膠電泳來檢測(cè)。
[0057]因此，在一種實(shí)施方式中，低聚物的鄰核苷堿基序列能夠包括至少7個(gè)，例如至少8個(gè)、至少9個(gè)或至少10個(gè)核苷堿基殘基的鄰子序列，其中，當(dāng)其與補(bǔ)體哺乳動(dòng)物C6靶形成雙鏈體時(shí)，能夠募集RNA酶H。在另一種實(shí)施方式中，鄰子序列的長(zhǎng)度是至少9個(gè)或至少10個(gè)核苷堿基，例如其長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷堿基或至少14個(gè)核苷堿基，例如14個(gè)、15個(gè) 或16個(gè)核苷堿基殘基，當(dāng)其與補(bǔ)體哺乳動(dòng)物C6靶RNA形成雙鏈體時(shí)，能夠募集RNA酶H。
[0058]本發(fā)明所使用的另外的優(yōu)選低聚物具有適合于預(yù)期用途的長(zhǎng)度。因此，在一種實(shí)施方式中，該低聚物的長(zhǎng)度為約8個(gè)核苷堿基至約50個(gè)核苷堿基,約9個(gè)核苷酸至約50個(gè)核苷酸，約10個(gè)核苷酸至約50個(gè)核苷酸,約9個(gè)核苷堿基至約40個(gè)核苷堿基,約10個(gè)核苷堿基至約35個(gè)核苷堿基，約10個(gè)核苷堿基至約22個(gè)核苷堿基，例如，約12個(gè)核苷堿基至約18個(gè)核苷堿基，約14個(gè)、約15個(gè)或約16個(gè)核苷堿基，約10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)或大于14個(gè)核苷堿基。
[0059]應(yīng)該了解的是，核苷是一種堿基-糖的結(jié)合物。該核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。這種雜環(huán)堿基的兩種最常見的類型是嘌呤和嘧啶。核苷是指那些還包括被共價(jià)連接到核苷的糖部分的磷酸基的核苷。對(duì)于那些包括呋喃戍糖基糖(pentofuranosyl sugar)的核苷，磷酸基可以被連接到糖的2’、3’、或5’羥基部分。在形成寡核苷酸的過程中，磷酸基將鄰的核苷共價(jià)地連接到另一個(gè)核苷上，從而形成線性高分子化合物。這些線性高分子化合物的各末端又可以被連接起來，從而形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但是，開放的線性結(jié)構(gòu)通常是優(yōu)選的。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)中，普遍認(rèn)為磷酸基形成寡核苷酸的核苷間骨架。RNA和DNA的正常鍵或骨架是3’到5’磷酸二酯連鍵。
[0060]前述的低聚物優(yōu)選地用在某些應(yīng)用中，經(jīng)常優(yōu)選地使用帶有一種或多種寡核苷酸類似物的低聚物(在本文中有時(shí)被稱為寡核苷酸“擬態(tài)或衍生物”)。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的低聚物單獨(dú)地包括一種或多種非核苷堿基化合物、或者與修飾的骨架或其中的非天然的核苷酸間鍵合結(jié)合。在本說明書中所定義的，具有修飾骨架的寡核苷酸包括那些在骨架中保留磷原子的寡核苷酸以及那些骨架中沒有磷原子的寡核苷酸。根據(jù)本說明書的目的，并且如在本領(lǐng)域中有時(shí)會(huì)被提及的，在其核苷間骨架中沒有磷原子的修飾的寡核苷酸也可被視為寡核苷酸。
[0061]示例性的修飾的寡核苷酸骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3’-亞烷基膦酸酯的甲基和其他烷基膦酸酯、5’ -亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、phosphinate、包括3’ -氨基磷酸酯的磷酸酯和氨基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基膦酸酯(thionoalkyl-phosphonate)、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基膦酸三酯、硒代磷酸酯(selenophosphate)、以及具有正常的3’ _5’鍵、它們的2’ _5’鍵類似物和那些具有相反極性的硼代磷酸酯(boranophosphate),其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵合為3’到3’鍵、5’到5’鍵或2’到2’鍵。優(yōu)選的具有相反極性的寡核苷酸包括在3’-端核苷酸間鍵處的單個(gè)3’到3’鍵，即，可以是脫堿基的單個(gè)相反核苷殘基(核苷堿基丟失或在其恰當(dāng)?shù)奈恢锰幘哂辛u基)。各種鹽、混合的鹽以及游離酸的形式也包括在內(nèi)。例如，請(qǐng)參見美國(guó)專利 N0.3，687，808、N0.4，469，863、N0.4，476，301、N0.5，023，243、N0.5，177，196、N0.5，188，897、N0.5，264，423、N0.5，276，019、N0.5，278，302、N0.5，286，717、N0.5，321，131、N0.5，399，676、N0.5，405，939、N0.5，453，496、N0.5，455，233、N0.5，466，677、N0.5，476，925、N0.5，519，126、N0.5，536，821、N0.5，541，306、N0.5，550，111、N0.5，563，253、N0.5，571，799、N0.5，587，361、N0.5，194，599,N0.5，565，555,N0.5，527，899,N0.5，721，218,N0.5，672，697,N0.7，335，764和N0.5，625，050，它們披露了與這樣的組合物有關(guān)的制備和使用。
[0062]因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的低聚物具有完全硫代磷酸酯化的骨架。
[0063]其中不包括磷原子的另外的修飾寡核苷酸骨架具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷酸間鍵合、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷鍵、或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷酸間鍵合所形成的骨架。這些包括那些具有嗎啉基鍵(部分由核苷的糖部分形成)、硅氧烷骨架、硫化物骨架、亞砜骨架、砜骨架、甲?；土虼柞；羌?、亞甲基甲?；土虼柞；羌?、核糖乙酰基(riboaceyl)骨架、含烯烴骨架、氨基磺酸酯骨架、亞甲基亞氨基骨架和亞甲基酰肼骨架、磺酸酯骨架和磺酰胺骨架、酰胺骨架、以及具有混合的N、O、S和CH2部件的其他骨架。參見，例如美國(guó)專利文獻(xiàn) 5，034，506; 5，166，315; 5，185，444; 5，214，134; 5，216，141; 5，235，033; 5，264，562; 5，264，564; 5，405，938; 5，434，257; 5，466，677 ; 5，470，967; 5，489，677; 5，541，307 ; 5, 561, 225; 5，596，086; 5，602, 240; 5，610, 289; 5，602, 240; 5，608, 046;5，610，289; 5，618，704; 5，623，070; 5，663，312; 5，633，360; 5，677，437; 5，792，608; 5，646，269，7，335，764，和5，677，439，它們披露了與這樣的組合物有關(guān)的制備和使用。
[0064]在其他的寡核苷酸類似物中，核苷單元的糖和核苷酸間鍵合(即骨架)被其他基團(tuán)所取代。通過適當(dāng)?shù)暮怂岚谢衔锉３謮A基單元的雜交。一種這樣的低聚物化合物被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架被包含酰胺(尤其是氨基乙基甘氨酸)的骨架所替代。核苷堿基被保留并直接地或間接地連接到該骨架的酰胺部分的氮雜原子上。參見，例如美國(guó)專利第5，539，082號(hào)、第5，714，331號(hào)、第5，719，262號(hào)(Nielsen等人，Science, 1991，254，1497-1500)。
[0065]本發(fā)明的其他實(shí)施方式是低聚物具有硫代磷酸酯骨架的低聚物以及具有雜原子骨架的寡核苷酸，并且特別是:一ch2—nh—o—ch2—、一CH2--N(CH3)-O--CH2--[被稱為亞甲基(甲亞氛基)或MMI 骨架]、一CH2—O—N(CH3) —CH2—、一CH2—N(CH3) 一N(CH3) —CH2—和—0—N (CH3) -CH2-CH2-[其中，天然的磷酸二脂骨架表示為--O--P-O--CH2--]參考了美國(guó)專利第5，489，677號(hào)，以及酰胺骨架參考了美國(guó)專利第5，602，240號(hào)。此外，例如，以上具有嗎啉基骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸參考了美國(guó)專利第5，034，506號(hào)。
[0066]根據(jù)本發(fā)明的修飾的低聚物還可以含有一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。示例性的寡核苷酸在2’位置處包括以下中的一個(gè):0H;F;0-、S-、或N-烷基；0-、S-、或N-烯基；0-、S_或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基以及炔基可以是取代或未取代的C1至Cltl烷基或 C2 至 Cltl 烯基和炔基。特別優(yōu)選的是:0[ (CH2)n0]mCH3、0 (CH2)n0CH3、0 (CH2)nNH2、0 (CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3) ]2，其中n和m為I到約10。其他優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置處包含以下中的一個(gè)4至(:1(|低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或 O-芳烷基、SH、SCH3> OCN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2,N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑(intercalator)、改善了寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)、或改善了寡核苷酸的藥效特性的基團(tuán)，以及其他具有類似性質(zhì)的取代基。優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧基乙氧基(2’ -O—CH2CH2OCH3J也被稱為2’ -O—(2-甲氧基乙基或2’ -MOE) (Martin等人，Helv.Chim.Acta, 1995，78，486-504)也就是烷氧基烷氧基基團(tuán)。另外一種優(yōu)選的修飾包括2’ - 二甲氨基氧基乙氧基(即，O (CH2) 20N (CH3) 2基團(tuán)，其也被稱為2’ -DMAOE,如下文的實(shí)施例所述)、以及2’ -二甲氨基乙氧基乙氧基(在本領(lǐng)域中也被稱為2’ -O- 二甲氨基乙氧基乙基或2’ -DMAEOE), BP, 2' -O-CH2-O-CH2-N(CH2)2)，在下文的實(shí)施例中也對(duì)其進(jìn)行了描述。
[0067]一種優(yōu)選的修飾包括鎖核酸(LNA)，其中2’-羥基基團(tuán)被連接到糖環(huán)的3’或4’碳原子上，從而形成了雙環(huán)糖部分。例如，該鍵是橋接2’氧原子和4’碳原子的亞甲基(—CH2_)n基團(tuán)(其中，η是I或2)。在W098/39352和W099/14226中描述了 LNA及其制備。
[0068]此外，合適的LNA單體(有時(shí)候被稱為“鎖核酸單體”、“鎖核酸殘基”、“LNA單體”或“LNA殘基”)可參考如以下文獻(xiàn)中公開的雙環(huán)核苷酸類似物，例如，W000/56746,W000/56748, W001/25248, W002/28875, W003/006475,美國(guó)專利公開 N0.2007/0191294,W003/095467,美國(guó)專利公開第 6，670, 461 號(hào)、第 6，794，499 號(hào)、第 7，034, 133 號(hào)、第7，053，207 號(hào)(L-Ribo-LNA)、第 7，060，809 號(hào)以及第 7，084，125 號(hào)(Xylo-LNA)。還可以根據(jù)其化學(xué)式來定義LNA單體。因此，本文中所使用的“LNA單體”的一個(gè)實(shí)例具有如下的結(jié)構(gòu):
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種單鏈反義低聚物，其長(zhǎng)度為約10至50個(gè)核苷酸，并且具有與編碼由SEQ IDNO:1表示的補(bǔ)體成分6 (C6)序列的核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域具有至少80%的序列同一性的鄰核苷堿基序列；其中，所述低聚物靶向于從SEQ ID ΝΟ:1的(從“A”處開始)ATG起始位點(diǎn)處開始的大約112-152、433-473、546-586、706-746、或1015-1055個(gè)核苷酸，并且能夠降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)的C6mRNA表達(dá)水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物靶向于從SEQIDNO:l的ATG起始位點(diǎn)處開始的大約132、453、566、726或1035個(gè)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低聚物，其中，所述低聚物與編碼由SEQIDNO:l表示的補(bǔ)體成分C6序列的核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域具有至少90%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物還包括經(jīng)修飾的核苷酸間鍵合和經(jīng)修飾的核苷堿基中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚物，其中，所述核苷酸類似物是經(jīng)修飾的糖部分，其選自由2’ -O-甲氧乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、和雙環(huán)糖部分組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的低聚物，其中，所述雙環(huán)糖部分是鎖核酸(LNA)單體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的低聚物，其中，所述低聚物是在所述低聚物的3’末端和5’末端處各包含2個(gè)或3個(gè)LNA單體的gapmer。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的低聚物，其中，所述低聚物在5’和3’側(cè)翼片段之間以及可選地在所述低聚物的5’和3’末端中的一個(gè)或兩個(gè)處還包含2’ -脫氧核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚物，其中，所述經(jīng)修飾的核苷酸間鍵合是硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚物，其中，所述經(jīng)修飾的核苷堿基是5-甲基胞嘧啶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物的長(zhǎng)度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的低聚物，其中，所述低聚物的長(zhǎng)度為約15至約18個(gè)核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚物，其中，所述低聚物與編碼由SEQIDNO:l表示的補(bǔ)體成分C6序列的核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域具有至少90%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的低聚物，其中，所述低聚物包含與由SEQIDNO:l表示的補(bǔ)體成分C6序列有關(guān)的I個(gè)、2個(gè)或3個(gè)錯(cuò)配。
15.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的低聚物和藥用稀釋劑、載體、鹽或佐劑。
16.權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的低聚物在制備用于減少或抑制細(xì)胞或組織中的補(bǔ)體成分6表達(dá)的藥物中用途。
17.權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的低聚物在制備用于減少或抑制細(xì)胞或組織中的膜攻擊復(fù)合物的產(chǎn)生的藥物中用途。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK103740713SQ201310576286
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2008年7月10日
【發(fā)明者】弗蘭克·巴斯, 基斯·福魯特 申請(qǐng)人:阿姆斯特丹大學(xué)附屬醫(yī)院