一種雙鏈聚肌胞干粉的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種雙鏈聚肌胞干粉的制備方法，所述方法包括：（1）將聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用磷酸鹽緩沖液溶解，混合后加入穩(wěn)定劑，混合均勻，在40~100℃下保溫；（2）步驟（1）反應(yīng)液自然冷卻后與有機(jī)溶劑混合，靜置沉淀，沉淀物干燥，即得所述雙鏈聚肌胞干粉；本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一種雙鏈聚肌胞干粉的制備方法，制成的聚肌胞干粉具有完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)特征和生理活性，質(zhì)量和穩(wěn)定性要比溶液狀態(tài)下的聚肌胞要好很多，進(jìn)入生物體內(nèi)較裸露的聚肌胞有更強(qiáng)的抗酶解性能，從而增強(qiáng)了療效。而且在雙鏈聚肌胞溶液制成干粉的過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行了純化，去除了很多小分子物質(zhì)和雜質(zhì)，降低了毒副作用，提高了雙鏈聚肌胞的質(zhì)量。
【專利說(shuō)明】一種雙鏈聚肌胞干粉的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種雙鏈聚肌胞干粉的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雙鏈聚肌胞是一種人工合成的雙鏈核糖核酸，可誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，具有廣譜抗病毒作用；此外還有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)人體非特異性免疫功能和某些特異性免疫功能，達(dá)到抗肝細(xì)胞壞死和抗腫瘤作用等。
[0003]雙鏈聚肌胞在化妝品中應(yīng)用可以消除痘痘、扁平疣等皮膚贅生物。
[0004]雙鏈聚肌胞在獸藥方面主要應(yīng)用于預(yù)防和治療家禽、家畜病毒性疾病，使用方便、廣泛，可以與許多藥物同時(shí)使用，具有協(xié)同或相加作用。本品無(wú)種屬特異性，可廣泛在家禽、豬、牛等動(dòng)物上使用，同時(shí)它還具有抗病毒譜廣，毒性小、安全范圍大的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]雙鏈聚肌胞是一種動(dòng)物免疫增強(qiáng)劑，可作為疾病治療輔助用藥，增強(qiáng)動(dòng)物肌體免疫力、提高藥物的療效。同時(shí)，雙鏈聚肌胞也是一種免疫佐劑，在用疫苗免疫的同時(shí)使用，可明顯提高免疫效果，并且有預(yù)防免疫應(yīng)激及其它病毒性疾病的發(fā)生。
[0006]一方面，目前粉末狀聚肌胞是制劑形式(是預(yù)混劑，不是原料形式)，一般多采用聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液經(jīng)聚合后，直接添加輔料制得，該干粉中聚肌胞的含量偏低。
[0007]另一方面，現(xiàn)已報(bào)道的文獻(xiàn)中，聚肌胞制劑的制備一般是以聚肌苷酸、聚胞苷酸為原料經(jīng)過(guò)一步反應(yīng)后得到中間體聚肌胞溶液，再進(jìn)行制劑工序的操作。其不足之處在于，首先制劑生產(chǎn)線中增加聚合反應(yīng)步驟，不僅增加操作的復(fù)雜性，還增加了監(jiān)控的難度。其次，聚肌胞中間體是以溶液形式存在，貯藏條件及期限更加嚴(yán)格。
[0008]因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種含量高、穩(wěn)定性高且制備簡(jiǎn)單的雙鏈聚肌胞干粉的制備方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明目的是提供一種含量高、穩(wěn)定性高且制備簡(jiǎn)單的雙鏈聚肌胞干粉的制備方法。
[0010]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種雙鏈聚肌胞干粉的制備方法，所述方法包括:
(1)將聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用適量pH6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液溶解，混合后加入穩(wěn)定劑，混合均勻，在40-100?下保溫0.5飛小時(shí)；所述穩(wěn)定劑為下列之一或其中兩種以上的混合物:卡那霉素、殼寡糖、氯化鈣、多聚賴氨酸(包括各種規(guī)格的ε -多聚賴氨酸、L-多聚賴氨酸等)、葡萄糖酸鈣；所述聚肌苷酸、聚胞苷酸質(zhì)量用量之比為1: 0.5~1.5，穩(wěn)定劑質(zhì)量為聚肌苷酸和聚胞苷酸質(zhì)量之和的0.2^2.0倍；所述磷酸鹽緩沖液用量以將聚肌苷酸和聚胞苷酸充分溶解為宜，推薦用量為將聚肌苷酸和聚胞苷酸配制成1(T100 g/L的溶液；
(2)步驟(1)反應(yīng)液自然冷卻后與0.5^20倍體積的有機(jī)溶劑混合，靜置沉淀0.5^72小時(shí)，取沉淀物2(T60°C低溫干燥，即得所述雙鏈聚肌胞干粉；所述有機(jī)溶劑為下列之一或其中兩種以上的混合物：乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、異丙醇、正丙醇。
[0011]本發(fā)明中的雙鏈聚肌胞干粉為原料形式，采用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將多聚肌苷酸、 多聚胞苷酸，并加入穩(wěn)定劑聚合后，再用有機(jī)溶劑沉淀得到高質(zhì)量的雙鏈聚肌胞干粉。該干 粉中雙鏈聚肌胞含量高，可直接用于各種劑型制劑的制備，可以使制劑的制備過(guò)程更加簡(jiǎn) 單，易于操作，目前市場(chǎng)需求量很大。另外，加入穩(wěn)定劑不僅可以增大分子量，還可以使雙鏈 聚肌胞的穩(wěn)定性（由于PIC為大分子聚陰離子，加入穩(wěn)定劑后可以使PIC雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 增加)增強(qiáng)，優(yōu)于溶液形式，易于保存。另外經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑沉淀處理后樣品的增色效應(yīng)(通過(guò) 堿處理使雙鏈聚肌胞的雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基充分外露，導(dǎo)致紫外吸收增加的現(xiàn)象稱為 增色效應(yīng)，該指標(biāo)直接影響產(chǎn)品的功效）指標(biāo)更優(yōu)。
[0012]優(yōu)選的，步驟（1)所述穩(wěn)定劑為殼聚糖，多聚賴氨酸(包括各種規(guī)格的e -多聚賴 氨酸、L-多聚賴氨酸等）或卡那霉素。
[0013]優(yōu)選的，步驟（2 )所述有機(jī)溶劑為乙醇或甲醇。
[0014]優(yōu)選的，步驟（1)中,所述聚肌苷酸、聚胞苷酸質(zhì)量用量之比為1 : 0.8?1.2,穩(wěn) 定劑質(zhì)量為聚肌苷酸和聚胞苷酸質(zhì)量之和的0. 2^1. 5倍。
[0015]所述雙鏈聚肌胞干粉可進(jìn)一步制成雙鏈聚肌胞水溶液，因此所述方法在步驟（2) 之后還可包括步驟（A):配制pH6. (T8. 0的磷酸鹽緩沖液，加入適量的雙鏈聚肌胞干粉和 NaCl，定容至雙鏈聚肌胞干粉終濃度為0. Ori. 0 g/L，NaCl終濃度為4. 5g^9. Og/L,即得所 述雙鏈聚肌胞水溶液。按此方法制得的雙鏈聚肌胞水溶液，療效高，安全可靠，無(wú)毒、無(wú)害、 無(wú)殘留，工藝簡(jiǎn)單，實(shí)用性強(qiáng)，可用于預(yù)防和治療人和動(dòng)物病毒性疾病，也可用作免疫佐劑。
[0016]或者所述雙鏈聚肌胞干粉進(jìn)一步制成雙鏈聚肌胞預(yù)混劑，因此所述方法在步驟 (2)之后還可包括步驟（B):按照預(yù)混劑中雙鏈聚肌胞干粉的質(zhì)量百分含量為0. 5?40%、 Na2HP04 ? 12H20質(zhì)量百分含量為0. 05?10%、NaH2P04 ? 2H20質(zhì)量百分含量為0. 05?10%、余量 為輔料的配比，定量稱取雙鏈聚肌胞干粉，以及Na2HP04 ? 12H20和NaH2P04 ? 2H20,并添加適 量輔料，充分粉碎，過(guò)60目篩后，混合均勻，再過(guò)100目篩，分裝后密封保存，即得所述雙鏈 聚肌胞預(yù)混劑；所述輔料為下列之一或其中兩種以上的混合物：葡萄糖、乳糖、藥用淀粉、 可溶性糊精、復(fù)合核苷酸、氯化鈉。
[0017]具體的，所述輔料可為復(fù)合核苷酸、氯化鈉，以及葡萄糖或藥用淀粉的混合物，添 加比例以占預(yù)混劑的質(zhì)量百分比計(jì)，復(fù)合核苷酸為0. 5^10 %，氯化鈉為f 10%，余量為葡萄 糖或藥用淀粉。即預(yù)混劑質(zhì)量百分比組成如下：雙鏈聚肌胞干粉0. 59T40%、Na2HP04 ? 12H20 0. 05%?10%、NaH2P04 *2H20 0. 05%?10%，復(fù)合核苷酸(TlO %，氯化鈉0?10%，余量為葡萄糖或 藥用淀粉。
[0018]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一種雙鏈聚肌胞干粉的制備方法， 制成的聚肌胞干粉具有完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)特征和生理活性，并且該雙鏈聚肌胞干粉的質(zhì)量 和穩(wěn)定性要比溶液狀態(tài)下的聚肌胞要好很多，進(jìn)入生物體內(nèi)較裸露的聚肌胞有更強(qiáng)的抗酶 性能，從而增強(qiáng)了療效。而且在雙鏈聚肌胞溶液制成干粉的過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行了純化，去除了 很多小分子物質(zhì)和雜質(zhì)，降低了毒副作用，提高了雙鏈聚肌胞的質(zhì)量。
[0019](一）【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
圖1為產(chǎn)物紫外鑒定結(jié)果。
[0020](二）【具體實(shí)施方式】下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此: 下述實(shí)施例涉及的含量測(cè)定方法為:
精密稱取雙鏈聚肌胞復(fù)合物適量，配制成每Iml含IOmg的水溶液，照磷測(cè)定法測(cè)定聚肌胞含磷量。每Img的磷相當(dāng)于10.25mg的聚肌胞。按(C19H23N7O14P2)n干燥品計(jì)算其含量。
[0021]下述實(shí)施例涉及的增色效應(yīng)測(cè)定方法為:
取雙鏈聚肌胞復(fù)合物適量，用氯化鈉一磷酸鹽緩沖液(PH7.2)制成每Iml中約含
0.08mg的溶液，照分光光度法，在248nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A1 ;然后精確量取該溶液IOml置一試管中，加6mol/L氫氧化鈉溶液20μ1，搖勻，立即在同一波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A2，按下式計(jì)算即得:
【權(quán)利要求】
1.一種雙鏈聚肌胞干粉的制備方法，所述方法包括: (1)將聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用適量ρΗ6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液溶解，混合后加入穩(wěn)定劑，混合均勻，在40-100?下保溫0.5-5小時(shí)；所述穩(wěn)定劑為下列之一或其中兩種以上的混合物:卡那霉素、殼寡糖、氯化鈣、多聚賴氨酸、葡萄糖酸鈣；所述聚肌苷酸、聚胞苷酸質(zhì)量用量之比為1: 0.5~1.5，穩(wěn)定劑質(zhì)量為聚肌苷酸和聚胞苷酸質(zhì)量之和的0.2~2.0倍; (2)步驟(1)反應(yīng)液自然冷卻后與0.5^20倍體積的有機(jī)溶劑混合，靜置沉淀0.5^72小時(shí)，取沉淀物2(T60°C干燥，即得所述雙鏈聚肌胞干粉；所述有機(jī)溶劑為下列之一或其中兩種以上的混合物:乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、異丙醇、正丙醇。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述穩(wěn)定劑為殼聚糖、多聚賴氨酸或卡那霉素。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述有機(jī)溶劑為乙醇或甲醇。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述聚肌苷酸、聚胞苷酸質(zhì)量用量之比為1: 0.8~1.2，穩(wěn)定劑質(zhì)量為聚肌苷酸和聚胞苷酸質(zhì)量之和的0.2^1.5倍。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述雙鏈聚肌胞干粉進(jìn)一步制成雙鏈聚肌胞水溶液，所述方法還包括步驟(A):配制ρΗ6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，加入適量的雙鏈聚肌胞干粉和NaCl，定容至雙鏈聚肌胞干粉終濃度為0.01-1.0 g/L，NaCl終濃度為4.5^9.0g/L，即得所述雙鏈聚肌胞水溶液。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述雙鏈聚肌胞干粉進(jìn)一步制成雙鏈聚肌胞預(yù)混劑，所述方法還包括步驟(B):按照預(yù)混劑中雙鏈聚肌胞干粉的質(zhì)量百分含量為0.5~40%、Na2HPO4.Iffi2O質(zhì)量百分含量為0.05~10%、NaH2PO4.2H20質(zhì)量百分含量為0.05~10%、余量為輔料的配比，定量稱取雙鏈聚肌胞干粉，以及Na2HPO4* 12H20和NaH2PO4.2Η20，并添加適量輔料，充分粉碎，過(guò)60目篩后，混合均勻，再過(guò)100目篩，分裝后密封保存，即得所述雙鏈聚肌胞預(yù)混劑；所述輔料為下列之一或其中兩種以上的混合物:葡萄糖、乳糖、藥用淀粉、可溶性糊精、復(fù)合核苷酸、氯化鈉。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述輔料為復(fù)合核苷酸、氯化鈉，以及葡萄糖或藥用淀粉，添加比例以占預(yù)混劑的質(zhì)量百分比計(jì)，復(fù)合核苷酸為0-ιο %，氯化鈉為0-ιο%，余量為葡萄糖或藥用淀粉。
【文檔編號(hào)】A61K47/12GK103599071SQ201310552020
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】傅得響, 盧凰姍, 王宏, 費(fèi)麗燕, 郭蘇 申請(qǐng)人:杭州美亞藥業(yè)有限公司