一種抗人a組輪狀病毒的雞卵黃抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種抗人A組輪狀病毒雞卵黃抗體及其制備方法和應(yīng)用，該方法包括：體外表達(dá)純化人A組輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP7或VP8，并免疫產(chǎn)蛋雞，收集雞蛋，分離純化出VP7或VP8卵黃抗體。制備得到的雞卵黃抗體可凍干制備成用作預(yù)防和治療輪狀病毒感染的抗體干粉。本發(fā)明的有益效果：采用基因工程技術(shù)體外大量表達(dá)重組VP7和VP8抗原，效益高，成本低，場(chǎng)地需求小、環(huán)保；避免了傳統(tǒng)卵黃抗體制備過(guò)程中使用輪狀病毒滅活或減毒疫苗所帶來(lái)的潛在散毒風(fēng)險(xiǎn)，符合動(dòng)物福利要求；采用本發(fā)明制備的卵黃抗體，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)后，制備成抗體干粉口服生物制劑，對(duì)治療輪狀病毒感染性腹瀉具顯著效果，預(yù)防率可達(dá)95%以上，見(jiàn)效快、成本低。
【專利說(shuō)明】一種抗人A組輪狀病毒的雞卵黃抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及卵黃抗體，尤其是一種高效價(jià)抗A組輪狀病毒的雞卵黃抗體及其制備方法和在預(yù)防和治療輪狀病毒感染中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人A組輪狀病毒(Rotavirus, RV)是引起嬰幼兒感染性腹瀉疾病的主要原因，其發(fā)病率高、危害嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了嬰幼兒的發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)要求和生存質(zhì)量[Parashar UD等，2003 ;陽(yáng)艷麗等，2011]。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，輪狀病毒所致的胃腸炎都是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，該病毒所致的腹瀉普遍流行，好發(fā)于秋冬季節(jié)，幾乎所有5歲以下的兒童均發(fā)生過(guò)RV感染。據(jù)估計(jì)，每年因輪狀病毒感染導(dǎo)致的門診病例有2500多萬(wàn)人，住院病例200多萬(wàn)人[Tate JE等，2012]，就2004年輪狀病毒致死人數(shù)據(jù)估計(jì)達(dá)到52.7萬(wàn)(47.5萬(wàn)-58.0萬(wàn))，并且主要發(fā)生在低收入國(guó)家。
[0003]目前，仍然缺少抗輪狀病毒的特效藥物。臨床上一方面糾正水電解質(zhì)平衡，另一方面以微生態(tài)制劑為主要組分的媽咪愛(ài)和以蒙脫石為主要組分的思密達(dá)進(jìn)行治療，但均不能對(duì)輪狀病毒引起的嬰幼兒腹瀉進(jìn)行有效預(yù)防和治療，甚至濫用抗生素加劇腸道菌群的紊舌L進(jìn)一步引起藥物較難控制的腸炎。目前使用的主要是輪狀病毒活疫苗，由于該疫苗有增加腸套疊風(fēng)險(xiǎn)和免疫保護(hù)局限等問(wèn)題，致使該疫苗對(duì)輪狀病毒引起腹瀉的預(yù)防在發(fā)展中國(guó)家推廣受阻【Patel NC等，2010 ;Patel MM等，2011 ;Vesikari T等，2012】。因此研發(fā)一種高效安全，易于服用的抗體疫苗，是本病防治急需解決的問(wèn)題。
[0004]卵黃抗體(immunoglobulin yolk, IgY),即產(chǎn)蛋雞經(jīng)特定抗原免疫后,產(chǎn)生相應(yīng)特異性抗體，并轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存于卵黃中，形成卵黃抗體。卵黃抗體相當(dāng)于人的IgG，抗體親和力比較高。特異性IgY通過(guò)與病原的結(jié)合，抑制病原菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和粘附作用。卵黃技術(shù)近年獲得快速發(fā)展，在醫(yī)療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[Dias da Silva W等，2010]。IgY已經(jīng)顯示出較好的抗細(xì)菌、真菌和病毒效果?？诜蘒gY已被證明能有效替代抗生素治療因耶爾森菌、腸毒性大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、幽螺桿菌、輪狀病毒等感染引起的胃腸道疾病。在我國(guó)，IgY在獸藥領(lǐng)域獲得生產(chǎn)批文的已達(dá)到10個(gè)，同時(shí)已有很多添加IgY的功能性保健食品和衛(wèi)生消毒產(chǎn)品等上市銷售，IgY技術(shù)在醫(yī)療診斷及治療通過(guò)臨床驗(yàn)證已顯示出良好效果。
[0005]對(duì)于輪狀病毒的卵黃抗體及相關(guān)產(chǎn)品，中國(guó)專利申請(qǐng)CN1201693A和CN1435260A均公開(kāi)了采用野生型輪狀病毒株，對(duì)其進(jìn)行病毒細(xì)胞培養(yǎng)、病毒純化和滅活，而制備成滅活病毒苗，通過(guò)免疫產(chǎn)蛋雞獲得相應(yīng)的卵黃抗體。然而，滅活疫苗具有生產(chǎn)要求高、存在滅活不徹底和散毒的危險(xiǎn)，同時(shí)，由于病毒殘存等因素，這些都會(huì)對(duì)后期卵黃抗體的純化帶來(lái)困難。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]針對(duì)以上不足和缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種抗A組輪狀病毒雞卵黃抗體制備方法。
[0007]本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)代分子免疫學(xué)理論，分析并選擇輪狀病毒的主要抗原表位決定簇肽段VP7和VP8作為免疫原，采用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)在體外大量表達(dá)輪狀病毒VP7和VP8抗原，將純化的抗原與適宜的佐劑制備成疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，采用常規(guī)水稀釋-硫酸銨沉淀-超濾法提取高效價(jià)的輪狀病毒VP7和VP8的卵黃抗體。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供抗人A組輪狀病毒的雞卵黃抗體在預(yù)防和治療輪狀病毒感染中的應(yīng)用。[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種抗人A組輪狀病毒雞卵黃抗體的制備方法，包括:體外表達(dá)純化人A組輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP7或VP8，并免疫產(chǎn)蛋雞，收集雞蛋，分離純化出VP7或VP8卵黃抗體。
[0010]優(yōu)選一種抗人A組輪狀病毒雞卵黃抗體的制備方法，包括:PCR擴(kuò)增人A組輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP7或VP8 DNA序列，將得到的VP7或VP8 DNA序列克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21，誘導(dǎo)表達(dá)和純化VP7或VP8重組蛋白，將VP7或VP8重組蛋白按照體積比1:1與弗氏佐劑混合乳化，肌肉或皮下注射免疫產(chǎn)蛋雞，每隔一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次，共2次，第3次免疫后一周開(kāi)始收集雞蛋，從蛋黃中分離純化出抗輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP7或VP8的特異性卵黃抗體。
[0011]更優(yōu)選的一種抗A組輪狀病毒雞卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟:
(1)PCR擴(kuò)增:設(shè)計(jì)引物，以包含G4P8血清型全長(zhǎng)VP7或VP8的質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增VP7或VP8 DNA序列；包含G4P8血清型全長(zhǎng)VP7或VP8模板DNA序列可以從G4P8血清型人A組輪狀病毒T114株(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所購(gòu)得)中提?。?br>
(2)蛋白表達(dá)純化:將PCR擴(kuò)增得到的VP7或VP8DNA序列克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中，通過(guò)0.1-0.7 mM IPTG誘導(dǎo)VP7或VP8重組抗原蛋白的大量表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)溫度為25-37°C，時(shí)間8-12h，離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，按照體積比0.01M PBS:菌體=10:1，用0.01M PBS懸浮菌體，采用3_6次反復(fù)凍融和溶菌酶(終濃度l-10mg/ml)裂解菌體，離心收集沉淀，用含有質(zhì)量百分比0.8-1.2 %的Triton和1.5-2.5 M尿素的0.01M PBS洗滌去除細(xì)胞碎片，獲得粗制的包涵體，再用0.01MPBS洗滌包涵體2-4次，最后按照含有6-8 M尿素的0.01 M PBS緩沖液:包涵體=50:1的體積比溶解包涵體，采用梯度透析的方法復(fù)性包涵體得到VP7或VP8重組抗原蛋白；
(3)免疫:將2-10mg/mlVP7或VP8重組抗原蛋白按照體積比1:1與完全弗氏佐劑乳化，2-3點(diǎn)肌肉或皮下注射免疫產(chǎn)蛋雞，初免劑量為250-500 μ g/只，每隔一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次(加強(qiáng)免疫采用不完全弗氏佐劑)，共2次，免疫劑量為100-200 μ g/只，第3次免疫一周以后開(kāi)始收集雞蛋，加強(qiáng)免疫后，當(dāng)抗體滴度低于1:1O4時(shí)，再給予強(qiáng)化免疫，免疫劑量為100-200 μ g/ 只即可；
(4)分離純化卵黃抗體:用水稀釋-硫酸銨沉淀-超濾法從蛋黃中分離純化輪狀病毒特異性的VP7卵黃抗體或VP8卵黃抗體。
[0012]其中，0.01MPBS由以下組分組成:氯化鈉(NaCl)，8g ;磷酸氫二鈉(Na2HP04)，1.16g ;磷酸二氫鉀(KH2P04)，0.24g,加 800ml ddH20,并用 IM 的 HCI 或 NaOH 調(diào) pH 至 7.4，
定容1L，高壓蒸汽滅菌，室溫保存。
[0013]其中，VP7結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列如下:SEQ ID N0.1:
【權(quán)利要求】
1.一種抗人A組輪狀病毒的雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于，體外表達(dá)純化人A組輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP7或VP8，并免疫產(chǎn)蛋雞，收集雞蛋，分離純化出VP7或VP8卵黃抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增人A組輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP7或VP8 DNA序列，將其克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21，誘導(dǎo)表達(dá)和純化VP7或VP8重組蛋白，將VP7或VP8重組蛋白溶液按照體積比1:1與弗氏佐劑混合乳化，肌肉或皮下注射免疫產(chǎn)蛋雞，每隔一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次，共2次，第3次免疫后一周開(kāi)始收集雞蛋，從蛋黃中分離純化出抗輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP7或VP8的特異性卵黃抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)PCR擴(kuò)增:設(shè)計(jì)引物，以包含G4P8血清型全長(zhǎng)VP7或VP8的質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增VP7或VP8 DNA序列； (2)蛋白表達(dá)純化:將PCR擴(kuò)增得到的VP7或VP8DNA序列克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中，通過(guò)0.1-0.7mM IPTG誘導(dǎo)VP7或VP8重組抗原蛋白的大量表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)溫度為25-37°C，時(shí)間8-12 h，離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，按照體積比0.01M PBS:菌體=10:1，用0.01M PBS懸浮菌體，采用3_6次反復(fù)凍融和溶菌酶裂解的方法裂解菌體，溶菌酶的終濃度為l-10mg/ml ;離心收集沉淀，用含質(zhì)量百分比0.8-1.2%的Triton和1.5-2.5M尿素的0.01M PBS洗滌去除細(xì)胞碎片，獲得粗制的包涵體，再用0.01 MPBS洗滌包涵體2-4次，最后按照體積比含有6-8 M尿素的0.01 M PBS緩沖液:包涵體=50:1加入0.01 M PBS緩沖液溶解包涵體，將溶解的包涵體加入到透析袋內(nèi)，采用梯度透析的方法復(fù)性包涵體得到VP7或VP8重組抗原蛋白； (3)免疫:取2-10mg/ml VP7或VP8重組抗原蛋白按照與完全弗氏佐劑1:1體積比混勻乳化，2-3點(diǎn)肌肉或皮下注射免疫產(chǎn)蛋雞，初免劑量為250-500 μ g/只，每隔一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次，共2次，免疫劑量為100 -200 μ g/只，加強(qiáng)免疫采用不完全弗氏佐劑，第3次免疫一周以后開(kāi)始收集雞蛋，抗體滴度低于1:1O4時(shí)，再給予強(qiáng)化免疫，免疫劑量為100-200 μ g/只即可； (4)分離純化卵黃抗體:用水稀釋-硫酸銨沉淀-超濾法從蛋黃中分離純化輪狀病毒特異性VP7或VP8卵黃抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)的VP7上游引物為 5’ -CCGGAATTCTTGCCAATTACTGGATCTAT-3’，VP7 下游引物為 5’-CCGCTCGAGCATTCGTTCTGTTTGTGGA-3’，所述步驟(1)的 VP8 上游引物為 5’-CCGGMTTCATGGCTTCACTCATTTAT-3 ’ 和下游引物為 5 ’ - CCGCTCGAGAACTTGTGCCCTCTTATA-3，，所述PCR的退火溫度為53-57°C ;所述步驟(2)的梯度透析的方法復(fù)性包涵體包括:按照體積比為透析緩沖液:袋內(nèi)透析液=10:1，將透析袋置于包含5-6 M尿素的透析緩沖液中，進(jìn)行梯度透析復(fù)性，透析4-5 h ;棄1/4-1/6體積原透析緩沖液，補(bǔ)充新的所棄體積的透析緩沖液，透析4-5 h，共透析6-9次；最后用0.01M PBS透析3_4 h，重復(fù)1_3次；收集透析液，4°C下12000rpm離心15分鐘,上清即為復(fù)性的VP7或VP8重組抗原,所述透析緩沖液組分為:50 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCl，5%體積比甘油，1%重量比Gly，其余為超純水，pH8.1，最后利用Bradford法對(duì)純化的VP7或VP8蛋白進(jìn)行定量分析，調(diào)整蛋白濃度至3mg/ml ο
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)得到的VP7或VP8重組抗原蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳確認(rèn)有一條分子量大小為33KD或35KD的電泳帶，其中VP7復(fù)性蛋白分子量大小為33KD或VP8復(fù)性蛋白分子量大小為35KD，灰度掃描純度在90%以上則滿足進(jìn)入下一步驟要求。
6.如權(quán)利要求3-5中任一權(quán)利要求所述的制備方法，其特征在于，用ELISA法檢測(cè)步驟(3)中收集的雞蛋的蛋黃中的抗體滴度，滴度達(dá)到1:20000以上即滿足進(jìn)入下一步驟的要求，利用水稀釋-硫酸銨沉淀-超濾法從蛋黃中分離純化輪狀病毒特異性的卵黃抗體包括:按照蒸餾水:卵黃=8:1稀釋卵黃，用稀HCl調(diào)節(jié)pH至5.2，4°C靜置6-8 h，離心去脂，收集上清液，再用質(zhì)量百分比40%和25% (NH4)2SO4分步沉淀卵黃抗體，終濃度分別為10%和30%質(zhì)量百分比，收集沉淀用0.01M PBS溶解后超濾即得卵黃抗體VP7或VP8卵黃抗體，超濾的截留分子量為100kD。
7.—種卵黃抗體,其特征在于,所述卵黃抗體通過(guò)權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求的方法制備得到卵黃抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的一種卵黃抗體，其特征在于，所述卵黃抗體的純度為90%以上，抗體滴度為2 X IO4。
9.如權(quán)利要求7-8中任一權(quán)利要求所述的卵黃抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述卵黃抗體凍干制備成用作預(yù)防和治療輪狀病毒感染的抗體干粉。
10.如權(quán)利要求9所述的卵黃抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述抗體干粉為口服生物制劑原料。`
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103554254SQ201310542421
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】李再新, 張智, 胡衛(wèi)東, 李丙超, 李天有, 鄒曉陽(yáng), 唐文才 申請(qǐng)人:四川理工學(xué)院