一種展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種展毛翠雀提取物的新用途，該新用途是展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用。所述展毛翠雀提取物是按如下方法制備的：以展毛翠雀為原料，先提取揮發(fā)油，再用不同濃度乙醇提取，最后用低濃度鹽酸水溶液提取制備得到。本發(fā)明所提供的展毛翠雀提取物對制備抗癌藥物具有重要意義。
【專利說明】一種展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及一種中藥材提取物在制備抗癌藥物中的應用，具體是涉及一種展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]據(jù)2010年2月衛(wèi)生部統(tǒng)計資料，每年全球癌癥死亡人數(shù)達1000萬。目前全球四分之一人口死亡的原因是癌癥所致，并預測按目前的趨勢發(fā)展下去，到2050年將有二分之一的死亡者是由于患了癌癥。我國惡性癌發(fā)病率以每年2.5-5%速度增長，已成為嚴重危害人類生命的兀兇。在各種類型的癌癥當中以肺癌、胃癌、肝癌等發(fā)病率較聞。
[0003]血管為正常組織器官的形成發(fā)生于功能維護所必需，它與人體發(fā)育失調和多種病因導致的種種疾病密切相關。腫瘤新血管形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移和復發(fā)起舉足輕重作用。一系列研究表明只要有效抑制腫瘤新血管形成，就能抑制腫瘤生成、轉移和復發(fā)。此外，糖尿病和風濕性關節(jié)炎等疾病都有血管增生，其血管異常與腫瘤血管非常相似。因此，血管增生抑制劑也可用于治療糖尿病和風濕性關節(jié)炎等血管增生性疾病。近年來，人們對腫瘤血管生成機制的研究不斷深入，許多抗腫瘤血管生成的藥物如Avastin、Angiostatin等相繼被開發(fā)出來，已在臨床上推廣應用。這類藥物不但可以用于大多數(shù)實體瘤的治療，還可以用于腫瘤的預防和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，同時對其他與血管生成有關的疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變、風濕性關節(jié)炎、銀屑病、血管瘤、動脈粥樣硬化等的預防與治療，都具有一定的理論和現(xiàn)實意義。
[0004]腫瘤中的腫瘤細胞可分為兩類。一類為普通的腫瘤細胞,一類為腫瘤干細胞。普通的腫瘤細胞具有快速分裂，對抗腫瘤藥敏感，沒有自身更新能力等特點。因此普通的腫瘤細胞在分裂一定代數(shù)后會死亡。腫瘤干細胞則具有如下特點:通常情況下處于靜止狀態(tài)，及不分裂狀態(tài)，對抗腫瘤藥不敏感，具有自身更新能力，即具有無限繁殖的能力。在腫瘤化療中，大量的腫瘤細胞被殺死(因為對化療藥敏感)，然而腫瘤干細胞會生存下來(因為對化療藥不敏感)。腫瘤的復發(fā)是由于腫瘤化療藥對腫瘤干細胞無效。找能有效治療腫瘤干細胞的藥物是當前的一個方向。能否根除腫瘤的關鍵不在于能否殺滅普通的腫瘤細胞，而在于根除腫瘤干細胞。
[0005]中醫(yī)藥治療癌癥的歷史源遠流長，迄今已有紫杉、喜樹、砒霜、綠茶、靈芝、人參、長春花、天門冬、半枝蓮、天葵子等用于臨床治療癌癥，取得了一些較好的效果。長期以來，人們應用傳統(tǒng)思維、理念和方法研發(fā)抗癌中草藥，雖然已取得了進步，但收效甚微。迄今中草藥尚未在國內外成為首選抗癌藥物，現(xiàn)有臨床中草藥的抗癌療效丞需進一步提高。因此，研發(fā)中草藥抗癌藥物是目前治療惡性癌的當務之急，而闡明內源性低分子抑瘤物的化學本質是這一領域研究的核心問題。
[0006]展毛翠雀為為毛茛科植物展毛翠雀Delphinium kamaonense Huth var.glabrescens (W.T.Wang) W.T.Wang及同屬數(shù)種植物的干燥地上部分。6~8月采集,晾干。收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準藏藥(第一冊)》，標準編號:WS3-BC-0088-95。性涼，味苦。具有清熱，止瀉痢，愈瘡之功效。用于腸熱腹瀉，痢疾；外敷瘡口。為我國藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關展毛翠雀的基礎研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應用受到限制?，F(xiàn)代研究表明，展毛翠雀含有生物堿類成分；展毛翠雀藥理作用研究未見報道。
[0007]國內專利檢索結果，未見展毛翠雀相關專利。
[0008]上述文獻及專利等，尚未見展毛翠雀或展毛翠雀提取物抗癌作用研究的報道。
【發(fā)明內容】
[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用。
[0010]本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明所用展毛翠雀為毛茛科植物展毛翠雀Delphinium kamaonense Huth var.glabrescens (ff.T.Wang) ff.T.Wang及同屬數(shù)種植物的干燥地上部分。
[0011]本發(fā)明一種展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用，所述展毛翠雀提取物是按如下方法制備得到:
(1)展毛翠雀，粉碎，過10-50目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度400C -50°C、萃取壓力20-30MPa、萃取時間l_2h，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取 物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用；
(2)將步驟(1)得到的藥渣A用濃度30%-75%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度50°C-95°C，提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-4小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6-15倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥渣B，用濃度1%_5%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度60°C-80°C,提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-3小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10-15倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C，其中一種或兩種或三種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0012]展毛翠雀提取物是按如下方法制備得到:
(1)展毛翠雀，粉碎，過10-50目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度400C -50°C、萃取壓力20-30MPa、萃取時間l_2h，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用；
(2)將步驟(1)得到的藥渣A用濃度30%-75%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度50°C-95°C，提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-4小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6-15倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥渣B，用濃度1%_5%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度60°C-80°C,提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-3小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10-15倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0013]優(yōu)選的展毛翠雀提取物是按如下方法制備得到:
(I)展毛翠雀，粉碎，過30目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度45°C、萃取壓力25MPa、萃取時間1.5h，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用；
(2)將步驟(1)得到的藥渣A用濃度60%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2.5小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的12倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥渣B，用濃度3%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的12倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。 [0014]本發(fā)明所述的展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用，尤其是在制備抗肝癌藥物、抗肺癌藥物、抗結腸癌藥物中的應用。
[0015]本發(fā)明的展毛翠雀展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C在制備抗癌藥物中的應用。
[0016]本發(fā)明的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C在制備抗肝癌藥物、抗肺癌藥物、抗結腸癌藥物中的應用。
[0017]本發(fā)明的展毛翠雀提取物與化學藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
[0018]本發(fā)明的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C與化學藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
[0019]本發(fā)明的展毛翠雀提取物，通過加入藥劑學允許的各種輔料，制成藥劑學上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
[0020]本發(fā)明的展毛翠雀各提取物對多種腫瘤細胞的抑制作用。實驗結果表明，展毛翠雀各提取物對人肝癌細胞BEL-7402、人肝癌細胞H印G-2、結腸癌細胞HCT-8和肺癌細胞A-549均有一定程度的抑制作用。展毛翠雀提取物對人肝癌細胞BEL-7402、人肝癌細胞H印G-2、結腸癌細胞HCT-8和肺癌細胞A-549的抑制率分別為72.61%,43.86%,61.24%、
68.88%o
【具體實施方式】
[0021]下面通過具體實驗例和實施例對一種展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用做進一步說明，但不限于本發(fā)明。
[0022]實施例1:展毛翠雀提取物的制備
(1)展毛翠雀15kg，粉碎，過30目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度45°C、萃取壓力25MPa、萃取時間1.5h，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用；
(2)將步驟(1)得到的藥渣A用濃度60%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2.5小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的12倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥渣B，用濃度3%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的12倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0023]實施例2:展毛翠雀提取物的制備
(1)展毛翠雀20kg，粉碎，過10目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度50°C、萃取壓力20MPa、萃取時間2h，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用；
(2)將步驟(1)得到的藥渣A用濃度30%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度95°C，提取次數(shù)為I次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的15倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3 )將步驟(2 )得到的藥渣B，用濃度5%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度60 V，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為I小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0024]實施例3:展毛翠雀提取物的制備
(1)展毛翠雀18kg，粉碎，過50目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度40°C、萃取壓力30MPa、萃取時間lh，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用；
(2)將步驟(1)得到的藥渣A用濃度75%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度50°C，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為I小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥渣B，用濃度1%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度80°C，提取次數(shù)為I次，每次提取時間為3小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的15倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0025]實施例4:展毛翠雀提取物片的制備
取實施例1展毛翠雀提取物345g，加入淀粉105g，混勻，制粒，干燥，過篩，加微晶纖維素35g，硬脂酸鎂5g，混勻，壓制成1000片，即得展毛翠雀提取物片。
[0026]實施例5:展毛翠雀提取物顆粒的制備
取實施例2展毛翠雀提取物345g，加入糊精95g，蔗糖65g，混勻，制粒，干燥，整粒，即得展毛翠雀提取物顆粒。
[0027]實施例6:展毛翠雀提取物膠囊的制備 取實施例3展毛翠雀提取物345g，加淀粉85g，混勻，制粒，干燥，整粒，裝膠囊1000粒，即得展毛翠雀提取物膠囊。
[0028]實驗例1:展毛翠雀各提取物在抑制腫瘤細胞生長中的應用
將對數(shù)生長的腫瘤細胞(人肝癌細胞H印G-2、人肝癌細胞BEL-7402、人結腸癌細胞HCT-8、人肺癌細胞A-549)用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含10%(體積百分含量)胎血清的DMEM完全培養(yǎng)基懸浮細胞，制成細胞懸液，并分別將各腫瘤細胞稀釋至1.0 X IO5個/ml,再將其接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔200uL，各腫瘤細胞分別接種6個孔，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h ;然后傾去各孔培養(yǎng)液。
[0029]將按實施例1方法制得的展毛翠雀提取物、展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C(批號分別為20110506、20110507、20110508、20110509)分別溶解于DMSO中，然后用DMEM完全培養(yǎng)基進行稀釋，得到展毛翠雀各提取物的溶液，展毛翠雀各提取物的終濃度為50ug/mL，其中，DMSO的濃度為10%(體積百分含量)。
[0030]實驗組:將展毛翠雀各提取物溶液依次分別加入上述腫瘤細胞IfepG-2，BEL-7402, HCT-8, A-549的培養(yǎng)孔內，各自接種3個孔，每孔加入200ul ;對照組:向上述各腫瘤細胞的培養(yǎng)孔內加入含10%(體積百分含量)DMS0的DMEM完全培養(yǎng)基，各自接種3個孔，每孔加入200ul ;將以上各組的培養(yǎng)板同時置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2天。2天后向每孔加入20ul新鮮配制的5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液，并在37°C、5%C02的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h ;小心棄上清，每孔加入200ul DMSO,室溫放置15-20min，每5min振蕩一次；在酶標儀上測定各孔在波長490nm處的光密度值(0D值)，按公式計算腫瘤細胞生長抑制率。
[0031 ] 抑制率(%) = (0D對照一OD實驗)/OD對照X100%。
[0032]實驗設三次重復，結果取平均數(shù)。展毛翠雀各提取物對人不同腫瘤細胞H印G-2、BEL-7402、HCT-8、A-549的抑制作用的結果如表1所示。
[0033]表1展毛翠雀各提取物對人不同腫瘤細胞的抑制作用。
【權利要求】
1.一種展毛翠雀提取物在制備抗癌藥物中的應用，所述展毛翠雀提取物是按如下方法制備得到: (1)展毛翠雀，粉碎，過10-50目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度400C -50°C、萃取壓力20-30MPa、萃取時間l_2h，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用； (2)將步驟(1)得到的藥渣A用濃度30%-75%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度50°C-95°C，提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-4小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6-15倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥渣B，用濃度1%_5%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度60°C-80°C,提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-3小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10-15倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ； (4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C，其中一種或兩種或三種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
2.根據(jù)權利要求1所述展毛翠雀提取物是按如下方法制備得到: (I)展毛翠雀，粉碎，過10-50目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度400C -50°C、萃取壓力20-30MPa、萃取時間l_2h，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用； (2 )將步 驟(1)得到的藥渣A用濃度30%-75%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度50°C -95°C，提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-4小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6-15倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥渣B，用濃度1%-5%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度60°C-80°C,提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-3小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10-15倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ； (4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
3.根據(jù)權利要求1所述展毛翠雀提取物是按如下方法制備得到: (1)展毛翠雀，粉碎，過30目篩，采用超臨界二氧化碳萃取技術，萃取溫度45°C、萃取壓力25MPa、萃取時間1.5h，萃取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，即得展毛翠雀提取物A，超臨界二氧化碳萃取后的藥渣A備用； (2)將步驟(1)得到的藥渣A用濃度60%乙醇溶液作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2.5小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的12倍；濾過，得提取液B和藥渣B ;提取液B，回收乙醇，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥渣B，用濃度3%鹽酸溶液作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的12倍；濾過，合并提取液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物C ； (4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
4.根據(jù)權利要求1所述的展毛翠雀提取物與化學藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種展毛翠雀提取物在制備抗肝癌藥物、抗肺癌藥物、抗結腸癌藥物中的應用； 根據(jù)權利要求1所述的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C在制備抗癌藥物中的應用。
6.根據(jù)權利要求1所述的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C在制備抗肝癌藥物、抗肺癌藥物、抗結腸癌藥物中的應用。
7.根據(jù)權利要求1所述的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C與化學藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
8.根據(jù)權利要求1、權利要求2、權利要求3所述的展毛翠雀提取物，通過加入藥劑學允許的各種輔料，制 成藥劑學上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
【文檔編號】A61K9/48GK103585292SQ201310525404
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請人:濟南星懿醫(yī)藥技術有限公司