一種展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種展毛翠雀提取物的新用途，該新用途是展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。所述展毛翠雀提取物是按如下方法制備的：將展毛翠雀提取后，通過兩次大孔吸附樹脂純化得到。本發(fā)明所提供的展毛翠雀提取物對制備治療艾滋病藥物具有重要意義。
【專利說明】一種展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種中藥材提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，具體是涉及一種展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病是1981年發(fā)現(xiàn)的新病毒性傳染病，中醫(yī)過去對其未有記載。中醫(yī)對艾滋病辨證，認為艾滋病屬于疫病范疇。病因為疫毒熱邪侵襲，正氣虛弱而致。病機主要為衛(wèi)外不固，陽氣損傷，臟腑受累，引起肺虛脾虛腎虛，繼發(fā)感染。熱傷脈絡(luò)，氣血凝滯，形成癥積腫塊腫瘤。
[0003]中醫(yī)辨“證”:主要辨別邪正消長和虛證實證。艾滋病病毒為邪毒，邪毒入里而傳變，與機體正氣的邪正抗?fàn)幍膭討B(tài)變化，為疾病的發(fā)展過程。感染早期以邪實為主，中期“因?qū)嵵绿摗保砥凇耙蛱撝聦崱?。艾滋病病情?fù)制多變，艾滋病及其繼發(fā)感染都可形成“病”，且有不同“型”和“期”。中醫(yī)對艾滋病有辨證辨病，分型分期等不同診治方案。
[0004]艾滋病的中醫(yī)藥治療目前仍屬于研究階段，目前國內(nèi)外尚未有公認療效肯定被批準(zhǔn)生產(chǎn)的抗艾滋病病毒中藥或中藥單體化合物?？拱滩〔《局参锼幒椭兴幯芯恐饕?種途徑，煙具獲得的抗 艾滋病病毒中藥植物藥及其成分，有些已在臨床試用。
[0005]自艾滋病病毒發(fā)現(xiàn)以來，國際上用艾滋病病毒細胞培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄酶,蛋白酶和整合酶等體外實驗方法，廣泛篩選化合物的同時，也大量篩選植物和中草藥提取物及其成分，也研究了一些中藥復(fù)方制劑，發(fā)現(xiàn)在體外抑制艾滋病毒的有效藥物，有的可抑制猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猴的病毒血癥。有些已在臨床試用，尚未明確效果。
[0006]我國自1987年派中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療隊去非洲治療艾滋病病人。國內(nèi)在2002年以前，缺乏特效抗艾滋病病毒藥物，中西醫(yī)在臨床根據(jù)中醫(yī)理論，對艾滋病病人辨病與辨證相結(jié)合，以清熱解毒，扶正固本，或涼血補腎，活血化瘀等治則，按中藥性能，選擇中藥，處方治療。通過臨床實踐，認為有些中藥復(fù)方治療艾滋病可改善癥狀，緩解病情。近年來對實驗診斷確診的艾滋病病人，采用中藥治療，設(shè)對照組，在治療期間，定期檢測血液病毒載量(HIV-RNA)和CD4細胞水平，評價效果。有報道可改善癥狀，提高免疫力，大多仍在臨床驗證中。進入臨床的抗HIV單味中藥或植物藥及中藥復(fù)方如下:
甘草甜素:甘草甜素(glycyrrhizin,GL)是中藥甘草(Glycyrrhiza glabra L)提取的甘草皂苷，有廣譜抗病毒作用，體外抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，在細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV細胞融合，也抗流感病毒和SARS病毒，體內(nèi)實驗證明可保護流感病毒感染小鼠引起的肺炎死亡和肺病變；保護小鼠的CCl4中毒性肝損傷；誘生Y-干擾素；有類激素作用。日本常用其靜脈點滴治療慢性乙型肝炎，也曾試用治療艾滋病病人，可抑制血清HIV-1-P24抗原，升高CD4細胞。呂維柏教授1988-1992年在非洲坦桑尼亞應(yīng)用甘草甜素口服制劑克艾可治療艾滋病病人可改善癥狀，CD4細胞略有上升。其效果尚未被驗證。
[0007]天花粉蛋白:天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS, GLQ223, Q物質(zhì))為中藥括樓(Trichosanthes kiri1wii)屬葫蘆科(Cucurbitaceae),我國民間用于流產(chǎn)的中藥復(fù)方的主要中藥成分為栝樓，我國科學(xué)家分離鑒定器抗早孕和引產(chǎn)的有效成分為天花粉蛋白，分子量為27kD，其一、二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)已完全弄清，為抑制蛋白合成的植物毒蛋白，是單鏈的核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein, RIP)。美國在篩選抗HIV-1藥物時，發(fā)現(xiàn)其在淋巴細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1細胞融合，其后發(fā)現(xiàn)在單核巨噬細胞培養(yǎng)內(nèi)HIV-1的P24抗原和RNA，在3只猴艾滋病病毒(SIV)感染猴靜脈注射可抑制血漿HIV-1。美國在林場使用靜脈點滴治療艾滋病病人，可抑制外周血HIV-1感染的T淋巴細胞和單核巨噬細胞內(nèi)HIV-1-P24抗原，使⑶4/⑶8比例略有升高。由于可引起過敏性反應(yīng)死亡，神經(jīng)毒性的精神失常和腎毒性反應(yīng)，臨床實驗已中止。近年來從天花粉中分離出其他蛋白TAP29，分子量在29 kD，也有抑制HIV-1的作用，但毒性較小，未在臨床試用。此外苦瓜(MOmordicacharantia)的苦瓜蛋白和商陸(Phytolacca americana)的商陸蛋白(Pokeweed protein)等都有抑制HIV的作用。
[0008]金絲桃素:植物貫葉金絲桃(St.John Wort, Hypericum perforatum)民間傳統(tǒng)用其提取物治療抑郁癥， 從花提出的活性成分是金絲桃素(hypericin)，是芳香族多環(huán)二聚蒽醌類化合物，為抗抑郁癥藥物，已全合成。金絲桃素具有多種抗病毒活性，在細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV，其作用機制為阻斷病毒的脫衣，裝配和釋放，有殺病毒作用，可通過血腦屏障。在細胞培養(yǎng)內(nèi)可抑制鼠白血病病毒繁殖。在體內(nèi)可抑制鼠白血病病毒感染小鼠引起的脾腫大，也可抑制鴨乙型肝炎病毒感染鴨血請病毒DNA，并有廣譜抗細菌活性。曾在臨床I/II期試用治療艾滋病患者，因有光敏感作用已停止試驗。
[0009]右旋胡同素A:右旋胡同素A (+Calanolide A)是1992年報道從馬來西亞熱帶雨林植物Calophyllum Ianigerum中分離的天然化合物，鼠香豆素類化合物，抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，但對HIV-2無效。屬于非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，在細胞培養(yǎng)內(nèi)多對多住臨床分離的AZT敏感和耐藥HIV-1有效，并與AZT，NVP有協(xié)同作用。在HIV空纖維管小鼠體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ?HIV hollow fiber mouse model)中證明有抗艾滋病病毒作用，與AZT聯(lián)合應(yīng)用可增強藥效。已全合成，進行了 1-1I其臨床試驗證明有抑制HIV-1感染的治療效果，毒性小，副作用輕，有頭痛和食欲不振等，與AZT聯(lián)合用藥有效。是目前唯一進入II期臨床實驗的單一植物成分，正在觀察驗證療效中，尚未批準(zhǔn)生產(chǎn)。
[0010]小柴胡湯:小柴胡湯(柴胡，人參，半夏，黃芩，甘草，生姜，大棗)
是張仲景傷寒論方。日本用其治療乙型肝炎，發(fā)現(xiàn)其在細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV。美國在臨床用于治療數(shù)例艾滋病病人，可降低血清P24抗原。我們證明其有抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶和在細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1的作用。分別研究其7種成分中藥的效果，發(fā)現(xiàn)僅黃芩水提物及其成分黃芩苷(baicalin)有抑制HIV-1作用，在體外無細胞系統(tǒng)中抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，在人T細胞和外周血單核細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1細胞病變，病毒熒光抗原和P24抗原，體內(nèi)鼠白血病病毒感染小鼠口服可抑制脾腫大和血白細胞升高。日本Ono報道黃芩苷元(baicalien)抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0011]中研I號:中研I號(主藥有紫花地丁，天花粉等組成)商品名為:艾
克沖劑，以清熱解毒為治則，由我國中藥研究院組方1992-1993年在非洲坦桑尼亞對早中期艾滋病臨床應(yīng)用，認為有一定改善癥狀，提高免疫力的效果。實驗室證明該藥體外抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性，體內(nèi)對猴艾滋病毒感染猴實驗治療結(jié)果表明，能降低血漿病毒滴度，并且能提高⑶4細胞數(shù)目及⑶4/⑶8比值和T，B淋巴細胞數(shù)值，誘生干擾素和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)功能。曾在非洲和我國臨床試用，尚未批準(zhǔn)臨床驗證。
[0012]中研2號:中研2號(黃芪，人參，當(dāng)歸，枸杞和甘草等)是我國中醫(yī)
研究院醫(yī)療隊組方。1992年在非洲坦桑尼亞治療艾滋病病人。1998-1999年在非洲?？崎T診對29例艾滋病病人治療，2/16例HIV病毒載量下降，CD4 8/29例CD4升高。2001-2002年在北京佑安醫(yī)院治療15例艾滋病病人，3/15例病毒載量下降，⑶4 1/15例CD4升高。有改善癥狀的效果。實驗證明該藥在人體內(nèi)對猴艾滋病毒感染猴實驗治療表明，用藥4-12周能降低血漿病毒滴度，P27抗原，并且能提高CD4細胞數(shù)目，對感染猴淋巴細胞有激活作用。
[0013]展毛翠雀為為毛茛科植物展毛翠雀Delphinium kamaonense Huth var.glabrescens (ff.T.Wang)ff.T.Wang及同屬數(shù)種植物的干燥地上部分。6~8月采集,晾干。收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥(第一冊)》，標(biāo)準(zhǔn)編號:WS3-BC-0088-95。性涼，味苦。具有清熱，止瀉痢，愈瘡之功效。用于腸熱腹瀉，痢疾；外敷瘡口。為我國藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關(guān)展毛翠雀的基礎(chǔ)研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應(yīng)用受到限制。現(xiàn)代研究表明，展毛翠雀含有生物堿類成分；展毛翠雀藥理作用研究未見報道。
[0014]國內(nèi)專利檢索結(jié)果，未見展毛翠雀相關(guān)專利。
[0015]上述文獻及專利等，尚未見展毛翠雀或展毛翠雀提取物用于制備治療艾滋病藥物的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0016]本發(fā)明的目的在于提供一種展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明所用展毛翠雀為毛茛科植物展毛翠雀Delphinium kamaonense Huth var.glabrescens (ff.T.Wang) ff.Τ.Wang及同屬數(shù)種植物的干燥地上部分。
[0018]本發(fā)明一種展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，所述展毛翠雀提取物的制備方法為:
(1)展毛翠雀，用濃度50%-95%乙醇作為溶劑，在30°C-60°C溫浸提取，提取次數(shù)為2_6次，每次提取時間為2-8小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10-30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.05-1.12，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度60%-95%的乙醇溶液洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ；
(3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為2-5次，每次提取時間為1-6小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6-20倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=1.05-l.12，濾過，得藥液B ;
(4)將步驟(3)得到的藥液B，通過極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度30%-80%的乙醇溶液洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B;
(5)將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B，其中一種或兩種按一定比例混勻，SP得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0019]展毛翠雀提取物的制 備方法為:(1)展毛翠雀，用濃度50%-95%乙醇作為溶劑，在30°C-60°C溫浸提取，提取次數(shù)為2_6次，每次提取時間為2-8小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10-30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.05-1.12，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度60%-95%的乙醇溶液洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ；
(3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為2-5次，每次提取時間為1-6小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6-20倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=1.05-l.12，濾過，得藥液B ;
(4)將步驟(3)得到的藥液B，通過極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度30%-80%的乙醇溶液洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B;
(5)將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0020]優(yōu)選的本發(fā)明展毛翠雀提取物的制備方法為:
(1)展毛翠雀，用濃度70%乙醇作為溶劑，在50°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的20倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.10，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過DlOl大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液依次洗脫，收 集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ；
(3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=l.11，濾過，得藥液B ；
(4)將步驟(3)得到的藥液B，通過DM130大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(5)將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0021]本發(fā)明的展毛翠雀提取的制備方法，其特征在于:所采用的非極性大孔吸附樹脂為AB-8大孔吸附樹脂、DlOl大孔吸附樹脂；所采用的極性大孔吸附樹脂為DM130大孔吸附樹脂、ADS-3大孔吸附樹脂。
[0022]本發(fā)明的展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明的展毛翠雀提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
[0025]本發(fā)明的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
[0026]本發(fā)明的展毛翠雀提取物，通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
[0027]本發(fā)明首次探索研究以豆科植物展毛翠雀Mucuna birdwoodiana Tutcher的干燥種子為原料提取制備治療艾滋病提取物。本實驗研究表明，展毛翠雀各提取物體外對流感病毒、副流感病毒I型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、柯薩奇B族病毒4型(CmB4)、腺病毒3型((Ard3)及鼻病毒的細胞病變較病毒對照組均有所減輕。體內(nèi)對小鼠流感性肺炎有明顯抑制作用，對流感至小鼠死亡有明顯的保護作用，表明展毛翠雀各提取物有較好的抗病毒作用。臨床觀察試驗結(jié)果表明，服用展毛翠雀提取物治療的12例艾滋病患者，明顯改善癥狀、修復(fù)肝腎功能，提高、穩(wěn)定或延CD4下降，抑制病毒復(fù)制等有明顯的療效。
【具體實施方式】
[0028]下面通過具體實驗例和實施例對一種展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用做進一步說明，但不限于本發(fā)明。
[0029]實施例1:展毛翠雀提取物的制備
(1)展毛翠雀20kg，用濃度70%乙醇作為溶劑，在50°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的20倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.10，濾過，得藥液A ; (2)將步驟(1)得到的藥液A，通過DlOl大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ；
(3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=l.11，濾過，得藥液B ；
(4)將步驟(3)得到的藥液B，通過ADS-3大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(5)將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0030]實施例2:展毛翠雀提取物的制備
(1)展毛翠雀25kg，用濃度50%乙醇作為溶劑，在60°C溫浸提取，提取次數(shù)為6次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.12，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過AB-8非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ；
(3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為6小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的20倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=l.05，濾過，得藥液B ；
(4)將步驟(3)得到的藥液B，通過ADS-3極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度30%的乙醇溶液洗脫，收集30%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(5)將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0031]實施例3:展毛翠雀提取物的制備
(1)展毛翠雀，用濃度95%乙醇作為溶劑，在30°C溫浸提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為8小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.05，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度95%的乙醇溶液洗脫，收集95%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ；
(3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為5次，每次提取時間為I小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=l.12，濾過，得藥液B ;
(4)將步驟(3)得到的藥液B，通過ADS-3極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度80%的乙醇溶液洗脫，收集80%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(5)將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
[0032]實施例4:展毛翠雀提取物片的制備
取實施例1展毛翠雀提取物270g，加入淀粉70g，混勻，制粒，干燥，過篩，加微晶纖維素25g，硬脂酸鎂3g，混勻，壓制成1000片，即得展毛翠雀提取物片。
[0033]實施例5:展毛翠雀提取物顆粒的制備
取實施例2展毛翠雀提取物150g，加入糊精95g，混勻，制粒，干燥，整粒，即得展毛翠雀提取物顆粒。
[0034]實施例6:展毛翠雀提取物膠囊的制備
取實施例3展毛翠雀提取物240g，加入淀粉85g，混勻，制粒，干燥，整粒，裝膠囊1000粒，即得展毛翠雀提取物膠囊。
[0035]實驗例1:展毛翠雀各提取物的抗病毒作用
試驗材料:展毛翠雀提取物、展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B(按本發(fā)明實施例1方法制備得到，批號分別為:20110708、20110709、20110710);病毒唑(三氮唑核苷)由湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究所生產(chǎn)，批號:20110503 ;雙黃連膠囊由北京京海藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號:20110701 ;流感病毒甲3型、柯薩奇B族病4型(CmB4)、副流感病毒I型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(Ard3)、鼻病毒14型和流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株FMl，分別購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所及兒科研究所；人喉癌傳代細胞HEP-2株，購自衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所；含10%小牛血清、0.29mg谷氨酞胺/ml，100 μ I青、鏈毒素的Eagle’ MEM ;細胞維持液，除所含小牛血清為2%外，其他含量均同培養(yǎng)液。昆明種小鼠，由山東省實驗動物中心提供。
[0036]實驗方法
1.體外抗病毒作用:對H印-2培養(yǎng)細胞的毒性試驗:將藥液用Eagle’s培養(yǎng)作1:20-1:1280倍比稀釋，加到已長成單層的HEP-2細胞培養(yǎng)板中，100 μ I/孔，每個稀釋度藥液做3個復(fù)孔，同時設(shè)正常細胞對照。將培養(yǎng)板置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，每日倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，確定細胞不出現(xiàn)明顯退變的最低釋稀倍數(shù)，實驗時順延做到最小有效濃度(即最大稀釋倍數(shù))。按Reed-Muench法計算50%毒性濃度(TC5tl)和最大無毒濃度(TCtl),結(jié)果見表1。
[0037]表1 對培養(yǎng)細胞的 TC。TC50 (mg/ml)。
【權(quán)利要求】
1.一種展毛翠雀提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，所述展毛翠雀提取物的制備方法為: (1)展毛翠雀，用濃度50%-95%乙醇作為溶劑，在30°C-60°C溫浸提取，提取次數(shù)為2_6次，每次提取時間為2-8小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10-30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.05-1.12，濾過，得藥液A ; (2)將步驟(1)得到的藥液A，通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度60%-95%的乙醇溶液洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ； (3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為2-5次，每次提取時間為1-6小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6-20倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=1.05-l.12，濾過，得藥液B ; (4)將步驟(3)得到的藥液B，通過極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度30%-80%的乙醇溶液洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B; (5)將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B，其中一種或兩種按一定比例混勻，SP得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述展毛翠雀提取物的制備方法為: (1)展毛翠雀，用濃度50%-95%乙醇作為溶劑，在30°C_60°C溫浸提取，提取次數(shù)為2_6次，每次提取時間為2-8小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10-30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.05-1.12，濾過，得藥液A ; (2)將步驟(1)得到的藥液A，通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度60%-95%的乙醇溶液洗脫，收`集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ； (3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為2-5次，每次提取時間為1-6小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的6-20倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=1.05-l.12，濾過，得藥液B ; (4)將步驟(3)得到的藥液B，通過極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度30%-80%的乙醇溶液洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B; (5)將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述展毛翠雀提取物的制備方法為: (1)展毛翠雀，用濃度70%乙醇作為溶劑，在50°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的20倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.10，濾過，得藥液A ; (2)將步驟(1)得到的藥液A，通過DlOl大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液依次洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物A ； (3)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，回流提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為展毛翠雀重量的10倍，濾過，提取液濃縮至相對密度d=l.11，濾過，得藥液B ； (4)將步驟(3)得到的藥液B，通過DM130大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得展毛翠雀提取物B ； (5 )將上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B混勻，即得本發(fā)明的展毛翠雀提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的展毛翠雀提取物的制備方法，其特征在于:所采用的非極性大孔吸附樹脂為AB-8大孔吸附樹脂、DlOl大孔吸附樹脂；所采用的極性大孔吸附樹脂為DM130大孔吸附樹脂、ADS-3大孔吸附樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的展毛翠雀提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述的展毛翠雀提取物，通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué) 上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
【文檔編號】A61P31/14GK103585291SQ201310525344
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請人:濟南星懿醫(yī)藥技術(shù)有限公司