具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列及氨基酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種編碼海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列及其氨基酸序列，其核苷酸序列全長880bp，編碼海蚯蚓蛋白酶的核苷酸序列長813bp，編碼的海蚯蚓蛋白酶的氨基酸序列全長270個氨基酸殘基，包含15個氨基酸組成的信號肽，屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明的有益效果是：根據(jù)本發(fā)明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以從海蚯蚓的消化道組織中克隆該蛋白酶的編碼基因。該編碼基因通過基因重組技術(shù)，可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，可作為潛在的基因工程抗腫瘤藥物，進(jìn)一步開發(fā)。
【專利說明】具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列及氨基酸序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種海蚯蚓蛋白酶，具體地說是一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的基因核苷酸序列及其氨基酸序列，屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]海蟲丘蝴(Arenicola cristata),屬于海洋環(huán)節(jié)動物門多毛綱小頭蟲目沙纟屬科,形似蚯蚓，生活于潮間帶多沙地帶，營管居生活，故名海蚯蚓。主要分布于我國渤海、黃海沿岸。海蚯蚓始載于《中國藥用動物志》，用于癰瘡腫毒，有清熱解毒之功效。目前國內(nèi)外有關(guān)海蚯蚓的研究報道不多，僅有I篇文獻(xiàn)報道從海蚯蚓體內(nèi)提取到一種具有細(xì)胞毒性的烯醇硫酸留醇，而對具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的基因核苷酸序列及其氨基酸序列沒有任何報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列。
[0004]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
以來自海蚯蚓消化道上皮細(xì)胞的mRNA為模板，采用同源序列克隆法，通過3' RACE、RACE技術(shù)，獲得了一種`編碼具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。將該序列表達(dá)活性肽的部分經(jīng)PCR擴增，克隆到表達(dá)載體pET-2Ia上，在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌E.coliBL21中誘導(dǎo)表達(dá)，生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的重組海蚯蚓蛋白酶。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，可作為新型的基因工程藥物。
[0005]海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆:
(O設(shè)計引物:根據(jù)絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP設(shè)計引物。
[0006](2)目的基因cDNA 3'端序列擴增及測序:由步驟(1)得到引物，和來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，通過3' RACE CcDNASi末端快速擴增技術(shù))擴增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3'端序列。PCR產(chǎn)物膠回收后分別連TA克隆載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌E.coli DH5 α，測序。
[0007](3)目的基因cDNA 5'端序列擴增及測序:根據(jù)獲得的目的基因cDNA 3'端序列設(shè)計兩對特異性引物，以來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，采用5' RACECcDNA 5'末端快速擴增技術(shù))，進(jìn)行套式PCR，擴增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5'端序列。PCR產(chǎn)物膠回收后分別連TA克隆載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌E.coli DH5a，測序。
[0008](4)拼接:應(yīng)用contigexpress軟件對步驟(2)和(3)得到的目的基因cDNA端和5'端序列進(jìn)行拼接，獲得本發(fā)明的海蚯蚓蛋白編碼基因的DNA (mRNA)序列。
[0009](5)根據(jù)上述步驟(4)得到的DNA (mRNA)序列，使用DNAMAN軟件，獲得該海蚯蚓蛋白酶cDNA編碼的氨基酸序列。
[0010]一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列，該序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其特征在于，此序列由880個堿基對組成，此核苷酸序列為:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其表達(dá)的蛋白質(zhì)為海蚯蚓蛋白酶，其特征在于，海蚯蚓蛋白酶由270個氨基酸組成，其氨基酸序列為: IMKFLLIALFV SCASAFRLKA PTPKLffSSED SYIVGGDEAA VGQFPFQAVL LSSTSPGGSL `61TCGGVYIGAN SGGNHWLLNA AHCTQSSARS TffLGLHRRSD TSDGQHFTFV RIVNHPNYGS` `121 GAGAFPNDIS LCEINGAVDT SGSNVGMDL AE⑶NDYAGV SAIISGffGRT CGGCALPDEL `181 RFVETTVLPN SGANSCQTDff GSNVNDGHIC VKS⑶QSSGA CNGDSGGPMS IGNMVIGVTS `241 WGASGCLTSY PSAYSRVSFF RDWIREVSDI。
【文檔編號】A61P35/00GK103555744SQ201310524045
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】趙春玲 申請人:濰坊醫(yī)學(xué)院