一種乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法和應(yīng)用。所說的乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒，是在固體脂質(zhì)納米粒表面修飾有乳鐵蛋白。該乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒可在其內(nèi)包裹藥物，作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體。其制備方法是：先通過DCC脫水反應(yīng)合成mal-sac-PEG-MS，再用mal-sac-PEG-MS制得納米混懸液；然后通過Traut's試劑進(jìn)行乳鐵蛋白巰基化（Lf-SH），在納米粒混懸液中加入Lf-SH，室溫?cái)嚢柽M(jìn)行蛋白修飾。本發(fā)明的乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒具有良好的粒徑和Zeta電位，具有良好的穩(wěn)定性；實(shí)驗(yàn)表明其可將可將模型藥洛派丁胺和香豆素6轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。
【專利說明】一種乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]血腦屏障(blood-brain barrier,BBB),可以防止血液中的有害物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)，同時(shí)又可將腦內(nèi)有害或過剩物質(zhì)排出體外，從而保持腦的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保障了大腦的正常功能，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)起到了很好的保護(hù)作用。但BBB的存在，使98%的小分子化學(xué)藥物和幾乎所有的大分子藥物，包括蛋白質(zhì)與多肽以及基因藥物都無法進(jìn)入腦內(nèi)，或難以在腦內(nèi)達(dá)到有效濃度，使得腦部疾病的治療極為困難。
[0003]在過去的研究中，學(xué)者們已經(jīng)提出了一些方法來改善大腦藥物的攝入:如制備前體藥物，開放血腦屏障的緊密連接，使用載體系統(tǒng)如抗體、脂質(zhì)體、納米粒等，其中，納米藥物載體受到人們的關(guān)注。納米藥物載體是指溶解或分散有藥物的各種納米乳、納米粒、納米脂質(zhì)體和納米藥物微粒等。采用納米技術(shù)制備的納米粒，具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和界面效應(yīng)等特性。大分子藥物與納米藥物載體制備形成的納米粒易于通過BBB,祀向于腦組織。而且將納米粒表面進(jìn)行修飾后可避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，發(fā)揮腦靶向作用。納米粒常用的修飾材料有聚乙二醇(PEG)、泊洛沙姆及其乙二胺衍生物、多糖等親水性聚合物以及受體介導(dǎo)的腦靶向功能分子。腦靶向給藥載體分為聚合物納米粒、脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)載體、吸附介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)載體、基因載體、內(nèi)源性物質(zhì)載體等。
[0004]受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體是將腦靶向功能分子(亦稱配體)通過不同的方法連接到已包裹藥物的納米粒上，如葉酸、低密度 脂蛋白(LDL)、載脂蛋白E、載脂蛋白A-Ι、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等。經(jīng)過這些配體修飾的納米粒進(jìn)入體內(nèi)后，可與血腦屏障上相應(yīng)的受體相結(jié)合而被轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，實(shí)現(xiàn)腦靶向給藥目的。研究表明，這種受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體能夠提高藥物的腦靶向性。
[0005]乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)是一種存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的陽(yáng)離子糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。己有研究證實(shí)Lf可以通過受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。與轉(zhuǎn)鐵蛋白相比，血漿中內(nèi)源性Lf含量較低，它在血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)為單向轉(zhuǎn)運(yùn)，無明顯的跨細(xì)胞降解現(xiàn)象。鑒于以上特點(diǎn)，近幾年來有學(xué)者應(yīng)用Lf作為靶向功能分子修飾納米粒，如用Lf修飾聚合物(PLGA, PLA)納米粒、聚合物泡囊及陽(yáng)離子脂質(zhì)體。
[0006]固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是以固態(tài)的天然或合成的類脂為載體，將藥物包裹于類脂核中，經(jīng)不同方法制成的粒徑在50-1000nm之間的固態(tài)膠粒給藥系統(tǒng)。SLN既有脂質(zhì)體的生理相容性和耐受性好的優(yōu)點(diǎn)，又有聚合物納米粒的緩釋和良好的靶向性。然而SLN的靶向性是一種被動(dòng)靶向。由于SLN是以脂質(zhì)為基質(zhì)的，而絕大多數(shù)脂質(zhì)類化合物結(jié)構(gòu)缺乏活性基團(tuán)，不像聚合物容易進(jìn)行表面修飾，因此連接蛋白類的靶向功能分子比較困難，故其主動(dòng)靶向的報(bào)道很少，受體介導(dǎo)的腦靶向目前尚未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種乳鐵蛋白作為靶向功能分子構(gòu)建固體脂質(zhì)納米粒(Lf-SLN)的制備方法，采用該方法制備而得的Lf-SLN具有良好的粒徑和Zeta電位，具有良好的穩(wěn)定性。
[0008]一種乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒，包括固體脂質(zhì)納米粒，固體脂質(zhì)納米粒表面修飾有乳鐵蛋白。
[0009]本發(fā)明的乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米?？勺鳛樗幬镛D(zhuǎn)運(yùn)載體，在固體脂質(zhì)納米粒內(nèi)包裹有藥物。
[0010]本發(fā)明所述的乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒，通過下述方法制得:先通過N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)脫水反應(yīng)合成馬來酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇單硬脂肪酸酯(mal-sac-PEG-MS)。再用馬來酸酐_6_氨基己酸-聚乙二醇單硬脂肪酸酯制得納米混懸液；然后通過Traut’ s試劑進(jìn)行乳鐵蛋白巰基化(Lf-SH),最佳反應(yīng)比例為L(zhǎng)f:Traut’ s=l:40 (摩爾比)，在納米?；鞈乙褐屑尤隠f-SH，室溫?cái)嚢柽M(jìn)行蛋白修飾，最佳反應(yīng)條件500:
I(質(zhì)量比)。
[0011]具體地，一種乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒制備方法，依次包括以下步驟:
[0012]I)馬來酸酐-6-氨基己酸(mal-sac)以二氯甲燒作為溶劑,加入l/3mal_sac摩爾量的聚乙二醇單硬脂肪酸酯(PEG-MS)，冰浴條件下，依次加入4- 二甲氨基吡啶(DMAP)和DCC，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，薄層色譜(TLC)分析確定反應(yīng)終點(diǎn)，乙醚沉淀，甲醇重結(jié)晶，低溫條件下得馬來酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇單硬脂肪酸酯(mal-sac-PEG-MS)。
[0013]合成路線如下所示:
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒，包括固體脂質(zhì)納米粒，其特征在于所述固體脂質(zhì)納米粒表面修飾有乳鐵蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒，其特征在于，在固體脂質(zhì)納米粒內(nèi)包裹有藥物。
3.一種制備權(quán)利要求1所述乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒的方法，是:先通過N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺脫水反應(yīng)合成馬來酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇單硬脂肪酸酯；再用馬來酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇單硬脂肪酸酯制得納米混懸液；然后通過Traut’ s試劑進(jìn)行乳鐵蛋白巰基化，在納米粒混懸液中加入巰基化乳鐵蛋白，室溫?cái)嚢柽M(jìn)行蛋白修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: O馬來酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇單硬脂肪酸酯的合成 馬來酸酐-6-氨基己酸以二氯甲烷作為溶劑，加入1/3馬來酸酐-6-氨基己酸摩爾量的聚乙二醇單硬脂肪酸酯，冰浴條件下，依次加入4-二甲氨基吡啶和N，N’ -二環(huán)己基碳二亞胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，薄層色譜分析確定反應(yīng)終點(diǎn)，乙醚沉淀，甲醇重結(jié)晶，得馬來酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇單硬脂肪酸酯； 2)制備納米混懸液 稱取單硬脂酸甘油酯50mg、馬來酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇單硬脂肪酸酯0.5mg至一試管中，加熱、超聲溶解，作為油相； 稱取泊洛 沙姆188100mg、大豆磷脂300mg，用水IOml溶解,作為水相； 將水相加入到油相，在75°C，18000r/min條件下高速攪拌10分鐘，然后在75°C水浴中超聲，置冰箱低溫固化，得納米混懸液；將此混懸液在超濾管中離心，濃縮至質(zhì)量不再減少； 3)制備巰基化乳鐵蛋白 精密稱取Img乳鐵蛋白，溶解于0.15mol/L的硼酸鈉溶液中，加入濃度lmg/mL的Trauf s試劑，室溫低速攪拌lh，過Zeba脫鹽柱，除去小分子雜質(zhì)，收集蛋白組分，得到巰基化乳鐵蛋白； 4)乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒 取濃縮后的納米混懸液0.5g，用2ml洗脫液A分散后移入小燒杯，加入巰基化乳鐵蛋白溶液，其中納米混懸液:巰基化乳鐵蛋白為Ig:2mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)9h，得到乳鐵蛋白修飾的納米混懸液；將該混懸液過瓊脂糖凝膠柱，以PBS為洗脫液，除去未連接的蛋白，收集具有乳光的組分，以PBS定容至10ml，即得到乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)油相制備過程中加入有效劑量的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述藥物是洛哌丁胺或香豆素6。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中乳鐵蛋白與Traut’s試劑的比例為摩爾比為1:40。
8.權(quán)利要求1所述的乳鐵蛋白修飾固體脂質(zhì)納米粒作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/42GK103585639SQ201310499991
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】葛曉群, 郭榮, 高緯康, 趙宇蕾, 呂丹, 顏玉文, 鞠婧婧 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)