可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品及其制備方法和應(yīng)用。該方法包括（1）配置培養(yǎng)液；（2）將對數(shù)期的干細(xì)胞以1x10^4/ml至1x10^6/ml的密度接種于培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)3-72小時；（3）采用共培養(yǎng)的方法，或者向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子的方法，將間充質(zhì)干細(xì)胞激活使其分泌活性物質(zhì)；（4）去除培養(yǎng)液中的細(xì)胞收獲上清液，即得精華液；還包括（5）降解、制劑：將精華液進(jìn)一步降解，得到適于皮膚吸收的精華液；再將該精華液加入到美容護(hù)膚品配方中制成各種不同劑型的美容護(hù)膚品。該美容護(hù)膚精華液中含細(xì)胞培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分，還含活性因子TIMP-1，1.0～5.0mg/L；MCP-1，100～500μg/L；EGF，5～50μg/L。本發(fā)明的美容護(hù)膚品易于被皮膚吸收，可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生。
【專利說明】可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物美容化妝品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前市場上常見的美容護(hù)膚品有膏、霜、乳、液、凝膠等多種劑型，一般由具有美容功效的成分添加賦形劑(乳化劑、增稠劑等)制成。常用的美容功效成分有:有機(jī)小分子(如甘油、丁二醇、水楊酸)、有機(jī)大分子(如PEG等聚合物、交聯(lián)物)、無機(jī)物(如二氧化鈦)、生物制品(如重組表皮生長因子)等，以及植物提取物(如蘆薈、薰衣草)、動物源成分(如蛇油)、礦物成分(如石蠟、滑石粉等)等。
[0003]干細(xì)胞是一種具有分化潛能的種子細(xì)胞，具有無限的自我更新復(fù)制能力，在一定條件下能分化成特定組織。干細(xì)胞在生長、增殖、分化過程中會向胞外分泌促進(jìn)細(xì)胞生長及調(diào)節(jié)周圍環(huán)境的細(xì)胞因子等活性物質(zhì)。哺乳動物的干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會向胞外分泌大量的皮膚修復(fù)因子和傷口愈合因子等活性物質(zhì)，進(jìn)入培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)液中。以哺乳動物的間充質(zhì)干細(xì)胞為例，其在體外培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)液中釋放的活性物質(zhì)主要有IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白I (MCP-1)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子Ι(--ΜΡ-Ι)等，具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、激活細(xì)胞活動的作用。
[0004]間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能，并有造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)節(jié)等能力；其多向分化潛能表現(xiàn)為，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、皮膚、肌 肉、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織的細(xì)胞，特別是具有分化為成纖維細(xì)胞(皮膚真皮層的主要構(gòu)成細(xì)胞)和表皮細(xì)胞的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)也可從胎盤、臍帶、脂肪等多種組織中分離到。
[0005]經(jīng)鑒定體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向培養(yǎng)液中分泌--ΜΡ-1、MCP-1和EGF三種細(xì)胞因子。
[0006]人組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子I (TIMP-1, Tissue Inhibitor ofMetallo-Proteinase I)是一個分子量為28.5kD的糖蛋白，全長約207個氨基酸，其中1-23為信號肽。--ΜΡ-1是--ΜΡ家族中的一員，是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP，MatrixMetallo-Proteinase)的天然抑制因子，而MMP參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解。--ΜΡ-1還具有促進(jìn)多種類型的細(xì)胞增殖的作用，還可能有抗細(xì)胞凋亡的功能。--ΜΡ-1可為許多類型的細(xì)胞所表達(dá)，并存在于多種組織和體液中。TIMP分子中有大量的二硫鍵，因此可抵抗極端溫度、pH和變性等惡劣環(huán)境。
[0007]單核細(xì)胞趨化蛋白I (MCP-1, Monocyte Chemotactic Protein I)又稱單核細(xì)胞趨化和激活因子(Monoctye Chemotactic and Activating Factor, MCAF),人 MCP-1 前體長99個氨基酸，1-23為信號肽，成熟分子長76個氨基酸，非糖基化分子量8.7kD，糖基化后MCP-1分子量13kD，為堿性蛋白。目前已知MCP-1可由單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞在細(xì)胞因子或某些病毒刺激下分泌。MCP-1對單核細(xì)胞具有趨化活性，激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。MCP-1也是嗜堿性粒細(xì)胞的趨化劑和激活劑。
[0008]人表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)由53個氨基酸組成，分子量
6.2kD，無糖基部位，非常穩(wěn)定，耐熱耐酸，廣泛存在于體液和多種腺體中，主要由頜下腺、十二指腸合成，在人體的絕大多數(shù)體液中均已發(fā)現(xiàn)，在乳汁、尿液、精液中的含量特異性地增高，但在血清中的濃度較低。EGF可刺激多種細(xì)胞的增殖，主要是表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。在角膜損傷、燒燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合上取得了很好的療效，Montalcini和Cohen教授因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)表皮生長因子并分析其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，獲得1986年諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。
[0009]而細(xì)胞培養(yǎng)液由氨基酸、維生素、糖、微量元素、抗氧化劑等成分組成，各成分及其濃度和PH系根據(jù)細(xì)胞生長和增殖的需要按比例添加，具有細(xì)胞生長和增殖所需的全部營養(yǎng)成分，并且處于最優(yōu)濃度。
[0010]將細(xì)胞培養(yǎng)液營養(yǎng)成分與培養(yǎng)于其中的離體活細(xì)胞在特定條件下分泌的活性物質(zhì)結(jié)合起來，可制成易于被皮膚吸收的美容護(hù)膚品的功效成分，具有補(bǔ)充皮膚營養(yǎng)、修復(fù)皮膚損傷、激活皮膚細(xì)胞更新、減輕炎癥反應(yīng)的作用。如何將間充質(zhì)干細(xì)胞充分激活，使其分泌更多有助于皮膚修復(fù)和增強(qiáng)活力的物質(zhì)，制成可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品，是本領(lǐng)域面臨的一大課題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種能使間充質(zhì)干細(xì)胞分泌更多皮膚修復(fù)活性物質(zhì)，可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚`品及其制備方法和應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比更符合皮膚細(xì)胞生活和更新、再生對營養(yǎng)的需求。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0013]一種可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品的制備方法，按以下步驟順序進(jìn)行:
[0014](I)培養(yǎng)液配置:
[0015]配置間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液，其成分中含有氨基酸、維生素、糖、微量元素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和細(xì)胞生長因子；具體如下:
[0016]間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液:DMEM-LG+F12+BSA+bFGF+TGF-β +PDGF
[0017](2)細(xì)胞培養(yǎng):
[0018]將對數(shù)期的間充質(zhì)干細(xì)胞以lxl0~4/ml至lxl0~6/ml的密度接種于上一步配置的培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)3-72小時；所述的間充質(zhì)干細(xì)胞是哺乳動物的間充質(zhì)干細(xì)胞，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0019](3)細(xì)胞激活:
[0020]采用將另一種類型的細(xì)胞與培養(yǎng)液中原來的細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，或者采用向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子的方法將間充質(zhì)干細(xì)胞激活，使其分泌有助于皮膚修復(fù)和增強(qiáng)活力的物質(zhì)；
[0021](4)去除細(xì)胞、收獲上清液:[0022]去除培養(yǎng)液中的所有細(xì)胞，收獲細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液，即得富含細(xì)胞活性因子的皮膚修復(fù)精華液。
[0023]上述可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品的制備方法，還可增加如下步驟:
[0024](5)降解、制劑:
[0025]往上一步制得的皮膚修復(fù)精華液中添加能夠分解蛋白的物質(zhì)(優(yōu)選胰蛋白酶)，將其中的大分子蛋白質(zhì)降解為短肽，然后去除分子量超過3500道爾頓的物質(zhì)，得到富含細(xì)胞活性因子且適于人體皮膚吸收的皮膚修復(fù)精華液；之后，再將該皮膚修復(fù)精華液，加入到各種美容護(hù)膚品的配方中，制成可涂抹于皮膚表面的各種不同劑型的美容護(hù)膚品。(即經(jīng)添加其它組分，工藝變化后可制成水劑、乳劑、膏劑、霜劑、凝膠劑、凍干產(chǎn)品、粉劑等產(chǎn)品，可起到皮膚修復(fù)與再生的同樣功效，同時可提高除菌有效期。)
[0026]上述方法步驟(4)中所述的去除培養(yǎng)液中的細(xì)胞的方法是離心和/或過濾。
[0027]上述方法步驟(3)中所述的具體的細(xì)胞激活方法如下:
[0028]間充質(zhì)干細(xì)胞激活方法I (共培養(yǎng)法):
[0029]A.配置神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液:StemPro神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(StemPro NSCSFM,購自 Lifetechnologies 公司，貨號 A10509-01 )+GlutaMax 補(bǔ)充劑(購自 Lifetechnologies公司，貨號35050-061)
[0030]B.將神經(jīng)干細(xì)胞以lxl0~4/ml至5xl0~5/ml的密度接種于上一步配置的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24-72小時，至對數(shù)期；
[0031]C.收獲神經(jīng)干細(xì)胞(如采用離心法)，以2:1~1:2的數(shù)量比添加到步驟(2)中的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物中，共培養(yǎng)12-24小時。
[0032]間充質(zhì)干細(xì)胞激活方法2 (添加含有神經(jīng)干細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)濃縮液法):
[0033]A.配置神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液:StemPro神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(StemPro NSCSFM,購自 Lifetechnologies 公司，貨號 A10509-01 )+GlutaMax 補(bǔ)充劑(購自 Lifetechnologies公司，貨號35050-061)
[0034]B.將神經(jīng)干細(xì)胞以lxl0~5/ml至5xl0~5/ml的密度接種于上一步配置的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24-48小時；
[0035]C.去除神經(jīng)干細(xì)胞(采用離心或過濾的方法)，將剩余的培養(yǎng)液(其中含有神經(jīng)干細(xì)胞分泌物)濃縮至原先體積的1/5~1/20 (這個濃縮比例是與后面的添加比例掛鉤的；如果濃縮到1/5，下一步的體積添加比例就是2-20% ;如果濃縮到1/20，下一步的體積添加比例就是0.5-5% ;如果濃縮到1/10，下一步的體積添加比例就是1-10%)；
[0036]D.將濃縮液以0.5-20%的體積比添加到步驟(2)中的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)6-24小時。
[0037]上述神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液組分中:
[0038]StemPro神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(StemProNSCSFM)是本領(lǐng)域熟知的培養(yǎng)基試劑盒,可以購自 Lifetechnologies 公司，貨號 A10509-01，試劑盒由 KNOCKOUT DMEM/F12 (貨號 12660-012)、重組人 bFGF (貨號 PHG0024)、重組人 EGF (貨號 PHG0314)、StemPro NeuralSupplement (貨號 A10508-01)組成。
[0039]KN0CK0UTDMEM/F12是Lifetechnologies公司提供的一種不含L-谷氨酰胺或HEPES緩沖液的低滲透壓培養(yǎng)基，貨號12660-012，經(jīng)過優(yōu)化，用于人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的生長。
[0040]bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)是本領(lǐng)域已知的一種細(xì)胞因子，其對成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞具有很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂增殖活性。
[0041]EGF (表皮生長因子)是本領(lǐng)域已知的一種細(xì)胞因子，其可刺激上皮細(xì)胞和多種細(xì)胞增殖。
[0042]StemPro Neural Supplement 是Lifetechnologies 公司提供的一種無血清營養(yǎng)補(bǔ)充劑，貨號A10508-01，可用于人源和鼠源神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞的生長和擴(kuò)增。
[0043]GlutaMax補(bǔ)充劑可以購自Lifetechnologies公司，貨號35050-061,配方是200mML-乙酰-L-谷氨酰胺二肽(溶解于0.85%氯化鈉溶液)。
[0044]一種可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品，它是通過上述方法中的步驟(1)到步驟(4)使用哺乳動物的間充質(zhì)干細(xì)胞制備而成的皮膚修復(fù)精華液；其中含有體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌到胞外的活性物質(zhì)成分，還含有細(xì)胞培養(yǎng)液配置步驟中添加的營養(yǎng)成分(氨基酸、維生素、糖、微量元素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和細(xì)胞生長因子)；經(jīng)進(jìn)一步鑒定，這些成分包括細(xì)胞分泌到胞外的組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子I (TIMP-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白I (MCP-1)和表皮細(xì)胞生 長因子(EGF)，并且其濃度分別為:
[0045]組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子I (--ΜΡ-1)，1.0~5.0mg/L ；
[0046]單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1)，100~500 μ g/L ；
[0047]表皮細(xì)胞生長因子(EGF)，5~50 μ g/L ;
[0048]該美容護(hù)膚品(即皮膚修復(fù)精華液)可用于修復(fù)美化表皮破損的皮膚。
[0049]另一種可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品，它是通過上述方法中的步驟(1)到步驟(5)制備而成，即:它是將上述皮膚修復(fù)精華液進(jìn)一步用胰蛋白酶或其它能夠分解蛋白的物質(zhì)(如:木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)分解，再將其加入到各種美容護(hù)膚品的配方中，制成的可涂抹于皮膚表面的各種不同劑型的美容護(hù)膚品，包括水劑、乳劑、膏劑、霜劑、凝膠劑、凍干產(chǎn)品、粉劑；其中的精華液中含有上述濃度的組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1、單核細(xì)胞趨化蛋白I和表皮細(xì)胞生長因子經(jīng)胰蛋白酶或其它能夠分解蛋白的物質(zhì)分解后產(chǎn)生的短肽；
[0050]該美容護(hù)膚品可用于修復(fù)美化表皮無破損的皮膚。
[0051]本發(fā)明的有益效果:
[0052]本發(fā)明將細(xì)胞培養(yǎng)液營養(yǎng)成分與培養(yǎng)于其中的干細(xì)胞在特定條件下分泌的活性物質(zhì)結(jié)合起來，利用干細(xì)胞生長過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子(--ΜΡ-1、MCP-1和EGF等)，把干細(xì)胞培養(yǎng)液離心去除細(xì)胞后的上清液作為皮膚修復(fù)美容護(hù)膚產(chǎn)品；同時，在干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，采用特殊的細(xì)胞激活方法，使間充質(zhì)干細(xì)胞分泌更多皮膚修復(fù)活性物質(zhì)，從而制得可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品。有科學(xué)研究表明TIMP-1、MCP-1具有促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合作用，可治療皮膚創(chuàng)傷和糖尿病足；bFGF、EGF有皮膚組織修復(fù)和促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖的作用，可用于燒燙傷皮膚治療。從哺乳動物干細(xì)胞培養(yǎng)液中收集獲得具有細(xì)胞生命本性的細(xì)胞因子，則成為最適合人體皮膚細(xì)胞，乃至其它器官生長的營養(yǎng)源。
[0053]本發(fā)明提供了一種從干細(xì)胞培養(yǎng)液中制備獲得安全、有效的皮膚修復(fù)美容護(hù)膚品的方法及其產(chǎn)品，成為人體皮膚修復(fù)的新途徑。本發(fā)明的方法簡單易行，使用設(shè)備簡單，可以利用干細(xì)胞培養(yǎng)液，通過進(jìn)一步改進(jìn)，獲得一種安全低成本的高科技生物美容護(hù)膚產(chǎn)品，其優(yōu)勢顯著。本發(fā)明的美容護(hù)膚品具有促進(jìn)皮膚傷口愈合、修復(fù)皮膚受損表面和促進(jìn)皮膚再生的功效。該美容護(hù)膚品與人體有良好的相容性，易于被人體吸收，對皮膚細(xì)胞生長有良好的促進(jìn)作用，能促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合，加快細(xì)胞新陳代謝，增強(qiáng)皮膚細(xì)胞活力。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明:
[0055]實(shí)施例1:
[0056](一)、本發(fā)明的一種美容護(hù)膚啫喱制備方法:
[0057](I)培養(yǎng)液配置步驟:
[0058]按以下配方配置間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(所用試劑均購自Lifetechnologies
公司):
【權(quán)利要求】
1.一種可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品的制備方法，其特征在于，按以下步驟順序進(jìn)行:(1)培養(yǎng)液配置:配置間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液，其成分中含有氨基酸、維生素、糖、微量元素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和細(xì)胞生長因子；(2)細(xì)胞培養(yǎng): 將對數(shù)期的間充質(zhì)干細(xì)胞以lxl0~4/ml至lxl0~6/ml的密度接種于上一步配置的培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)3-72小時；所述的間充質(zhì)干細(xì)胞是哺乳動物的間充質(zhì)干細(xì)胞，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；(3)細(xì)胞激活:采用細(xì)胞激活方法將間充質(zhì)干細(xì)胞激活，使其分泌有助于皮膚修復(fù)和增強(qiáng)活力的物質(zhì)；所述的細(xì)胞激活方法是:將另一種類型的細(xì)胞與培養(yǎng)液中原來的細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，即共培養(yǎng)法；或者是，采用向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子的方法；(4)去除細(xì)胞、收獲上清液:去除培養(yǎng)液中的所有細(xì)胞，收獲細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液，即得富含細(xì)胞活性因子的皮膚修復(fù)精華液。
2.如權(quán)利要求1所述的美容護(hù)膚品的制備方法，其特征在于，該方法還包括步驟(5)降解、制劑:往上一步制得的皮膚修復(fù)精華液中添加能夠分解蛋白的物質(zhì)，將其中的大分子蛋白質(zhì)降解為短肽，然后去除分子量超過3500道爾頓的物質(zhì)，得到富含細(xì)胞活性因子且適于人體皮膚吸收的皮膚修復(fù)精華液；之后，將該皮膚修復(fù)精華液，加入到各種美容護(hù)膚品的配方中，制成可涂抹于皮膚表面的各種不同劑型的美容護(hù)膚品，包括水劑、乳劑、膏劑、霜劑、凝膠劑、凍干產(chǎn)品、粉劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的美容護(hù)膚品的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液為:DMEM-LG+F12+BSA+bFGF+TGF-0 +PDGF。
4.如權(quán)利要求1或2所述的美容護(hù)膚品的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的去除培養(yǎng)液中的所有細(xì)胞的方法是:離心和/或過濾。
5.如權(quán)利要求2所述的美容護(hù)膚品的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述的能夠分解蛋白的物質(zhì)是胰蛋白酶。
6.如權(quán)利要求1或2所述的美容護(hù)膚品的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的共培養(yǎng)法，是將神經(jīng)干細(xì)胞與培養(yǎng)液中原來的間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，具體按如下步驟進(jìn)行:A.配置神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液=StemPro神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液+GlutaMax補(bǔ)充劑；B.將神經(jīng)干細(xì)胞以lxl0~4/ml至5xl0~5/ml的密度接種于上一步配置的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24-72小時，至對數(shù)期；C.收獲神經(jīng)干細(xì)胞，以2:1~1:2的數(shù)量比添加到步驟(2)中的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物中，共培養(yǎng)12-24小時；步驟(3 )中所述的向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子的方法，是向間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中添加含有神經(jīng)干細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)濃縮液法，具體按如下步驟進(jìn)行:A.配置神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液=StemPro神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液+GlutaMax補(bǔ)充劑；B.將神經(jīng)干細(xì)胞以lxl0~5/ml至5X10~5/ml的密度接種于上一步配置的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24-48小時；C.采用離心或過濾的方法去除神經(jīng)干細(xì)胞，將剩余的其中含有神經(jīng)干細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)液，濃縮至原先體積的1/5~1/20 ；D.將濃縮液以0.5-20%的體積比添加到步驟(2)中的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)6-24小時。
7.一種按權(quán)利要求1所述的方法制備得到的可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品，其特征在于，它是使用哺乳動物的間充質(zhì)干細(xì)胞按所述方法制備而成的皮膚修復(fù)精華液；其中含有體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌到胞外的活性物質(zhì)成分，還含有細(xì)胞培養(yǎng)液配置步驟中添加的營養(yǎng)成分氨基酸、維生素、糖、微量元素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和細(xì)胞生長因子；其中，含有的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌到胞外的組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1、單核細(xì)胞趨化蛋白I和表皮細(xì)胞生長因子的濃度分別為:組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子I, 1.0~5.0mg/L ；單核細(xì)胞趨化蛋白1，100~500 μ g/L ；表皮細(xì)胞生長因子，5~50 μ g/L。
8.按權(quán)利要求7所述的可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品，其特征在于，它是將所述皮膚修復(fù)精華液進(jìn)一步用能夠分解蛋白的物質(zhì)分解，再將其加入到各種美容護(hù)膚品的配方中，制成的可涂抹于皮膚表面的各種不同劑型的美容護(hù)膚品，包括水劑、乳劑、膏劑、霜劑、凝膠劑、凍干產(chǎn)品、粉劑。
9.如權(quán)利要求7所述的可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品在修復(fù)美化表皮破損的皮膚中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求8所述的可促進(jìn)皮膚修復(fù)與再生的美容護(hù)膚品在修復(fù)美化表皮無破損的皮膚中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K8/64GK103550117SQ201310493266
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】金宜強(qiáng), 劉軍, 楊立敏 申請人:上海潤生生物技術(shù)有限公司