鈣激活中性蛋白酶和鈣激活蛋白酶抑制劑的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鈣激活中性蛋白酶和鈣激活蛋白酶抑制劑的用途，將該鈣激活蛋白酶抑制劑PD150606制成用于治療/預(yù)防由多溴聯(lián)苯醚所引起病灶的治療/預(yù)防藥物。PBDEs會引起鈣激活中性蛋白酶calpain2活力的改變以及鈣激活蛋白酶抑制劑PD150606會減輕PBDEs對鈣激活中性蛋白酶calpain2活力的影響，因此可通過檢測動物體內(nèi)鈣激活中性蛋白酶calpain2的活性，實(shí)現(xiàn)對PBDEs所引起病灶的診斷。通過鈣激活蛋白酶抑制劑PD150606制成的藥物可對由多溴聯(lián)苯醚所引起病灶進(jìn)行治療/預(yù)防。
【專利說明】鈣激活中性蛋白酶和鈣激活蛋白酶抑制劑的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多溴聯(lián)苯醚所引起病灶的治療或預(yù)防領(lǐng)域，具體涉及鈣激活中性蛋白 酶和鈣激活蛋白酶抑制劑的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 多溴聯(lián)苯醚（PBDEs)作為溴化阻燃劑，在電子電器產(chǎn)品、建筑裝修材料、塑料和橡 膠制品、紡織品中廣泛使用，其可大大降低了火災(zāi)的發(fā)生率，給火災(zāi)的搶救爭取了時間。然 而，由于PBDEs是以非共價方式添加在各種物品中，在使用和處理含有PBDEs的物品時， PBDEs極易通過揮發(fā)、滲出等方式釋放到外環(huán)境中，并隨大氣長距離遷移，造成大氣、水體、 土壤及生物圈的污染，進(jìn)而使人體內(nèi)PBDEs負(fù)荷加重。PBDEs具有持久性（半衰期為19-119 天）、難降解性、高脂溶性、高毒性，可以通過食物鏈的生物富集和生物放大作用在生物體 內(nèi)蓄積，成為全球性的持久性有機(jī)污染物。在出現(xiàn)更好的替代阻燃劑之前，PBDEs在我國 乃至全世界仍然在大量使用。按照溴原子數(shù)的不同，可以將PBDEs分為BDE-47, BDE-99， BDE-100，BDE-153，BDE-154和BDE-209等十類209種同系物。我國是全球最大的PBDEs生 產(chǎn)、使用和出口基地，是全球產(chǎn)生大量電子垃圾的國家之一，也正成為全球最大的電子電器 垃圾集散地。而原始的廢物處理手段（露天焚燒、烘烤和酸洗等）使PBDEs等持久性有機(jī) 污染物不斷釋放，在環(huán)境和生物體內(nèi)普遍存在且污染呈增長趨勢，對動物和人類健康造成 潛在危害。但是PBDEs作為一種阻燃劑，具有價格低廉、阻燃效果良好等優(yōu)點(diǎn)，在我國甚至 世界上仍然大量生產(chǎn)和使用。因此，研究針對PBDEs健康危害預(yù)防用藥具有重要的科學(xué)和 社會現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 我國兒童有BDE-153高暴露的危險，與其他同系物不同，BDE-153不能被肝微粒 體酶代謝，最不容易被代謝和排泄，在動物腦組織的含量約是其在血液中含量的5倍，t匕 BDE-47在腦組織中的含量高10倍左右。也就是說，BDE-153更容易在脂肪組織蓄積，對腦 組織有特殊的親和力。因此，BDE-153的長期暴露可能對我國嬰幼兒的神經(jīng)發(fā)育造成更深 遠(yuǎn)的影響，是研究PBDEs神經(jīng)毒性的代表物質(zhì)。
[0004] 通過長期研究發(fā)現(xiàn)BDE-153具有神經(jīng)發(fā)育毒性，能夠影響動物的認(rèn)知功能和神經(jīng) 心理功能，并能使神經(jīng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡。Ca2+在發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞和成熟 神經(jīng)細(xì)胞中都能啟動和調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸可塑性等重要 的生理和病理過程。細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡必將導(dǎo)致細(xì)胞的損傷或死亡。鈣激活中性蛋白 酶（calpain)是一種胞內(nèi)Ca2+依賴的、水解半胱氨酸的蛋白酶家族，通過水解特異性蛋白 質(zhì)的半胱氨酸調(diào)節(jié)多種酶和蛋白質(zhì)的功能，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等多種 病理過程。Calpain共有14個家族成員，包括calpainl和calpain2。
[0005] PBDEs對神經(jīng)系統(tǒng)的損害已經(jīng)被證實(shí)，但是目前大多研究還是關(guān)注其神經(jīng)發(fā)育毒 性的發(fā)生機(jī)制，而忽視了對其所引起的病灶進(jìn)行預(yù)防或干預(yù)措施。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種鈣激活中性蛋白酶和鈣激活蛋白酶抑制劑的新用途， 其實(shí)現(xiàn)對PBDEs所引起病灶的診斷、治療和預(yù)防。
[0007] 該用途具體如下：
[0008] 鈣激活蛋白酶抑制劑roi50606的用途：將該鈣激活蛋白酶抑制劑roi50606制成 用于治療/預(yù)防由多溴聯(lián)苯醚所引起病灶的治療/預(yù)防藥物。
[0009] 鈣激活中性蛋白酶calpain2的用途：通過檢測動物體內(nèi)的鈣激活中性蛋白酶 calpain2的活性對動物體內(nèi)PBDEs積存量或PBDEs所引起病灶的診斷。
[0010] 申請人:通過長期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PBDEs會引起鈣激活中性蛋白酶calpain2活力的改變 以及鈣激活蛋白酶抑制劑roi50606會減輕PBDEs對鈣激活中性蛋白酶calpain2活力的影 響，因此可通過檢測動物體內(nèi)I丐激活中性蛋白酶calpain2的活性，實(shí)現(xiàn)對PBDEs所引起病 灶的診斷。通過鈣激活蛋白酶抑制劑HH50606制成的藥物可對由多溴聯(lián)苯醚所引起病灶 進(jìn)行治療/預(yù)防。
[0011] 另外，神經(jīng)系統(tǒng)在生物體的正常機(jī)能發(fā)揮中起舉足輕重的作用，由于其富含脂肪 組織，神經(jīng)系統(tǒng)對各種親脂性的環(huán)境污染物極為敏感。PBDEs是威脅兒童神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育 的主要環(huán)境持久性有機(jī)污染物，具有明顯的親脂性、環(huán)境持久性、生物蓄積性和高毒性的特 點(diǎn)，具有明顯的神經(jīng)發(fā)育毒性。兒童在神經(jīng)發(fā)育的早期通過接觸室內(nèi)灰塵和乳汁攝入大量 的PBDEs，引起神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的廣泛的損傷，給青少年時期、成年期的學(xué)習(xí)、工作和生活帶 來不可改變性逆的、隨年齡增長不斷加重的損傷。而對于神經(jīng)發(fā)育異常造成的神經(jīng)系統(tǒng)損 傷，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)顯得無能為力。因此，本發(fā)明的主要效果是：calpain抑制劑HH50606能夠在 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的早期階段，阻止環(huán)境污染物PBDEs對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的功 能和結(jié)構(gòu)的完整，為預(yù)防PBDEs造成的兒童神經(jīng)發(fā)育異常提供了可靠的干預(yù)措施。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 圖1為實(shí)施例2中神經(jīng)元的純度鑒定結(jié)果圖；
[0013] 圖2-1為實(shí)施例2中空白對照組顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)圖；
[0014] 圖2-2為實(shí)施例2中DMS0溶劑對照組顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)圖；
[0015] 圖2-3為實(shí)施例2中10 μ M BDE-153組顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)圖；
[0016] 圖2-4為實(shí)施例2中20 μ M BDE-153組顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)圖；
[0017] 圖2-5為實(shí)施例2中40 μ M BDE-153組顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)圖；
[0018] 圖2-6為實(shí)施例2中20 μ M BDE-153+5 μ M PD150606組顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的 形態(tài)圖；
[0019] 圖2-7為實(shí)施例2中20 μ M BDE-153+20 μ M PD150606組顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞 的形態(tài)圖；
[0020] 圖3為實(shí)施例2中BDE-153染毒和Η)150606干預(yù)后細(xì)胞活力的變化圖；
[0021] 圖4為實(shí)施例2中BDE-153染毒以及HH50606干預(yù)后細(xì)胞上清液中LDH活力的 變化圖；
[0022] 圖5為實(shí)施例2中BDE-153染毒以及HH50606干預(yù)后細(xì)胞凋亡率的變化圖；
[0023] 圖6為實(shí)施例2中BDE-153染毒以及HH50606干預(yù)后神經(jīng)細(xì)胞calpain激酶活 力的變化圖；
[0024] 圖7為實(shí)施例3中染毒后1個月和2個月時大鼠的跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較圖；
[0025] 圖8為實(shí)施例3中染毒后1個月和2個月時大鼠 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中游泳速度 和游泳時間的比較圖(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)表）；
[0026] 圖9為實(shí)施例3中染毒后1個月和2個月時大鼠 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中游泳距離 的比較圖(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)表）；
[0027] 圖10為實(shí)施例3中染毒后1個月和2個月時大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果比較圖(均數(shù)土 標(biāo)準(zhǔn)表）；
[0028] 圖11-1為實(shí)施例3中溶劑對照組染毒后2個月時大鼠腦組織的病理
[0029] 形態(tài)學(xué)改變圖（HE染色200X);
[0030] 圖11-2為實(shí)施例3中l(wèi)mg/kg BDE-153組染毒后2個月時大鼠腦組織的病理形態(tài) 學(xué)改變圖（HE染色200X);
[0031] 圖11-3為實(shí)施例3中中組染毒后2個月時大鼠腦組織的病理形態(tài)學(xué)改變圖（HE 染色200X);
[0032] 圖11-4為實(shí)施例3中10mg/kg BDE-153組染毒后2個月時大鼠腦組織的病理形 態(tài)學(xué)改變圖（HE染色200X); 圖11-5為實(shí)施例3中HH50606干預(yù)組染毒后2個月時大鼠腦組織的病理形態(tài)學(xué)改變 圖（HE染色200 X)。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下通過【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明和佐證；
[0034] 實(shí)施例lcalpainl，calpain2在PBDEs神經(jīng)發(fā)育毒性中的作用
[0035] 前期研究發(fā)現(xiàn)，出生第10天接觸BDE-153能引起青少年期和成年期大鼠的學(xué)習(xí)記 憶能力下降，自發(fā)活動能力降低，引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。而calpain 在與鈣離子濃度變化相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要的作用。以下擬通過體內(nèi)動物實(shí) 驗(yàn)，研究calpainl和calpain2在PBDEs神經(jīng)發(fā)育毒性中的作用。
[0036] 采用的研究方案：
[0037] 新生的雄性SD大鼠仔鼠，在出生第4天（PND4)時按窩別和體重隨機(jī)分成4組， 分別為橄欖油溶劑對照、lmg/kg，5mg/kg和10mg/kgBDE-153染毒組。在仔鼠出生第10天 (PND10)時，按0. lml/10g體重腹腔注射染毒BDE-153的橄欖油溶液一次，繼續(xù)飼養(yǎng)2個月 后，斷頭處死大鼠，分離腦組織，檢測calpainl和calpain2基因、蛋白和激酶活力的改變。
[0038] 研究結(jié)果：
[0039] 1. calpainl和calpain2基因表達(dá)量的改變
[0040] 通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測calpainl和calpain2在BDE-153神經(jīng)發(fā)育毒性 中的作用，結(jié)果顯示calpainl基因的表達(dá)量在各組間沒有明顯改變，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義 (P> 0. 05);隨著染毒劑量的增加，calpain2基因表達(dá)量逐漸增加，中、10mg/kg BDE-153組 顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*，P < 〇. 05)，10mg/kg BDE-153組顯著高于lmg/kg BDE-153組（#，P < 0.05)，具體結(jié)果如表1、2所示。
[0041] 以上研究結(jié)果顯示，BDE-153染毒后大鼠腦組織calpain激酶活力顯著增高，而 calpainl的基因和蛋白表達(dá)量沒有明顯改變，calpain2基因和蛋白表達(dá)量隨BDE-153劑量 的增加顯著增加，提示calpain2在BDE-153神經(jīng)發(fā)育毒性中起重要的作用。
[0042] 表1大鼠腦組織calpainl和calpain2基因表達(dá)的改變（均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差）
[0043]
【權(quán)利要求】
1. 一種鈣激活蛋白酶抑制劑roi50606的用途：一種鈣激活蛋白酶抑制劑roi50606的 用途：將該鈣激活蛋白酶抑制劑roi50606制成用于治療/預(yù)防由多溴聯(lián)苯醚所引起病灶的 治療/預(yù)防藥物。
【文檔編號】A61P25/00GK104083350SQ201310471590
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】張紅梅, 李新, 常利軍, 張華俊 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)