一種不含抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途

一種不含抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種不含抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途，還公開(kāi)了一株用于制備該疫苗的不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型三基因缺失株，屬于細(xì)菌基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開(kāi)的不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型三基因缺失株APPΔclpPΔapxⅡCΔfur，是采用定向同源重組技術(shù)將胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus?pleuropeumoniae，APP）中的蛋白酶ClpP、ApxⅡ毒素激活因子ApxⅡC和鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur的編碼基因滅活得到的菌株，破壞了ClpP、ApxⅡC和Fur蛋白的表達(dá)。本發(fā)明得到的三基因缺失株比親本株毒力小，毒力降低100倍以上，對(duì)動(dòng)物安全；免疫豬后可以對(duì)APP不同血清型強(qiáng)毒菌株攻擊提供良好保護(hù)力，保護(hù)率均在80%以上，可以作為弱毒活疫苗用于豬傳染性胸膜肺炎的免疫預(yù)防。
【專利說(shuō)明】一種不含抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種不含抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途，特別涉及由一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌ClpP蛋白酶、Apx II C和Fur三基因缺失株制備得到的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其在防治豬傳染性胸膜肺炎中的用途，屬于細(xì)菌基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一種高度傳染性、致死性的呼吸道傳染病。目前該病已在世界各國(guó)廣泛流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為國(guó)際公認(rèn)的危害現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一。隨著我國(guó)現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化的發(fā)展，本病的發(fā)生呈爆發(fā)趨勢(shì)，有的豬場(chǎng)的陽(yáng)性率已達(dá)到70%以上，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。
[0003]根據(jù)APP表面莢膜(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同，可將APP分為15個(gè)血清型，血清I型又分為Ia和Ib兩個(gè)亞型，血清5型又分為5a和5b兩個(gè)亞型。目前在我國(guó)已發(fā)現(xiàn)并分離到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多種血清型，主要流行的血清型為1、3、5和7 型。
[0004]Apx毒素是APP最主要的毒力因子。目前在APP所有的15個(gè)血清型中共發(fā)現(xiàn)了 4 種Apx毒素，分別為Apx 1、Apx I1、Apx III和Apx IV。APP不同的血清型產(chǎn)生不同的Apx毒素，其中血清7型含有Apx II和Apx IV。
[0005]Apx毒素操縱子的典型結(jié)構(gòu)含有完整的CABD基因；其中，A基因編碼Apx毒素結(jié)構(gòu)蛋白，開(kāi)始合成時(shí)沒(méi)有毒素活性，C基因編碼Apx毒素激活蛋白，負(fù)責(zé)對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行乙?；せ?，形成ApxC-ApxA復(fù)合體，毒素活性隨之產(chǎn)生。B基因和D基因的編碼蛋白形成跨膜通道，負(fù)責(zé)Apx毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌。Apx I和Apx III操縱子有完整的CABD基因，而Apx II操縱子缺少B基因和D基因，其產(chǎn)物由Apx I的BD基因編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)分泌到細(xì)胞外。本發(fā)明缺失的ApxIIC是ApxIIA毒素的激活蛋白，該基因缺失后ApxII毒素將失去毒性，突變株的毒力大大下降。
[0006]生物被膜(Biofilm)是在生物體內(nèi)和非生物體表面集聚生長(zhǎng)的由細(xì)菌及其產(chǎn)生的多糖蛋白復(fù)合物所形成的固定細(xì)菌群落，它是病原菌持續(xù)感染、產(chǎn)生耐藥性和免疫逃逸的重要原因之一。APP長(zhǎng)期潛伏于豬體內(nèi)常常引起持續(xù)性感染，近年來(lái)獲得的許多臨床分離株具有多重耐藥性，并且較普遍地能形成生物被膜，被認(rèn)為在APP致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
[0007]生物被膜的產(chǎn)生是一個(gè)高度復(fù)雜的、由多種基因調(diào)控的動(dòng)態(tài)過(guò)程，這些基因涉及到細(xì)菌的黏附、新陳代謝、群體感應(yīng)(quorum sensing)和應(yīng)激反應(yīng)(stress response)等。 近年來(lái)對(duì)病原菌應(yīng)激反應(yīng)與感染性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，ClpP蛋白酶這一應(yīng)激蛋白是一種十分重要的毒力因子，它是ATP依賴的絲氨酸蛋白酶，調(diào)節(jié)著細(xì)菌對(duì)環(huán)境各種壓力的適應(yīng)(如熱休克、營(yíng)養(yǎng)缺陷、氧化應(yīng)激等)，維持細(xì)菌的形態(tài)和毒力，使其在各種環(huán)境下得到保護(hù)。研究發(fā)現(xiàn)該基因的插入突變或缺失通常會(huì)降低細(xì)菌對(duì)不良因素的承受能力，菌體生長(zhǎng)被破壞，存活力下降，并影響生物被膜形成，造成毒力減弱。本發(fā)明將ClpP蛋白酶基因缺失，使突變株毒力減弱。
[0008]鐵是細(xì)菌生長(zhǎng)的必需元素，通常由于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的游離態(tài)Fe離子很少，不能滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的需求。為了適應(yīng)體內(nèi)這種低Fe離子濃度下的生存條件，使得細(xì)菌產(chǎn)生了各種機(jī)制以攝取足夠的鐵。其中鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur是影響細(xì)菌鐵吸收的一個(gè)重要調(diào)控蛋白，調(diào)控著許多轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)菌的生存和致病力，是重要毒力因子。研究還發(fā)現(xiàn)該基因的插入突變或缺失通常會(huì)降低細(xì)菌在宿主動(dòng)物定殖力。目前雖然僅探索了少數(shù)病原菌Fur蛋白的功能，但在揭示致病機(jī)理和疫苗研究中已經(jīng)顯示出極為重要的研究?jī)r(jià)值和疫苗應(yīng)用前景。本發(fā)明將Fur調(diào)控蛋白基因缺失，使突變株毒力進(jìn)一步減弱。
[0009]目前應(yīng)用的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗能夠減輕同源血清型感染引起的臨床癥狀并降低死亡率，但不能阻止肺部病變和慢性感染，對(duì)異源血清型的感染也不能提供很好的交叉保護(hù)，而自然感染或試驗(yàn)感染能夠誘導(dǎo)對(duì)任何異源血清型的保護(hù)。因此，高效的弱毒疫苗的研制開(kāi)發(fā)將是解決當(dāng)前胸膜肺炎疫苗不足的一種可行方法。
[0010]鑒于上述背景，構(gòu)建我國(guó)流行的APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失株，研究其遺傳特性、生長(zhǎng)特性、毒力、對(duì)動(dòng)物的安全性和保護(hù)效力等生物學(xué)特性，為豬傳染性胸膜肺炎的防治、其它呼吸道傳染病的疫苗研究奠定重要的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的之一在于獲得一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌clpP、apx II C和fur三基因缺失株。
[0012]本發(fā)明提供的一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，是將豬胸膜肺炎放線桿菌的ClpP蛋白酶、Apx II毒素激活因子Apx II C和鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur的編碼基因滅活后得到的缺失突變株。
[0013]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬胸膜肺炎放線桿菌為APP血清7型菌株，更優(yōu)選為APP血清7型CVCC265株。
[0014]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述蛋白酶ClpP的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述Apx II毒素激活因子Apx II C的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，所述鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的基因缺失株為APP Λ clpP Λ apx II CAfur，分類命名為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC N0.7930，保藏時(shí)間為2013年7月16日。
[0016]本發(fā)明的目的之二在于提供一種構(gòu)建所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株的方法，其特征在于缺失株是通過(guò)將DNA片段Δ clpP、Δ apx II C以及Δ fur導(dǎo)入所述豬胸膜肺炎放線桿菌 血清7型菌株經(jīng)同源重組實(shí)現(xiàn)的；
[0017]其中，所述DNA片段Λ clpP從上游至下游依次為上同源臂clpPS和下同源臂clpPX:所述上同源臂clpPS和下同源臂clpPX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的ClpP蛋白酶編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組、滅活所述ClpP蛋白酶的編碼基因，得到clpP單基因缺失株APP AclpP ；
[0018]其中，所述DNA片段Aapx II C從上游至下游依次為上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX，所述上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的Apx II C蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組、滅活所述Apx II C蛋白的編碼基因，進(jìn)一步得到clpP和apx II C雙基因缺失株APP Λ clpP Λ apx II C ；
[0019]其中，所述DNA片段Λ fur從上游至下游依次為上同源臂furS和下同源臂furX，所述上同源臂furS和下同源臂furX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的Fur蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組、滅活所述Fur蛋白的編碼基因，更進(jìn)一步的得到clpP、apx II C 和 fur 三基因缺失株 APP Δ clpP Δ apx II C Δ fur。
[0020]在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述ClpP蛋白酶的編碼基因如SEQ ID N0.1所示，所述的Apx II C蛋白的編碼基因如SEQ ID N0.3所示，所述的Fur蛋白的編碼基因如SEQ IDN0.5所示。
[0021]本發(fā)明的目的之三在于提供所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株在制備豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明的目的之四在于提供一種豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗，其活性成分為本發(fā)明所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0024]本發(fā)明的一種不含抗性標(biāo)記豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突變菌株APP AclpP Λ apx II C Λ fur，衍生于中國(guó)獸藥監(jiān)察所購(gòu)買的豬胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株，將其基因組上的clpP基因缺失了 491bp，滅活clpP基因，使ClpP蛋白酶不表達(dá)，獲得單基因缺失突變菌株；再將其基因組上的apx II C基因缺失了 270bp，滅活apx II C基因，使Apx II C蛋白不表達(dá)，獲得雙基因缺失突變菌株；隨后又將其基因組上的fur基因缺失了 349bp，滅活fur基因，使Fur蛋白不表達(dá)，獲得三基因缺失突變株。
[0025]本發(fā)明的基本構(gòu)建方法是:
[0026]1、首先以豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型(簡(jiǎn)稱APP7，下同)CVCC265株為起始材料，以PCR的方法從CVCC265的基因組中擴(kuò)增出clpP基因的上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX，采用重疊延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，擴(kuò)增Λ clpP基因片段，此片段缺失了 clpP基因的491bp的序列片段。而后把這個(gè)經(jīng)改造的AclpP序列克隆至載體PUC18，最終成為同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)pUCAclpP。采用電轉(zhuǎn)化的方法把自殺性質(zhì)粒pUCAclpP轉(zhuǎn)化到APP7CVCC265株中，由于同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)不能在APP菌中自主復(fù)制，因此轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞內(nèi)的超螺旋的自殺質(zhì)粒便會(huì)被線性化。因自殺質(zhì)粒上含有受體菌基因的同源序列，它便會(huì)插入受菌體CVCC265的染色體中，接著線性化的質(zhì)粒與clpP基因發(fā)生置換，也就是通常所說(shuō)的單交換同源重組事件的發(fā)生。只有置換到CVCC265染色體上被線性化的自殺質(zhì)粒才能隨著染色體的復(fù)制而存在。把受體菌涂布在含有篩選標(biāo)記的TSA平板上，PCR篩選出單交換子。由于單交換是整個(gè)載體序列(含篩選藥物抗性基因)都置換到染色體上，因此，我們必須進(jìn)一步篩選目的基因整合到染色體上同時(shí)又刪除載體序列的雙交換子。將獲得的同源重組單交換子經(jīng)液體培養(yǎng)后，涂布于無(wú)抗性的TSA平板上，挑取單菌落進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性同源重組雙交換子，即clpP單基因缺失株APP Δ clpP。
[0027]2、然后，以PCR的方法從CVCC265的基因組中擴(kuò)增出apx II C基因的上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX,采用重疊延伸PCR方法拼接apx II C基因的上、下同源臂，擴(kuò)增Aapx II C基因片段，此片段缺失了 apx II C基因的270bp的序列片段。而后把這個(gè)經(jīng)改造的Aapx II C序列克隆至載體pUC18，最終成為同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)PUC Δ apx II C，再按照I的方法，以獲得的clpP單基因缺失株APP Δ clpP為起始材料，進(jìn)一步缺失apx II C基因，獲得clpP和apx II C雙基因缺失株APP AclpP Δ apx II C。
[0028]3、最后，以PCR的方法從CVCC265的基因組中擴(kuò)增出fur基因的上同源臂furS和下同源臂furX，采用重疊延伸PCR方法拼接fur基因的上、下同源臂，擴(kuò)增Λ fur基因片段，此片段缺失了 fur基因的349bp的序列片段。而后把這個(gè)經(jīng)改造的Λ fur序列克隆至載體PUC18，最終成為同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)pUC Λ fur，再按照I的方法，以獲得的clpP和apx II C雙基因缺失株APP Λ clpP Λ apx II C為起始材料，進(jìn)一步缺失fur基因，獲得clpP、apx II C 和 fur 三基因缺失株 APP Δ clpP Δ apx II C Δ fur。
[0029]本發(fā)明提供的所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株APP Δ clpP Δ apx II C Λ fur比親本株CVCC265株毒力下降達(dá)100倍以上，對(duì)試驗(yàn)小鼠和本動(dòng)物豬具有良好的安全性。以所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株APP AclpP Aapx II C Λ fur免疫動(dòng)物后，用強(qiáng)毒力的7型和5型菌株進(jìn)行攻毒，結(jié)果表明APP Δ clpP Δ apx II CA fur能對(duì)小鼠和豬提供良好的保護(hù)效力。
[0030]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是:
[0031]1、本發(fā)明所用的材料為豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株，購(gòu)自于中國(guó)獸藥監(jiān)察所，APP血清7型菌株是目前我國(guó)流行并嚴(yán)重導(dǎo)致豬發(fā)病的優(yōu)勢(shì)血清型。因此，今后以該菌株構(gòu)建的clpP、apx II C和fur三基因缺失突變菌株為基礎(chǔ)研制的疫苗會(huì)具有很強(qiáng)的針對(duì)性，有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
[0032]2、本發(fā)明豬胸膜肺炎放線`桿菌血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突變菌株不含任何抗性標(biāo)記，完全符合我國(guó)疫苗生物安全要求。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質(zhì)粒pUC Δ clpP的構(gòu)建流程圖；
[0034]圖2為豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質(zhì)粒pUC Δ apx II C的構(gòu)建流程圖；
[0035]圖3為豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質(zhì)粒pUC Δ fur的構(gòu)建流程圖；
[0036]圖4為上同源臂clpPS和下同源臂clpPX的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0037]圖中 1:clpPS (1200bp) ;2:clpPX (1249bp) ;M:DL2000DNA Marker
[0038]圖5為Λ clpP基因的PCR拼接結(jié)果；
[0039]圖中 1:八。1?卩基因(244沘？);M:DL15000DNA Marker
[0040]圖6為重組自殺質(zhì)粒pUC Δ clpP的PCR鑒定結(jié)果；
[0041]圖中 1-3: AclpP;M:DL15000DNA Marker
[0042]圖7為APP Λ clpP單交換株的PCR鑒定結(jié)果；
[0043]圖中1-3:單交換株；M:DL2000DNA Marker
[0044]圖8為APP AclpP缺失株的PCR鑒定結(jié)果；[0045]圖中M:DL2000DNA Marker; 8號(hào)為篩選的clpP單基因缺失株
[0046]圖9為APP Λ clpP缺失株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0047] 圖中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0048]圖10為上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0049]圖中 1: apx II CS (1412bp) ; 2: apx II CX (1443bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0050]圖11為Λ apx II C基因的PCR拼接結(jié)果；
[0051]圖中 1: Aapx II C 基因(2855bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0052]圖12為重組自殺質(zhì)粒pUC Δ apx II C的PCR鑒定結(jié)果；
[0053]圖中 1-5: Aapx II C;M:DL5000DNA Marker
[0054]圖13為APP Δ clpP Δ apx II C單交換株的PCR鑒定結(jié)果；
[0055]圖中1-5:單交換株；M:Dl2OOODNA Marker
[0056]圖14為APP Δ clpP Δ apx II C雙基因缺失株的PCR鑒定結(jié)果；
[0057]圖中M:DL2000DNA Marker; I號(hào)和5號(hào)為篩選的clpP和apx II C雙基因缺失株
[0058]圖15為APP Δ clpP Δ apx II C雙基因缺失株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0059]圖中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0060]圖16為上同源臂furS和下同源臂furX的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0061]圖中 1: furS (1387bp) ; 2: furX (1405bp) ;M:DL2000DNA Marker
[0062]圖17為Λ fur基因的PCR拼接結(jié)果；
[0063]圖中 1: Afur 基因(2792bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0064]圖18為重組自殺質(zhì)粒pUC Δ fur的PCR鑒定結(jié)果；
[0065]圖中 1-2: Δ fur; M: DL5000DNA Marker
[0066]圖19為APP Δ clpP Δ apx II CA fur單交換株的PCR鑒定結(jié)果；
[0067]圖中1-4:單交換株；M:Dl2OOODNA Marker
[0068]圖20為APP Δ clpP Δ apx II CA fur三基因缺失株的PCR鑒定結(jié)果；
[0069]圖中M:DL2000DNA Marker; 5號(hào)為篩選的cIpP、apx II C和fur三基因缺失株
[0070]圖21為APP Δ clpP Δ apx II CA fur三基因缺失株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0071]圖中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0072]圖22為APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur三基因缺失株和親本株攻毒后的肺部病變?！揪唧w實(shí)施方式】
[0073]下面結(jié)合具體實(shí)例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0074]本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的材料:
[0075]菌種:APP血清7型CVCC265株購(gòu)買自中國(guó)獸藥監(jiān)察所
[0076]載體和試劑:pUC18質(zhì)粒、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。
[0077]實(shí)施例1APP血清7型clpP單基因缺失突變株的構(gòu)建
[0078]1.1重組自殺載體pUC Δ clpP的構(gòu)建[0079]豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質(zhì)粒pUC Λ clpP的構(gòu)建流程圖如圖1所示。
[0080]1.1.1ClpP蛋白酶基因上、下同源臂的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
[0081]根據(jù)已報(bào)道的ΑΡΡ7型ΑΡ76株序列(參照GenBank登錄號(hào)為CP001091.1的基因序列)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增clpP基因的上同源臂clpPS和下同源臂clpPX，擴(kuò)增片段大小分別為1200bp和1249bp，上同源臂clpPS和下同源臂clpPX的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。上同源臂上游引物5’端設(shè)計(jì)EcoR I酶切位點(diǎn)，下同源臂下游引物5’端設(shè)計(jì)BamH I酶切位點(diǎn)。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0082]擴(kuò)增上同源臂的引物序列如下:
[0083]clpSF: 5’ -CGGAATTC (EcoR I ) GGGGCGTTACTGGATGC-3’
[0084]clpSR:5，-CCATCGCTTCCGCCTTTGGAGGTTTGC-3，
[0085]擴(kuò)增下同源臂的引物序列如下:
[0086]cIpXF: 5 ’ -TCCAAAGGCGGAAGCGATGGAATACGGTC-3，
[0087]clpXR:5，-CGGGATCC(BamH I )TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，
[0088]以APP血清7型CVCC265株基因組DNA為模板分別擴(kuò)增clpP基因上、下同源臂:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50μ L，其中模板DNAlOng，上、下游引物各I μ M，dNTP200 μ Μ, 10 X TaqbufferlOy L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 °C 預(yù)變性 5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。
[0089]1.1.2重疊延伸PCR方法擴(kuò)增Λ clpP基因片段
[0090]以上、下同源臂的PCR回收產(chǎn)物為模板，采用重疊延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，擴(kuò)增八(:1妒基因片段，引物(31的1?5’端下劃線部分的堿基與引物clpXF斜粗體部分的堿基反向互補(bǔ)，引物clpXF5’端下劃線部分的堿基與引物clpSR斜粗體部分的堿基反向互補(bǔ)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50yL，其中模板DNAlOng，上、下游引物各I μ M，dNTP200yM, IOXTaq bufferlO μ L, Ex Taq DNA聚合酶 2U(TaKaRa)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72V 150s, 30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切，用膠回收試劑盒回收，Λ clpP基因的PCR拼接結(jié)果如圖5所示。
[0091]1.1.3重組自殺質(zhì)粒pUCAclpP的構(gòu)建
[0092]將純化的Λ clpP基因片段用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切消化的PUC18載體相連接，16°C連接24h，熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUC AclpP,對(duì)克隆的Λ clpP基因進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，重組自殺質(zhì)粒pUC Δ clpP的PCR鑒定結(jié)果如圖6所示。
[0093]1.2APP血清7型clpP基因缺失突變株的構(gòu)建
[0094]將構(gòu)建的重組自殺質(zhì)粒pUC Δ clpP電轉(zhuǎn)化進(jìn)入APP血清7型CVCC265，在10ug/mLAmp抗性平板上篩選單交換株陽(yáng)性菌落，并在clpP上、下同源臂內(nèi)部設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR鑒定，野生株能擴(kuò)增獲得858bp片段，缺失株能擴(kuò)增獲得367bp片段，單交換株能同時(shí)擴(kuò)增獲得858bp和367bp片段，APP Λ clpP單交換株的PCR鑒定結(jié)果如圖7所示。上述引物均由北京華大基因公司合成。[0095]引物序列如下:
[0096]clpJDF:5， -CGTGGTGTCGCTTGAAACTC-3，
[0097]clpJDR:5， -AATTAGACCGTATTCCATCGC-3，[0098]將單交換株陽(yáng)性單菌落在不含Amp抗性的TSB (1%的煙酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的馬血清)培養(yǎng)增殖后，涂布于無(wú)抗性的TSA平板，挑取單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，野生株能擴(kuò)增獲得858bp片段，缺失株僅能擴(kuò)增獲得367bp片段，APP △ clpP缺失株的PCR鑒定結(jié)果如圖8所示，該陽(yáng)性克隆命名為APP Λ clpP。
[0099]將本發(fā)明制備的clpP基因缺失突變菌株APP Λ clpP在TSB培養(yǎng)基連續(xù)傳代10次，用PCR鑒定，若每一代的突變菌株都能擴(kuò)增出367bp片段，表明本發(fā)明的突變菌株是能夠穩(wěn)定遺傳的；若擴(kuò)增出858bp片段，表明本發(fā)明的突變菌株是不能穩(wěn)定遺傳的。結(jié)果如圖9所示，表明本發(fā)明制備的clpP基因缺失突變菌株能夠穩(wěn)定遺傳。
[0100]實(shí)施例2APP血清7型clpP和apx II C雙基因缺失突變株的構(gòu)建
[0101]2.1重組自殺載體pUC Aapx II C的構(gòu)建
[0102]豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質(zhì)粒pUC Δ apx II C的構(gòu)建流程圖如圖2所示。
[0103]2.1.1apx II C基因上、下同源臂的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
[0104]根據(jù)已報(bào)道的APP7型AP76株序列(參照GenBank登錄號(hào)為CP001091.1的基因序列)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增apx II C基因的上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX,擴(kuò)增片段大小分別為1412bp和1443bp,上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖10所示。上同源臂上游引物5’端設(shè)計(jì)EcoR I酶切位點(diǎn)，下同源臂下游引物5’端設(shè)計(jì)BamH I酶切位點(diǎn)。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0105]擴(kuò)增上同源臂的引物序列如下:
[0106]II CSF:5，-CGGAATTC(EcoR)ATGACAACACCAATGATTGATTTAC-3’
[0107]II CSR:5 ’ -AATCCCCGAAAGCATCATCCCTCCCATTC-3，
[0108]擴(kuò)增下同源臂的引物序列如下:
[0109]II CXF:5 ’ -GGATGATGCTTTCGGGGATTCATCTCTATTG-3，
[0110]II CXR:5 ’ -CGGGATCC(BamH)GTTGTAATAAGTCCCGTAACACCAG-3 ’
[0111]以APP血清7型CVCC265株基因組DNA為模板分別擴(kuò)增apx II C基因上、下同源臂:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為5(^1^，其中模板0嫩101^，上、下游引物各ΙμΜ，dNTP200 μ Μ,IOXTaq bufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 °C 預(yù)變性5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。
[0112]2.1.2重疊延伸PCR方法擴(kuò)增Aapx II C基因片段
[0113]以上、下同源臂的PCR回收產(chǎn)物為模板，采用重疊延伸PCR方法拼接apx II C基因的上、下同源臂，擴(kuò)增Aapx II C基因片段，Aapx II C基因的PCR拼接結(jié)果如圖11所示。引物II CSR5’端下劃線部分的堿基與引物II CXF斜粗體部分的堿基反向互補(bǔ)，引物II CXF5’端下劃線部分的堿基與引物II C SR斜粗體部分的堿基反向互補(bǔ)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ L，其中模板 DNAlOng，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X Taq bufferlO μ L, Ex Taq DNA聚合酶 2U(TaKaRa)ο PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72°C 150s, 30個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用EcoR I和BamHI進(jìn)行酶切，用膠回收試劑盒回收。
[0114]2.1.3重組自殺質(zhì)粒pUC Δ apx II C的構(gòu)建
[0115]將純化的Aapx II C基因片段用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切消化的PUC18載體相連接，16°C連接24h，熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUCAapx II C，對(duì)克隆的Aapx II C基因進(jìn)行PCR以及測(cè)序鑒定，重組自殺質(zhì)粒pUC Δ apx II C的PCR鑒定結(jié)果如圖12所示。
[0116]2.2APP血清7型clpP和apx II C雙基因缺失突變株的構(gòu)建
[0117]將構(gòu)建的重組自殺質(zhì)粒pUC Λ apx II C電轉(zhuǎn)化進(jìn)入實(shí)施例1中構(gòu)建好的APP AclpP,在10ug/mL Amp抗性平板上篩選單交換株陽(yáng)性菌落,并在apx II C上、下同源臂內(nèi)部設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR鑒定，clpP單基因缺失株能擴(kuò)增獲得564bp片段，clpP和apx II C雙基因缺失株能擴(kuò)增獲得294bp片段，單交換株能同時(shí)擴(kuò)增獲得564bp和294bp片段，APP AclpP Aapx II C單交換株的PCR鑒定結(jié)果如圖13所示。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0118]引物序列如下:
[0119]II CJDF: 5，-GAAGAGCCATTACCCAACAAC-3，
[0120]II CJDR:5，-ATACAATAGAGATGAATCCCCG-3’
[0121]將單交換株陽(yáng)性單菌落在不含Amp抗性的TSB (1%的煙酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的馬血清)培養(yǎng)增殖后，涂布于無(wú)抗性的TSA平板，挑取單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，ClpP單基因缺失株能擴(kuò)增獲得564bp片段，clpP和apx II C雙基因缺失株僅能擴(kuò)增獲得294bp片段，APP Λ clpP Λ apx II C雙基因缺失株的PCR鑒定結(jié)果如圖14所示，該陽(yáng)性克隆命名為APP Δ cIpP Δ apx II C。`
[0122]將本發(fā)明制備的clpP和apx II C雙基因缺失突變菌株APP Λ clpP Λ apx II C在TSB培養(yǎng)基連續(xù)傳代10次，用PCR鑒定，若每一代的突變菌株都能擴(kuò)增出294bp片段，表明本發(fā)明的突變菌株是能夠穩(wěn)定遺傳的；若擴(kuò)增出564bp片段，表明本發(fā)明的突變菌株是不能穩(wěn)定遺傳的。結(jié)果如圖15所示，表明本發(fā)明制備的clpP和apx II C雙基因缺失突變菌株能夠穩(wěn)定遺傳。
[0123]實(shí)施例3APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突變株的構(gòu)建
[0124]3.1重組自殺載體pUC Δ fur的構(gòu)建
[0125]豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質(zhì)粒pUC Λ fur的構(gòu)建流程圖如圖3所示。
[0126]3.1.1fur基因上、下同源臂的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
[0127]根據(jù)已報(bào)道的APP7型AP76株序列(參照GenBank登錄號(hào)為CP001091.1的基因序列)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增fur基因的上同源臂furS和下同源臂furX，擴(kuò)增片段大小分別為1412bp和1443bp，上同源臂furS和下同源臂furX的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖16所示。上同源臂上游引物5’端設(shè)計(jì)EcoR I酶切位點(diǎn)，下同源臂下游引物5’端設(shè)計(jì)BamH I酶切位點(diǎn)。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0128]擴(kuò)增上同源臂的引物序列如下:
[0129]furSF: 5，-CGGAATTC (EcoR) TTAGCCGTGATGGTGGTG-3 ’
[0130]furSR: 5，-TTTCATGCATTTTCTTCAGACATAACTTG-3，[0131]擴(kuò)增下同源臂的引物序列如下:
[0132]furXF: 5，~AAGAAAATGCATGAAATTAGCGACGCACAG~3，
[0133]furXR: 5，-CGGGATCC (BamH) GTTTAGGCTCGCCTTTGC-3，
[0134]以APP血清7型CVCC265株基因組DNA為模板分別擴(kuò)增fur基因上、下同源臂:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50yL，其中模板DNAlOng，上、下游引物各ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X TaqbufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 °C 預(yù)變性 5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑
盒回收。
[0135]3.1.2重疊延伸PCR方法擴(kuò)增Λ fur基因片段
[0136]以上、下同源臂的PCR回收產(chǎn)物為模板，采用重疊延伸PCR方法拼接fur基因的上、下同源臂，擴(kuò)增Afur基因片段，Afur基因的PCR拼接結(jié)果如圖17所示。引物furSR5’端下劃線部分的堿基與引物furXF斜粗體部分的堿基反向互補(bǔ)，引物furXF5’端下劃線部分的堿基與引物fur SR斜 粗體部分的堿基反向互補(bǔ)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ L，其中模板 DNAlOng，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X Taq bufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶2U (TaKaRa)0 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72°C 150s, 30 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切，用膠回收試劑盒回收。
[0137]3.1.3重組自殺質(zhì)粒pUC Afur的構(gòu)建
[0138]將純化的Λ fur基因片段用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切消化的PUC18載體相連接，16°C連接24h，熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUC Δ fur,對(duì)克隆的Λ fur基因進(jìn)行PCR以及測(cè)序鑒定，重組自殺質(zhì)粒pUC Δ fur的PCR鑒定結(jié)果如圖18所示。
[0139]3.2APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突變株的構(gòu)建
[0140]將構(gòu)建的重組自殺質(zhì)粒pUC Λ fur電轉(zhuǎn)化進(jìn)入實(shí)施例2中構(gòu)建好的APP Δ cIpP Δ apx II C,在10ug/mL Amp抗性平板上篩選單交換株陽(yáng)性菌落,并在fur上、下同源臂內(nèi)部設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR鑒定，clpP和apx II C雙基因缺失株能擴(kuò)增獲得897bp片段，clpP, apx II C和fur三基因缺失株能擴(kuò)增獲得548bp片段，單交換株能同時(shí)擴(kuò)增獲得897bp和548bp片段，APP AclpP Aapx II C Λ fur三基因缺失株的PCR鑒定結(jié)果如圖19所示。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0141]引物序列如下:
[0142]furJDF:5’ -GACATTGGCCGACGGAAG-3’
[0143]furJDR: 5，-GCCAATCACGAAAGCAACG-3 ’
[0144]將單交換株陽(yáng)性單菌落在不含Amp抗性的TSB(1%的煙酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的馬血清)培養(yǎng)增殖后，涂布于無(wú)抗性的TSA平板，挑取單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，ClpP和apx II C雙基因缺失株能擴(kuò)增獲得897bp片段，clpP、apx II C和fur三基因缺失株僅能擴(kuò)增獲得548bp片段，APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur三基因缺失株的PCR鑒定結(jié)果如圖20所示，該陽(yáng)性克隆命名為APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為CGMCC N0.7930。[0145]將本發(fā)明制備的clpP、apx II C和fur三基因突變菌株APP Λ clpP Λ apx II CAfur在TSB培養(yǎng)基連續(xù)傳代10次，用PCR鑒定，若每一代的突變菌株都能擴(kuò)增出548bp片段，表明本發(fā)明的突變菌株是能夠穩(wěn)定遺傳的；若擴(kuò)增出897bp片段，表明本發(fā)明的突變菌株是不能穩(wěn)定遺傳的。結(jié)果如圖21所示,表明本發(fā)明制備的clpP、apx II C和fur三基因缺失突變菌株能夠穩(wěn)定遺傳。
[0146]實(shí)施例4APP Δ clpP Δ apx II CA fur突變株的毒力鑒定和安全性評(píng)價(jià)
[0147]試驗(yàn)動(dòng)物:4-6周齡SPF級(jí)Balb/C雌鼠，8-9周齡APP血清陰性健康豬，均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0148]4.1對(duì)小鼠的毒力鑒定和安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)
[0149]將小鼠隨機(jī)分為二組，每組60只。具體接種方案如下:
[0150]第一組(試驗(yàn)組):接種實(shí)施例3制備的APP Δ clpP Δ apx II C Afur,稀釋為表1中所列6個(gè)濃度(CFU)，每個(gè)濃度10只小鼠，每只小鼠腹腔接種劑量0.1ml0
[0151]第二組(對(duì)照組):接種豬胸膜肺炎放線桿菌CVCC265，稀釋為表1中所列6個(gè)濃度(CFU)，每個(gè)濃度10只小鼠，每只小鼠腹腔接種劑量0.1ml0
[0152]小鼠存活情況見(jiàn)表1。結(jié)果表明，APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur對(duì)小鼠的毒力與野生株CVCC265相比下降了 100倍以上。
[0153]表1
[0154]
【權(quán)利要求】
1.一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，其特征在于該菌株缺失了蛋白酶ClpP、Apx II毒素激活因子Apx II C和鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur的編碼基因。
2.如權(quán)利要求1所述的不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，其特征在于所述豬胸膜肺炎放線桿菌為豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌株。
3.如權(quán)利要求2所述的不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，其特征在于所述豬胸膜肺炎放線桿菌為豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株。
4.如權(quán)利要求1所述的不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，其特征在于:所述蛋白酶ClpP的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述Apx II毒素激活因子Apx IIC 的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，所述鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur的氨基酸序列如SEQ ID N0.6 所示。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株， 其特征在于:所述的基因缺失株為APP A clpP A apx II C A fur,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為CGMCC N0.7930。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株在制備預(yù)防豬傳染性胸膜肺炎疫苗中的應(yīng)用。
7.一種不含抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗，其活性成分為權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株。
【文檔編號(hào)】A61K39/02GK103555645SQ201310469680
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】王春來(lái), 謝芳, 李剛, 張艷禾 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所