心腦欣膠囊在制備治療腦缺血藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了心腦欣膠囊在制備治療腦缺血藥物中的應(yīng)用。研究結(jié)果表明，心腦欣膠囊能增加小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間，并增加斷頭張口喘氣時(shí)間，提示心腦欣膠囊對(duì)缺氧環(huán)境小鼠具有一定的保護(hù)作用。此外，心腦欣膠囊能夠明顯降低雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎所致腦缺血小鼠的腦含水量、腦指數(shù)和腦毛細(xì)血管通透性等，提示心腦欣膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血有一定保護(hù)作用。
【專利說(shuō)明】心腦欣膠囊在制備治療腦缺血藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及心腦欣膠囊在制備治療腦缺血藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]缺血性腦血管疾病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病，其死亡率高。目前治療缺血性腦血管病除合理膳食、適當(dāng)鍛煉、戒煙戒酒、養(yǎng)成良好的生活習(xí)慣之外，一般都要采用臨床治療，但是在治療應(yīng)用中存在出血和再灌注損傷等危害，因此探討缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)保護(hù)缺血性腦損傷的藥物具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。
[0003]心腦欣膠囊為三普藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025866，主治益氣養(yǎng)陰、活血化瘀。但在學(xué)習(xí)記憶障礙的作用還未見(jiàn)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供心腦欣膠囊的新應(yīng)用。
[0005]技術(shù)方案:本發(fā)明公開(kāi)了心腦欣膠囊在制備治療腦缺血藥物中的應(yīng)用。
[0006]上述心腦欣膠囊由重量份數(shù)為3~6份的紅景天，5~15份的枸杞，3~9份的沙棘組成。
[0007]有益效果:研究結(jié)果表明，心腦欣膠囊能增加小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間，并增加斷頭張口喘氣時(shí)間，提示心腦欣膠囊對(duì)缺氧環(huán)境小鼠具有一定的保護(hù)作用。此外，心腦欣膠囊能夠明顯降低雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎所致腦缺血小鼠的腦含水量、腦指數(shù)和腦毛細(xì)血管通透性等，提示心腦欣膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血有一定保護(hù)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1:
[0009]心腦欣膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血小鼠的保護(hù)作用
[0010]I實(shí)驗(yàn)材料
[0011]1.1 藥物
[0012]心腦欣膠囊，內(nèi)容物為棕褐色粉末，0.5g/粒，批號(hào):120803三普藥業(yè)股份有限公司；實(shí)驗(yàn)時(shí)，去除膠囊外殼，研磨內(nèi)容物，用雙蒸水配置成所需濃度。尼莫地平，規(guī)格:30mg，批號(hào):BJ09103，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；實(shí)驗(yàn)時(shí)，研磨為粉末，用雙蒸水配置成所需濃度。伊文思藍(lán)，批號(hào):W20111101，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲酰胺，批號(hào):11032310336，南京化學(xué)試劑有限公司。考馬斯亮蘭、超氧化物歧化酶(S0D)、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合成酶(N0S)、谷氨酸(Glu)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司。
[0013]1.2 儀器
[0014]電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；恒溫干燥箱(Ecocell，德國(guó))；酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；高速離心機(jī)(Sigma，1-15K)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，常州國(guó)華電器有限公司)，XW-80A旋渦混合器(上海滬西分析儀器廠);微量移液器；手動(dòng)勻漿器；SMG-2通道式水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；STT-2跳臺(tái)儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。
[0015]1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0016]清潔級(jí)ICR小鼠，18~22g，雄性，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK (蘇)2012-0004。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持12h晝夜節(jié)律，室溫22± I°C，自由飲水?dāng)z食。
[0017]2實(shí)驗(yàn)方法
[0018]2.1小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的測(cè)定
[0019]清潔級(jí)ICR小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組(灌胃等體積生理鹽水)，尼莫地平組(40mg/kg/d),心腦欣膠囊低、中、高劑量組(170mg/kg/d、340mg/kg/d、680mg/kg/d)?？瞻讓?duì)照組及各給藥組ig，2次/d，連續(xù)3d，于末次給藥后lh，立即將各組小鼠分別放入容積為125ml的密閉廣口瓶中，瓶?jī)?nèi)放有IOg鈉石灰，觀察并記錄小鼠存活時(shí)間。
[0020]2.2小鼠斷頭后張口喘氣時(shí)間的測(cè)定
[0021]分組與給藥同2.1。于末次灌胃后lh，用大剪刀在小鼠耳下部快速斷頭，記錄從斷頭到最后一次張口喘氣的時(shí)間，即為張口喘氣時(shí)間。
[0022]2.3急性不完全性腦缺血模型小鼠腦指數(shù)、腦含水量的測(cè)定
[0023]清潔級(jí)ICR小鼠90只，隨機(jī)分為6組。即假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、心腦欣膠囊低、中、高劑量組。給藥劑量與方式同2.1，連續(xù)給藥3d，末次給藥Ih后，將小鼠用10%水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)。引入雙線并分別結(jié)扎，形成急性實(shí)驗(yàn)性不完全性腦缺血模型；假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎。3h后，快速斷頭，開(kāi)顱取腦，去除小腦及延髓。稱重(濕腦重)，計(jì)算腦指數(shù)(腦指數(shù)=濕腦重X 100/體重)。然后在110°C烤箱中烤至恒重，分析天平稱重(干腦重)，計(jì)算腦含水量，腦含水量％=(濕腦重-干腦重)/濕腦重X 100%。
[0024]2.4急性不完全性腦缺血模型小鼠腦毛細(xì)血管通透性的測(cè)定
[0025]小鼠分組，給藥及造模同2.3。模型組及各給藥組在結(jié)扎雙側(cè)CCA前5min尾靜脈注射0.5%伊文思蘭50mg/kg，隨即結(jié)扎雙側(cè)CCA ;假手術(shù)組尾靜脈注射伊文思蘭50mg/kg，分離出雙側(cè)CCA，但不結(jié)扎。結(jié)扎45min后，斷頭取腦，稱重大腦濕重(去小腦、延髓)，將腦組織浸泡于4ml甲酰胺中，于45°C恒溫箱中溫育72h，取溫育液，用酶標(biāo)儀在620nm處測(cè)定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=41.214x-0.0035，R2=0.9988)計(jì)算出腦內(nèi)伊文思藍(lán)的含量，計(jì)算出腦內(nèi)伊文思藍(lán)的含量(ug/g腦濕重)。
[0026]2.5小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血再灌注實(shí)驗(yàn)
[0027]2.5.1分組、造模及給藥
[0028]清潔級(jí)ICR小鼠90只，隨機(jī)分為6組。即假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、心腦欣膠囊低、中、高劑量組 。將小鼠用10%水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)CCA。模型組、陽(yáng)性藥組及心腦欣膠囊給藥組用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCAlOmin。松開(kāi)動(dòng)脈夾灌注IOmin后，再夾閉lOmin，再通后縫合傷口。放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組的麻醉及手術(shù)過(guò)程與模型組相同，但不阻斷CCA，觀察時(shí)間與模型組相同。在全部造模過(guò)程中保持動(dòng)物肛溫在37°C左右。術(shù)后3d小鼠開(kāi)始灌胃給藥:空白對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水，尼莫地平組為30mg/kg/d，心腦欣膠囊低、中、高劑量組灌胃劑量分別為170mg/kg/d、340mg/kg/d、680mg/kg/d,每天灌胃I次,連續(xù)給藥30d。
[0029]2.5.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(Step-downavoidancetest)
[0030]被動(dòng)回避反應(yīng)箱，底板設(shè)有銅柵，可通交流電，電壓為36V。銅柵的一角放置一個(gè)橡膠平臺(tái)作為安全區(qū)，小鼠可停留在平臺(tái)上回避電擊。末次給藥Ih后開(kāi)始進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練。訓(xùn)練前先將小鼠放入箱中自由活動(dòng)3min，熟悉環(huán)境，然后接通銅柵電源，持續(xù)5min，記錄第一次跳下平臺(tái)的潛伏期和5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)(動(dòng)物跳下平臺(tái)的次數(shù))，以此作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24h后測(cè)驗(yàn)，記錄動(dòng)物第一次跳下平臺(tái)的潛伏期和5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)，以此作為記憶成績(jī)。
[0031]2.5.3 通道式水迷宮實(shí)驗(yàn)(watermazetest)
[0032]通道式水迷宮由黑色有機(jī)玻璃板制成，水深22cm，水溫控制在25 V左右，分為終點(diǎn)區(qū)，A區(qū)，B區(qū)，C區(qū)，D區(qū)。并設(shè)有4個(gè)盲端，終點(diǎn)設(shè)有臺(tái)階，動(dòng)物通過(guò)臺(tái)階可上岸躲避溺水危險(xiǎn)。檢測(cè)前先對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)先將動(dòng)物放在終點(diǎn)臺(tái)階附近，讓其自行爬梯2次，以熟悉逃生途徑。整個(gè)訓(xùn)練分4階段進(jìn)行，第一階段:將擋板擋在A處，讓動(dòng)物學(xué)習(xí)從該處游回終點(diǎn)；第二階段:擋板擋在B處，以此為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行訓(xùn)練；第三階段:將擋板擋在C處，讓動(dòng)物學(xué)習(xí)從該處游回終點(diǎn)；第四階段:從起點(diǎn)開(kāi)始訓(xùn)練。每一階段訓(xùn)練2次，訓(xùn)練過(guò)程中可用指示棒適當(dāng)引導(dǎo)，每階段訓(xùn)練結(jié)束后休息2h再進(jìn)行下一階段的訓(xùn)練。全部訓(xùn)練結(jié)束后，讓小鼠休息2h，然后進(jìn)行檢測(cè)。先將小鼠放于終點(diǎn)的爬梯附近，使其自行爬上2次，以進(jìn)一步熟悉環(huán)境，然后放于起點(diǎn)處，記錄3min內(nèi)動(dòng)物由起點(diǎn)游至終點(diǎn)區(qū)臺(tái)階處全程所需時(shí)間(latency)以及進(jìn)入盲端次數(shù)(errortimes),作為學(xué)習(xí)成績(jī)。3min內(nèi)不能游出者,計(jì)3min。24h后重復(fù)測(cè)試,作為記憶成績(jī)。2.5.4小鼠血楽:中內(nèi)皮素-1 (ET-1),血栓素B2 (TXB2)和6-酮-前列腺素(6-keto-PGFl α )含量測(cè)定
[0033]行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食IOh后給藥,給藥Ih后摘眼球取血,3.8%枸櫞酸三鈉溶液抗凝。3000r/min離心lOmin，取上層液，于4°C保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作程序測(cè)定各`指標(biāo)。
[0034]2.5.5腦組織勻漿的制備
[0035]小鼠摘眼球取血后，立即將其脫頸椎處死，于冰浴上取出大腦組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液,濾紙拭干,稱重。按重量體積比加生理鹽水制成10%的組織勻漿，2500r/min,離心15min,取上清液備用。
[0036]2.5.6小鼠腦內(nèi)蛋白含量的測(cè)定
[0037]測(cè)定原理:蛋白質(zhì)分子具有-NH3+基團(tuán)，當(dāng)棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白-NH3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過(guò)測(cè)定吸光度可以計(jì)算出蛋白含量。
[0038]操作步驟:按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作程序進(jìn)行。
[0039]2.5.7超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定
[0040]測(cè)定原理:通過(guò)黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。
[0041]操作步驟:參見(jiàn)SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0042]2.5.8 丙二醛(MDA)測(cè)定[0043]測(cè)定原理:過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。
[0044]操作步驟:按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作程序進(jìn)行。
[0045]2.5.9谷氨酸(Glu)含量測(cè)定
[0046]測(cè)定原理:
【權(quán)利要求】
1.心腦欣膠囊在制備治療腦缺血藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的心腦欣膠囊，其特征在于，由以下重量份數(shù)組分組成:紅景天3~6份，枸杞5~15份， 沙棘3~9份。
【文檔編號(hào)】A61K9/48GK103520363SQ201310398194
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】馬俊倉(cāng), 鄒存生, 李成秀, 張國(guó)清, 夏彬 申請(qǐng)人:三普藥業(yè)有限公司