一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物含有免疫量的豬瘟病毒抗原、免疫量的副豬嗜血桿菌抗原、免疫量的豬圓環(huán)病毒2型抗原以及獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。該疫苗組合物能有效地同時(shí)防治豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和副豬嗜血桿菌病，其一次注射即可達(dá)到單苗注射2次的免疫效果，副反應(yīng)小，免疫期長(zhǎng)，耗時(shí)少、費(fèi)力少。
CCTCC NO:M2011173
2011.05.18
CCTCC NO:M2011172
2011.05.18
【專利說(shuō)明】一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬瘟是豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特征是高溫、微血管變性而 引起全身出血、壞死、梗塞。早年又稱豬霍亂，對(duì)豬危害極為嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。
[0003] 豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,縮寫(xiě)：PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病 毒。現(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，S卩PCVl和PCV2。PCVl為非致病性的病毒。PCV2為致病性的 病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome， PMWS)的主要病原，最早發(fā)現(xiàn)于加拿大（1991 )，很快在歐美及亞洲一些國(guó)家包括我國(guó)發(fā)生和 流行，除PMWS外，TONS (豬皮炎與腎病綜合征)、PNP (增生性壞死性肺炎)、PRDC (豬呼吸道 疾病綜合征)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)。PCV2及其相 關(guān)的豬病，死亡率10%?30%不等，較嚴(yán)重的豬場(chǎng)在暴發(fā)本病時(shí)死淘率高達(dá)40%，給養(yǎng)豬業(yè) 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)已被世界各國(guó)的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為是繼豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的引起豬免疫障礙的重要傳染病。
[0004] 副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPs)是豬Glasser' S病的病原體，豬上 呼吸道的一種共棲菌，它可在特定條件下侵入機(jī)體而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié) 炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。目前，我國(guó)很多省市患病豬群中均可分離獲得副豬嗜血 桿菌，該菌可影響從2周齡的哺乳仔豬到4月齡的育肥豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病， 多見(jiàn)于5-8周齡的豬，發(fā)病率在10%-15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)50%，已成為保育豬死亡的主要 原因之一，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005] 目前這三種病原常常侵襲豬只，存在混合感染的情況，進(jìn)一步加劇了發(fā)病死亡情 況，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的風(fēng)險(xiǎn)。解決這個(gè)問(wèn)題最有效、直接的方式是進(jìn)行疫苗免疫，豬瘟 疫苗常用免疫程序是30-35日齡首免，60-70日齡二免；豬圓環(huán)疫苗常用免疫程序?yàn)?4-21 日齡首免，間隔2周二免；副豬嗜血桿菌病疫苗常用免疫程序?yàn)?-4周齡首免，2周后二免。 三種疫苗在應(yīng)用時(shí)都需要進(jìn)行二次免疫，增加了工作的強(qiáng)度，多次免疫也易于造成豬群的 應(yīng)激反應(yīng)。
[0006] 目前尚沒(méi)有豬瘟、豬圓環(huán)病毒和副豬嗜血桿菌的三聯(lián)組合疫苗。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種含有豬瘟病毒、副豬嗜血桿菌與豬圓環(huán) 病毒抗原的三聯(lián)混合疫苗及其制備方法，有效地同時(shí)防治豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和副豬嗜血 桿菌病，達(dá)到一針多防的效果，其一次注射即可達(dá)到單苗注射2次的免疫效果，副反應(yīng)小， 免疫期長(zhǎng)，耗時(shí)少、費(fèi)力少。該發(fā)明經(jīng)濟(jì)實(shí)用，簡(jiǎn)化了免疫程序，降低了防疫成本和冷鏈運(yùn)輸 的成本。
[0008] 因此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物含有免 疫量的豬瘟病毒抗原、免疫量的副豬嗜血桿菌抗原、免疫量的豬圓環(huán)病毒2型抗原以及獸 醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
[0009] 優(yōu)選地，所述豬瘟抗原是豬瘟全病毒抗原，優(yōu)選滅活形式、改良的活的形式或減毒 形式的豬瘟病毒抗原，含有至少豬瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含 至少豬瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬瘟病毒 為減毒形式的全病毒抗原，可以是選自細(xì)胞源豬瘟病毒、兔源豬瘟病毒、脾淋源豬瘟病毒中 的一種或幾種。
[0010] 所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬圓環(huán)病毒 2型抗原中的一種或幾種，并且，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原選自豬圓環(huán)病毒2型全病毒抗原， 含有豬圓環(huán)病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何至少含有豬圓環(huán)病毒2型免疫 原性氨基酸序列的多肽或亞單位成分中一種或幾種。優(yōu)選所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活 的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成份。
[0011] 本發(fā)明中，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抵抗PCV2感染的 免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活形式的全病毒抗 原，可以是江蘇南農(nóng)高科豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的SH株、成都天邦和福州大北農(nóng)豬圓環(huán) 病毒2型滅活疫苗的DBN-SX07株、哈爾濱維科豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的LG株、武漢科前 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的WH株中的一種或幾種。
[0012] 本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)"副豬嗜血桿菌抗原"是指含有至少一種副豬嗜血桿菌抗原形式的 組合物，所述抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抵抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應(yīng)答。副豬嗜血 桿菌的野毒株，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的1?15 個(gè)血清型或無(wú)法確定血清型的副豬嗜血桿菌。所述副豬嗜血桿菌抗原為副豬嗜血桿菌的完 整細(xì)胞體。
[0013] 在本發(fā)明中，所述的副豬嗜血桿菌抗原可以是選自（武漢科前副豬嗜血桿菌病滅 活疫苗(血清4型MD0322 +血清5型SH0165)，勃林格茵格發(fā)副豬嗜血桿菌病滅活疫苗 (Z-1517株)，西班牙海博萊豬副豬嗜血桿菌滅活疫苗(血清1型SVl +血清6型SV6))中的 一種或幾種。
[0014] 優(yōu)選地，所述豬瘟病毒抗原為全病毒抗原、所述副豬嗜血桿菌為全菌抗原、所述豬 圓環(huán)病毒2型抗原為全病毒抗原。
[0015] 更優(yōu)選地，所述豬瘟病毒抗原為活的形式的全病毒抗原、所述副豬嗜血桿菌為滅 活形式的全菌抗原、所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活形式的全病毒抗原。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述滅活形式的副豬嗜血桿菌全菌抗原為副豬嗜血桿菌4型JS株 全菌滅活抗原和5型ZJ株全菌滅活抗原；所述活的形式的豬瘟病毒全病毒抗原為豬瘟兔化 弱毒株抗原；所述滅活形式的豬圓環(huán)病毒2型全病毒抗原為豬圓環(huán)病毒2型SH株全病毒滅 活抗原。
[0017] 所述豬瘟兔化弱毒株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏，保藏號(hào)AV1412。
[0018] 所述豬圓環(huán)病毒 2 型 SH 株（Porcine Circovirus Type2，strain SH)，在中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏號(hào)為 CGMCC No. 2389,公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)CN101240264A。
[0019] 副豬嗜血桿菌血清 4 型 JS 株（Haemophilus Parasuis，Serotype4, strain JS)的 保藏編號(hào)為：CCTCC NO :Μ2011172;副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株（Haemophilus Parasuis， Serotype5, strain ZJ)的保藏編號(hào)為：CCTCC NO :M2011173;上述菌種均保藏于中國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ;地址：湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))。保藏 日期均為2011年05月18日。
[0020] 優(yōu)選地，所述副豬嗜血桿菌抗原含量為IO8?IOltlCFU/頭份；所述豬圓環(huán)病毒2型 抗原含量為1〇 5_°?IO6 qTCID5ci/頭份；所述豬瘟病毒抗原含量為105_°?IO6 qTCID5q/頭份。
[0021] 更優(yōu)選地，所述副豬嗜血桿菌抗原含量為IO9CFU/頭份；所述豬圓環(huán)病毒2型抗原 含量為IO 6 tlTCID5ci/頭份；所述豬瘟病毒抗原含量為IO6 tlTCID5ci/頭份。
[0022] 優(yōu)選地，所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體包括凍干保護(hù)劑和佐劑；所述凍干保護(hù)劑凍 干保護(hù)劑為按1:1比例的2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液，所述佐劑為獸醫(yī)學(xué)上可接 受的礦物油佐劑、鋁鹽佐劑、水佐劑或細(xì)胞因子佐劑。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明的獸藥學(xué)上可接受的佐劑為水佐劑。
[0024] 本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"水佐劑"又稱"水基佐劑"或"水溶性佐劑"，是一種聚合物水溶 性分散體，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸類合成聚合物 組成。
[0025] 優(yōu)選地，本發(fā)明的獸藥學(xué)上可接受的佐劑為gel佐劑。
[0026] 在本發(fā)明中，所述疫苗組合物還可以進(jìn)一步包括其它豬的病原體的附加抗原，其 選自豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)的抗原、豬偽狂犬病毒（PRV)抗原、豬肺炎支原體抗 原、豬傳染性胸膜肺炎抗原、豬流感病毒（SIV)中的一種或幾種。
[0027] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法 包括：
[0028] 1)培養(yǎng)增殖所述副豬嗜血桿菌，滅活并濃縮；培養(yǎng)增殖所述豬圓環(huán)病毒2型病毒， 滅活并濃縮；將所述副豬嗜血桿菌抗原、所述豬圓環(huán)病毒2型抗原按比例混合，添加獸醫(yī)學(xué) 上可接受的佐劑制備成滅活疫苗；
[0029] 2)培養(yǎng)增殖所述豬瘟病毒；加入凍干保護(hù)劑混勻，冷凍干燥，制成活疫苗部分。
[0030] 優(yōu)選地，先將副豬嗜血桿菌菌液和豬圓環(huán)病毒2型病毒液分別進(jìn)行滅活，然后將 滅活檢驗(yàn)合格的副豬嗜血桿菌抗原和豬圓環(huán)病毒2型抗原分別進(jìn)行濃縮，配苗，制備得到 滅活苗部分；豬瘟病毒液加入凍干保護(hù)劑，制備得到活苗部分，用所述滅活苗部分稀釋所述 活苗部分，即得所述含有圓環(huán)病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原和豬瘟病毒抗原的三聯(lián)疫苗組 合物。
[0031] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述的疫苗組合物在用于制備預(yù)防和治療豬瘟病毒、 副豬嗜血桿菌和豬圓環(huán)病毒2型的感染的藥物中的應(yīng)用。
[0032] 使用時(shí)可將抗豬圓環(huán)、副豬嗜血桿菌的疫苗組合物稀釋抗豬瘟的疫苗組合物，得 到抗豬圓環(huán)病毒2型、副豬嗜血桿菌和豬瘟的三聯(lián)疫苗組合物，也可將抗豬圓環(huán)病毒2型、 副豬嗜血桿菌的疫苗組合物與抗豬瘟的疫苗組合物分別單獨(dú)使用。
[0033] 本發(fā)明技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果：
[0034] 1、含有兩種或兩種以上抗原、可以預(yù)防兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗以其方 便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的特點(diǎn)。與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的 接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存乃 至全部使用過(guò)程均需在較低溫度下進(jìn)行，即所謂的"冷鏈"，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運(yùn)作，費(fèi)用 極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運(yùn)作的費(fèi)用，因此具有 顯著的優(yōu)越性。
[0035] 2、本發(fā)明的豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌抗原組合物及使用該組合物制 備的預(yù)防和治療豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌感染的三聯(lián)疫苗，在一定抗原含量 范圍內(nèi)不僅不會(huì)產(chǎn)生抗原成份的相互免疫干擾或影響，而且意外發(fā)現(xiàn)豬瘟、豬圓環(huán)病毒2 型和副豬嗜血桿菌的抗原混合后，豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌的抗原組合物不 僅能產(chǎn)生的保護(hù)性免疫應(yīng)答的同時(shí)，豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌的抗原有相互 增強(qiáng)免疫效果的作用，而且如本發(fā)明后續(xù)實(shí)施例所證明的，特別是存在其中一種抗原的情 況下，另兩種抗原量減半仍能維持本抗原的免疫效果，而這出乎本領(lǐng)域普通技術(shù)人員預(yù)料 的。
[0036] 3、上述預(yù)防和治療豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌感染的三聯(lián)疫苗與豬 瘟、豬圓環(huán)病毒2型或副豬嗜血桿菌的單疫苗的效力相比，在對(duì)豬注射免疫過(guò)程中，豬體的 應(yīng)激反應(yīng)出人預(yù)料地小，因此，本發(fā)明的三聯(lián)疫苗安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現(xiàn) 的不良反應(yīng)。
[0037] 4、此外，本發(fā)明預(yù)防和治療豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌相關(guān)疾病的三 聯(lián)疫苗，制備方法簡(jiǎn)單，疫苗的效價(jià)含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術(shù)中的多次免疫，至少 需要打2針或3針才能防治以上三種疾病的疫苗及其免疫方法相比，本發(fā)明僅免疫1次就 能夠預(yù)防豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌三種病原感染，降低了免疫成本，節(jié)約了免 疫程序，更加高效。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0039] 實(shí)施例1豬瘟抗原、豬圓環(huán)病毒抗原和副豬嗜血桿菌抗原的制備
[0040] 1豬瘟抗原制備
[0041] I. 1將長(zhǎng)成良好單層的對(duì)豬瘟病毒(豬瘟兔化弱毒株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏， 保藏號(hào)AV1412)高敏感的ST細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)用含0. 125%胰酶和0. 03%EDTA的消化液， 進(jìn)行消化分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入I. 5%-5%FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)按 照Μ. 0. I. =0. 01-0. 6接毒劑量加入種毒，進(jìn)一步優(yōu)選接毒劑量為Μ. 0. I. =0. 1-0. 6,進(jìn)一步 優(yōu)選接毒劑量為Μ. 0. I. =0. 2-0. 4,置于34-37°C溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)一步優(yōu)選培養(yǎng)溫度為 34-35 °C。
[0042] 培養(yǎng)三天后進(jìn)行第一次收毒，收毒后補(bǔ)加 I. 5_3%FBS的細(xì)胞維持液，以后每隔2天 收毒一次，可連續(xù)收毒5次。收毒后將抗原混合置于-20°C儲(chǔ)藏。
[0043] 1. 2豬瘟病毒含量測(cè)定：各收次病毒培養(yǎng)液分別采用間接免疫熒光法進(jìn)行TCID5tl 測(cè)定。每ml病毒含量為106 5TCID5。。
[0044] 2豬圓環(huán)病毒2型抗原制備
[0045] 2. 1菌株來(lái)源：制造及檢驗(yàn)本品用的豬圓環(huán)病毒2型毒株為PCV-2毒株SH株，在 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保 藏號(hào)為 CGMCC No. 2389。
[0046] 2. 2制苗用病毒液的制備：用轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法。將長(zhǎng)滿單層的PK15細(xì)胞(購(gòu)自 ATCC)，倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，將毒種液按細(xì)胞培養(yǎng)液體積5%的接種量接種于PK15細(xì)胞上，輕輕 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶2周，37°C吸附30分鐘，加入細(xì)胞維持液，置37°C旋轉(zhuǎn)（10?12轉(zhuǎn)/小時(shí))培養(yǎng)。 每日觀察1?2次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，37°C培養(yǎng)4日收獲細(xì)胞和細(xì)胞液，凍融3次，置-20°C以 下保存，應(yīng)不超過(guò)2個(gè)月。
[0047] 2. 3含量測(cè)定：將病毒培養(yǎng)液采用間接免疫熒光法進(jìn)行TCID5tl測(cè)定，每ml病毒含 量應(yīng)彡 105_5TCID5Q。
[0048] 2. 4滅活：將病毒液按病毒液總量加入終濃度為0. 2%的甲醛溶液（V/V)，隨即充 分搖勻升溫，當(dāng)溫度升至37°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，保持18小時(shí)滅活完畢，加入0. 2wt%的焦亞硫酸 鈉終止滅活，取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。
[0049] 2. 5濃縮：將滅活檢驗(yàn)合格的豬圓環(huán)病毒2型病毒液分別采用超濾濃縮技術(shù)進(jìn)行 濃縮，濃縮后抗原含量為l〇7_°TCID 5(l/ml。
[0050] 3副豬嗜血桿菌抗原制備
[0051] 3. 1菌株來(lái)源：制造及檢驗(yàn)本品用的副豬嗜血桿菌菌株為副豬嗜血桿菌4型JS株 (CCTCC M2011172)和5型ZJ株（CCTCC M2011173)，均由普萊柯生物工程股份有限公司從 河南發(fā)病豬場(chǎng)分離鑒定，在湖北省武漢市中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。。
[0052] 3. 2副豬嗜血桿菌生產(chǎn)用種子的制備：
[0053] -級(jí)種子的繁殖：將副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株的菌種分別接種于TSA 平板，與37°C培養(yǎng)24h作為一級(jí)種子。在2-8°C保存，保存期不超過(guò)5天。在培養(yǎng)基上傳代， 不超過(guò)5代。
[0054] 二級(jí)種子繁殖：分別挑取副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株菌落于5ml含NAD 的TSB試管中，于150-220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)16h。以上種子液分別以1%的接種量接種于 IOOml相應(yīng)培養(yǎng)基，于150-220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)12h，按《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)， 合格后作為二級(jí)種子，在2-8°C保存，不超過(guò)8h。
[0055] 3. 3副豬嗜血桿菌菌液的制備：采用生物發(fā)酵罐分別進(jìn)行副豬嗜血桿菌4型JS株 和5型ZJ株菌液的制備。將鑒定合格的二級(jí)種子液以1%的接種量接種于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 基，37°C，200rpm，通過(guò)不斷增大通氣量和流加補(bǔ)料的方式發(fā)酵培養(yǎng)16-24h，收獲菌液。并按 現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。
[0056] 3. 4活菌數(shù)測(cè)定：取樣進(jìn)行菌落平板計(jì)數(shù)，活菌數(shù)應(yīng)不低于IO9CFUAiI。
[0057] 3. 5滅活：純粹檢驗(yàn)合格的副豬嗜血桿菌4型和5型菌液，按菌液總量的 0.2% -0.5%加入甲醛溶液（v/v)，37°C滅活48h，其間不斷搖動(dòng)。然后取樣按現(xiàn)行《中國(guó)獸 藥典》附錄進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)
[0058] 3. 6濃縮：將滅活檢驗(yàn)合格的副豬嗜血桿菌菌液采用超濾濃縮技術(shù)進(jìn)行濃縮，濃 縮后抗原含量為l〇nCFU/ml。
[0059] 實(shí)施例2豬瘟、豬圓環(huán)和副豬嗜血桿菌三聯(lián)混合疫苗組合物的制備
[0060] 1副豬嗜血桿菌、豬圓環(huán)二聯(lián)滅活疫苗制備
[0061] I. 1防腐劑的配制
[0062] 1% (w/v)的硫柳萊水溶液：Ig硫柳萊溶解于IOOml純化水，121°C高壓滅菌30min 備用。
[0063] 1.2稀釋劑的配制
[0064] 無(wú)菌的PBS緩沖溶液：在900ml純化水內(nèi)溶解8g氯化鈉、0. 25g氯化鉀、3. 63g磷 酸氫二鈉、0. 24g磷酸二氫鉀，然后定容至1L，121°C高壓滅菌30min備用。
[0065] 1. 3疫苗佐劑處理
[0066] GelOl佐劑滅菌：將GelOl佐劑轉(zhuǎn)入可滅菌容器內(nèi)，121 °C高壓滅菌30min備用。
[0067] 1. 4 配苗
[0068] 通過(guò)無(wú)菌操作，將實(shí)施例1中制備的濃縮副豬嗜血桿菌抗原、豬圓環(huán)病毒2型 抗原、佐劑、防腐劑、稀釋劑等按照不同配比混合后，用乳化機(jī)低速攪拌30min。滅活疫苗 部分豬圓環(huán)病毒抗原含量為1〇 4_°?IO6 tlTCID5ci/頭份，副豬嗜血桿菌抗原含量為107_°? 2X IOici tlCFU/頭份，GelOl佐劑，基于所述滅活苗部分含量為12% (V/V)
[0069] 2豬瘟疫苗的制備
[0070] 將檢驗(yàn)合格的豬瘟各收次病毒液，混合于同一容器，分別取適量混勻的病毒液進(jìn) 行稀釋，加入適當(dāng)凍干保護(hù)劑（2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以I: I (v/v)比例配制） 以l:l(v/v)比例混合后充分混勻，定量分裝，迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。
[0071] 3三聯(lián)苗的制備
[0072] 將實(shí)施例1中所制備的濃縮抗原按照表1的配比進(jìn)行疫苗配制。使用前取滅活苗 部分稀釋活苗部分。
[0073] 表1疫苗配比具體實(shí)施案例
[0074]
【權(quán)利要求】
1. 一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物含有免疫量的豬瘟病毒抗原、免疫量的副豬 嗜血桿菌抗原、免疫量的豬圓環(huán)病毒2型抗原以及獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬瘟病毒抗原為全病毒抗原、所述副 豬嗜血桿菌為全菌抗原、所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為全病毒抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述豬瘟病毒抗原為活的形式的全病毒 抗原、所述副豬嗜血桿菌為滅活形式的全菌抗原、所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活形式的 全病毒抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其中，所述滅活形式的副豬嗜血桿菌全菌抗原 為副豬嗜血桿菌4型JS株全菌滅活抗原和5型ZJ株全菌滅活抗原；所述活的形式的豬瘟 病毒全病毒抗原為豬瘟兔化弱毒株抗原；所述滅活形式的豬圓環(huán)病毒2型全病毒抗原為豬 圓環(huán)病毒2型SH株全病毒滅活抗原。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述副豬嗜血桿菌抗原含量為108? 101(ICFU/頭份；所述豬圓環(huán)病毒2型抗原含量為10 5_°?106_°TCID5(I/頭份；所述豬瘟病毒抗 原含量為1〇 5_°?l〇6_°TCID5Q/頭份。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其中，所述副豬嗜血桿菌抗原含量為109CFU/ 頭份；所述豬圓環(huán)病毒2型抗原含量為10 6_°TCID5(i/頭份；所述豬瘟病毒抗原含量為 106 °TCID5Q/頭份。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體包括凍干保 護(hù)劑和佐劑；所述凍干保護(hù)劑凍干保護(hù)劑為按1:1比例的2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水 溶液，所述佐劑為獸醫(yī)學(xué)上可接受的礦物油佐劑、鋁鹽佐劑、水佐劑或細(xì)胞因子佐劑。
8. -種制備權(quán)利要求1所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括： 1) 培養(yǎng)增殖所述副豬嗜血桿菌，滅活并濃縮； 培養(yǎng)增殖所述豬圓環(huán)病毒2型病毒，滅活并濃縮； 將所述副豬嗜血桿菌抗原、所述豬圓環(huán)病毒2型抗原按比例混合，添加獸醫(yī)學(xué)上可接 受的佐劑制備成滅活疫苗； 2) 培養(yǎng)增殖所述豬瘟病毒；加入凍干保護(hù)劑混勻，冷凍干燥，制成活疫苗部分。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?7任一項(xiàng)所述的疫苗組合物在用于制備預(yù)防和治療豬瘟病毒、副 豬嗜血桿菌和豬圓環(huán)病毒2型的感染的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104288762SQ201310307439
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 田克恭 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司