交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法

交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明交聯(lián)透明質(zhì)酸支架材料由一組高分子透明質(zhì)酸鹽和一組低分子透明質(zhì)酸鹽經(jīng)交聯(lián)獲得，參與交聯(lián)的透明質(zhì)酸雙糖分子比例為0.5％～20％，在等滲溶液中的膨脹率80％～110％。本發(fā)明細(xì)胞支架材料的制備方法包括兩次冷凍干燥步驟，第一次將混合了交聯(lián)劑的透明質(zhì)酸鹽成型，加熱反應(yīng)后，加水溶脹為凝膠，再次冷凍干燥獲得多孔支架材料。該支架具有豐富的孔隙、一定的機(jī)械強(qiáng)度和孔徑大小、良好的吸水性和生物相容性，可作為組織工程細(xì)胞支架用于促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)，也可用作制備止血、防粘連的材料。
【專利說(shuō)明】交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料以及它的制備方法和 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸（hyalouronic acid,簡(jiǎn)稱 HA)是由（l-β-4)D_ 葡糖醒酸和（l-β-3) N-乙?；?D-氨基葡糖雙糖單位重復(fù)連接組成的一種鏈狀聚陰離子黏多糖，是構(gòu)成皮膚、 玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的重要成分，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。目前商品透 明質(zhì)酸產(chǎn)品以其鈉鹽為主，來(lái)源于動(dòng)物組織或微生物發(fā)酵，廣泛應(yīng)用于食品、日化和醫(yī)藥領(lǐng) 域，由于純度的不同，具有食品級(jí)、醫(yī)用級(jí)和化妝品級(jí)等多種級(jí)別產(chǎn)品。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究開(kāi) 發(fā)，高純度的醫(yī)用級(jí)透明質(zhì)酸鈉已被制成注射劑，應(yīng)用于眼科手術(shù)、骨科手術(shù)、治療骨關(guān)節(jié) 炎及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和預(yù)防術(shù)后粘連。
[0003] 關(guān)節(jié)軟骨組織代謝活性低，損傷難以自身修復(fù)，最終可引起關(guān)節(jié)表面的退變。通過(guò) 關(guān)節(jié)軟骨成型術(shù)、微骨折、自體軟骨移植等外科手術(shù)方法可暫時(shí)改善病人的臨床癥狀，但由 于存在供體來(lái)源不足、免疫排斥、生成軟骨不佳、遠(yuǎn)期效果不好等問(wèn)題，遠(yuǎn)不能滿足臨床應(yīng) 用的需要。利用組織工程方法修復(fù)軟骨缺損，具有需要供體組織少、可根據(jù)要求塑形等優(yōu) 點(diǎn)，有望成為一種新的治療模式。
[0004] 組織工程研究包括種子細(xì)胞、細(xì)胞支架和包括細(xì)胞生長(zhǎng)因子往內(nèi)的周圍環(huán)境三個(gè) 方面，其中細(xì)胞支架材料選擇的成功與否是成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因而使其成為研究的熱點(diǎn)。理 想的軟骨組織工程支架材料應(yīng)具備良好的生物相容性、適宜的生物降解性、利于種子細(xì)胞 的黏附和增殖、孔徑和孔隙率適宜的三維多孔結(jié)構(gòu)以及具有一定機(jī)械強(qiáng)度、易于塑形和固 定于缺損部位等條件[何森，等.國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2007, 30 (4) :247-251]。
[0005] HA是軟骨基質(zhì)組成成分之一，作為軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的基質(zhì)，能促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝，并 維持軟骨細(xì)胞表型、促進(jìn)軟骨基質(zhì)分泌，是構(gòu)建復(fù)合軟骨細(xì)胞支架的首選材料。但天然的 HA具有良好的水溶性，容易分散、被肌體組織中存在的酶及自由基降解，局部存留的時(shí)間較 短，不能維持支架材料所必須的機(jī)械性能。
[0006] 有眾多的研究公開(kāi)了采用HA與其他生物材料或合成材料復(fù)合制備用于骨 或軟骨再生的組織工程細(xì)胞支架，如膠原-生物玻璃-透明質(zhì)酸復(fù)合組織工程支架 (CN101601869)、透明質(zhì)酸改性聚己內(nèi)酯-聚乳酸三維多孔復(fù)合支架（CN101352582)、以及 膠原-透明質(zhì)酸、膠原-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素、聚乙烯醇-透明質(zhì)酸-膠原和膠原-透 明質(zhì)酸-殼聚糖的復(fù)合三維支架[Yan J，et al.Biotechnol，2006,34(l) :27-39;李沁華， 等.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009, 30 (3) :319-325;張其清，等.中國(guó)修復(fù)重建外科 雜志，2006, 20 (2) :130-133;黃長(zhǎng)斌，等.中外醫(yī)療，2009, 27:8-9]。雖然其他材料與透明 質(zhì)酸復(fù)合后在一定程度加強(qiáng)了支架的機(jī)械性能，但也帶來(lái)了一些問(wèn)題，如來(lái)源于動(dòng)物的膠 原材料有致敏性，合成材料的加入可影響支架的生物相容性，聚乳酸類材料的降解產(chǎn)物偏 酸性可導(dǎo)致局部的炎癥反應(yīng)等。
[0007] 經(jīng)修飾或交聯(lián)的HA克服了天然HA易分散、易降解的缺陷。酯化修飾的HA適用于 制備組織工程支架，Aigner等合成了透明質(zhì)酸節(jié)基酯，作為培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的支架[Aigner J，et al. J Biomed Mater Res，1998,42(2) :172-181]。Fidia 公司開(kāi)發(fā)的 HA 酯化產(chǎn)品 Hyalograft-C通過(guò)軟骨組織工程重建了兔喉氣管[Weidenbecher M，et al. Laryngoscope， 2007,117(10) :1745-1749],目前該產(chǎn)品已經(jīng)應(yīng)用于臨床修復(fù)軟骨缺損。
[0008] 交聯(lián)使鏈狀的HA形成整體大分子的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)交聯(lián)程度可獲得適宜降解速 度和適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的孔隙，也是一種較理想的組織工程細(xì)胞支架材料。
[0009] 交聯(lián)的HA保留了 HA良好的生物相容性和非免疫原性，其降解產(chǎn)物為小分子HA，無(wú) 毒、不致炎，與內(nèi)源性HA代謝途徑一致。目前，以二乙烯基砜和1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚 為交聯(lián)劑的兩類交聯(lián)HA產(chǎn)品已往臨床廣泛用于骨科關(guān)節(jié)炎治療、手術(shù)防粘連、軟組織修復(fù) 和美容整形填充，在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用還處于研究階段。
[0010] 有報(bào)道公開(kāi)了采用Genzym公司的二乙烯基砜交聯(lián)HA產(chǎn)品Hylan可作為動(dòng)脈平 滑肌細(xì)胞的支架用于重建大鼠主動(dòng)脈的心臟瓣膜，將分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞加入Q-med公 司的1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚（BDDE)交聯(lián)HA產(chǎn)品Restylane可用于修復(fù)軟組織缺損 [RamamurthiA, et al. Biomaterials,2005,26(9) :999-1010 ；Yoon E S, et al.Ann Plast Surg,2003,51 (6) :587-592.]。
[0011] 作為細(xì)胞支架的交聯(lián)HA材料一般制備成三維多孔的膜片，CN102805880公開(kāi)了將 透明質(zhì)酸鹽溶液和1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚混合后平鋪干燥得到干燥膜片，然后再用水 和PBS透析的一種組織工程支架材料的制備方法，該支架材料在使用時(shí)將它破碎為一定大 小的凝膠顆粒，然后與非交聯(lián)透明質(zhì)酸溶液混合，再與細(xì)胞混合獲得細(xì)胞-支架復(fù)合物。采 用冷凍干燥技術(shù)可以獲得交聯(lián)HA的多孔海綿狀材料，專利KR20000025222、JP11322807和 CN102558600公開(kāi)了 HA與交聯(lián)劑混合反應(yīng)后經(jīng)過(guò)冷凍干燥制備用于止血、防粘連或牙科的 多孔材料。
[0012] 目前，采用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉制備軟骨組織工程細(xì)胞支架鮮有研究報(bào)道。除了應(yīng)具 有一定的機(jī)械強(qiáng)度之外，多孔材料的孔隙率、孔徑大小和降解速度直接影響接種細(xì)胞的生 長(zhǎng)和細(xì)胞-支架復(fù)合物的形成，較大的孔隙率使細(xì)胞可以在支架材料中均勻分布，適宜的 孔徑和降解速度可保證細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)交換和細(xì)胞外基質(zhì)的形成和累積；此外，易于塑形和固 定于缺損部位也是軟骨組織工程細(xì)胞支架必備的條件。為了制備適用于軟骨組織修復(fù)用的 細(xì)胞支架材料，本發(fā)明選取不同分子量的透明質(zhì)酸進(jìn)行適度的交聯(lián)，采用冷凍干燥技術(shù)制 備得到了具有一定機(jī)械強(qiáng)度，易于固定和塑形，孔隙率較高，孔徑大小和降解速度適宜的多 孔細(xì)胞支架，通過(guò)試驗(yàn)證明，本發(fā)明細(xì)胞支架適于軟骨細(xì)胞的附著、生長(zhǎng)和表型維持，可用 于修復(fù)軟骨缺失；同時(shí)，本發(fā)明細(xì)胞支架具有良好的生物相容性，具有高吸水率、黏附力強(qiáng)， 用于止血的效果好于現(xiàn)有產(chǎn)品；本品能迅速吸收傷口滲出液，往體內(nèi)局部存留時(shí)間可達(dá)一 周，用于手術(shù)防粘連的效果好于現(xiàn)有產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是提供一種交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料及其制備方法，以及使用該 方法制備得到的細(xì)胞支架材料在軟骨組織缺損修復(fù)和止血、防粘連等醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，具有如下特征：
[0015] (1)由一組高分子透明質(zhì)酸鹽和一組低分子透明質(zhì)酸鹽經(jīng)交聯(lián)獲得。
[0016] 本發(fā)明細(xì)胞支架采用的原料透明質(zhì)酸鹽可以是透明質(zhì)酸的金屬鹽，如透明質(zhì)酸 鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅、透明質(zhì)酸鉍，也可以是透明質(zhì)酸的 有機(jī)鹽，如透明質(zhì)酸銨和透明質(zhì)酸四丁基銨，可以是上述這些鹽的一種，如透明質(zhì)酸鈉，或 者透明質(zhì)酸鉀，也可以任意兩種或兩種以上的混合物，例如透明質(zhì)酸鈉和透明質(zhì)酸鉀兩種 鹽的混合物，或者透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸銨和透明質(zhì)酸四丁基銨三種鹽的混合物。優(yōu)選采用 目前商品化最廣泛的一種透明質(zhì)酸鹽，即透明質(zhì)酸鈉。
[0017] 本發(fā)明細(xì)胞支架所采用的原料包括兩組平均分子量不同的透明質(zhì)酸鹽。一組為 高分子透明質(zhì)酸鹽，其平均分子量范圍在800?2500kDa，優(yōu)選1000?1800kDa，更優(yōu)選 1200?1500kDa ;另一組為低分子透明質(zhì)酸鹽，其平均分子量范圍在100?750kDa，優(yōu)選 150 ?500kDa，更優(yōu)選 200 ?400kDa。
[0018] 本發(fā)明細(xì)胞支架所采用的這兩組平均分子量不同的透明質(zhì)酸鹽以重量計(jì)算（w/ w)，比例如下：高分子透明質(zhì)酸鹽和低分子透明質(zhì)酸鹽的比例在1 : 9?9 : 1的范圍之 內(nèi)，優(yōu)選比例在1 : 4?4 : 1的范圍之內(nèi)，更優(yōu)選比例為2 : 3?3 : 2的范圍之內(nèi)。
[0019] 本發(fā)明細(xì)胞支架是采用上述兩組透明質(zhì)酸鹽經(jīng)化學(xué)交聯(lián)獲得的，交聯(lián)劑選自具有 雙功能基團(tuán)的化合物，可以是乙二醇二縮水甘油醚、1，4- 丁二醇二縮水甘油醚、新戊二醇二 縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚或聚二甲基硅氧烷二縮水甘 油醚等環(huán)氧醚化合物中的一種，也可以是二乙烯基砜。優(yōu)選其中的1，4_ 丁二醇二縮水甘油 醚或聚乙二醇二縮水甘油醚，更優(yōu)選1，4- 丁二醇二縮水甘油醚。
[0020] (2)支架材料中交聯(lián)的透明質(zhì)酸雙糖比例0· 5%?20% (mol/mol)。
[0021] 本發(fā)明細(xì)胞支架材料中參與交聯(lián)的透明質(zhì)酸雙糖的比例，指被交聯(lián)劑連接的透明 質(zhì)酸雙糖占支架中所有透明質(zhì)酸雙糖的百分?jǐn)?shù)，可以通過(guò)兩種方法來(lái)計(jì)算。在交聯(lián)劑投入 量微小、發(fā)生完全反應(yīng)的情況下，該比例可以通過(guò)投入的交聯(lián)劑和透明質(zhì)酸雙糖的摩爾比 來(lái)計(jì)算；在交聯(lián)劑投入量相對(duì)較大、沒(méi)有發(fā)生完全反應(yīng)的情況下，即投入的交聯(lián)劑有部分未 連接到透明質(zhì)酸大分子，而在隨后的純化過(guò)程中被除去，該比例的計(jì)算可以通過(guò)測(cè)定支架 材料中交聯(lián)劑殘基和透明質(zhì)酸雙糖殘基的摩爾比來(lái)計(jì)算。
[0022] 本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑的投入量，可以獲得不同交聯(lián)程度的支架材料，支架材料 中交聯(lián)的透明質(zhì)酸雙糖比例可以在0.5%?20% (mol/mol)范圍之內(nèi)。用作軟骨修復(fù)組織 工程細(xì)胞支架材料，該比例范圍可以在1%?20%，其中比例范圍在5%?10%更為合適。 用作止血和防粘連材料，該比例范圍可以在0.5%?15%，其中比例范圍在0.5%?5%更 為合適。
[0023] (3)在等滲的水溶液中的膨脹率80%?110%。
[0024] 本發(fā)明細(xì)胞支架材料的膨脹率可以通過(guò)膨脹后與膨脹前材料的體積之比來(lái)計(jì)算， 范圍在80%?110%之間。所述等滲的水溶液可以是滲透壓為250?350m0smol/kg的氯 化鈉溶液、緩沖溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液，例如〇. 9%的氯化鈉溶液（生理鹽水），含有0. 3mmol/L 磷酸二氫鈉、I. 6mmol/L磷酸氫二鈉、146. 5mmol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液（PBS)，含有牛 血清的DMEM培養(yǎng)液。
[0025] 本發(fā)明交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，其特征還在于含有糖胺聚糖和/或生理活性 物質(zhì)。
[0026] 所述的糖胺聚糖選自透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、殼聚糖、肝素和它們的 鹽中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉、硫酸軟骨素 A鈉和殼聚糖， 更優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。
[0027] 所述的生理活性物質(zhì)選自促進(jìn)血液凝固的藥物、抗菌藥物和成軟骨誘導(dǎo)因子中的 一種、任意兩種或兩種以上的混合物。其中，所述的促進(jìn)血液凝固的藥物選自凝血酶、纖維 蛋白原、6_氨基己酸、氨甲苯酸、氨甲環(huán)酸、抑肽酶、二乙酰氨乙酸乙二胺、卡巴克洛、卡絡(luò) 磺鈉和三七氨酸中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物；所述的抗菌藥物選自青霉素、 鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、兩性霉素、桿囷膚、制霉囷素、四環(huán)素、紅霉素中的一 種、任意兩種或兩種以上的混合物；所述的成軟骨誘導(dǎo)因子選自轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF)、胰島 素樣生長(zhǎng)因子（IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)、軟骨源性發(fā)生蛋白（CDMP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子（VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF)和地塞米松中的一種、任意兩種或兩種以上的混合 物。
[0028] 本發(fā)明交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料的制備方法，按如下步驟操作：
[0029] a)將高分子透明質(zhì)酸鹽和低分子透明質(zhì)酸鹽混合溶解于堿性水溶液；
[0030] b)向a)溶液加入交聯(lián)劑，混合均勻；
[0031] c)將b)溶液倒入模具，冷凍干燥；
[0032] d)將c)干燥物置于25?55°C保溫0. 5?24小時(shí)；
[0033] e)將d)干燥物浸泡于水中，使溶脹為凝膠；
[0034] f)將e)凝膠冷凍干燥；
[0035] 在步驟a)中，所述的透明質(zhì)酸鹽可以是透明質(zhì)酸的金屬鹽，如透明質(zhì)酸鈉、透明 質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅、透明質(zhì)酸鉍，也可以是透明質(zhì)酸的有機(jī)鹽， 如透明質(zhì)酸銨和透明質(zhì)酸四丁基銨，可以是上述這些鹽的一種，如透明質(zhì)酸鈉，或者透明質(zhì) 酸鉀，也可以任意兩種或兩種以上的混合物，例如透明質(zhì)酸鈉和透明質(zhì)酸鉀兩種鹽的混合 物，或者透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸銨和透明質(zhì)酸四丁基銨三種鹽的混合物。優(yōu)選采用目前商品 化最廣泛的一種透明質(zhì)酸鹽，即透明質(zhì)酸鈉。
[0036] 在步驟a)中，所述的高分子透明質(zhì)酸鹽，其平均分子量范圍在800?2500kDa，優(yōu) 選 1000 ?1800kDa，更優(yōu)選 1200 ?1500kDa。
[0037] 在步驟a)中，所述的低分子透明質(zhì)酸鹽，其平均分子量范圍在100?750kDa，優(yōu)選 150 ?500kDa，更優(yōu)選 200 ?400kDa。
[0038] 在步驟a)中，所述的透明質(zhì)酸鹽在堿性水溶液中的濃度，是指包括兩組透明質(zhì)酸 鹽（高分子透明質(zhì)酸鹽和低分子透明質(zhì)酸鹽）在內(nèi)的、所有透明質(zhì)酸鹽的總和在堿性溶液 中的濃度范圍為1%?1〇%(?八），優(yōu)選2%?7 (%(￥八），更優(yōu)選4(%?6(%(￥八）。
[0039] 在步驟a)中，所述的堿性水溶液選自氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、碳酸鈉溶液 和碳酸氫鈉溶液中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物，優(yōu)選氫氧化鈉溶液和碳酸鈉溶 液中的一種或它們的混合物，更優(yōu)選氫氧化鈉溶液。例如，〇. 1%的氫氧化鈉溶液，〇. 2%的 氫氧化鉀溶液，〇. 25%的碳酸鈉溶液，0. 03mol/L、pH10的氫氧化鈉-碳酸鈉緩沖溶液，或者 0. 05mol/L、pH9. 6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。
[0040] 在步驟a)中，所述的高分子透明質(zhì)酸鹽和低分子透明質(zhì)酸鹽的比例在1 : 9? 9 : 1的范圍之內(nèi)，優(yōu)選比例在1 : 4?4 : 1的范圍之內(nèi)，更優(yōu)選比例為2 : 3?3 : 2 的范圍之內(nèi)。
[0041] 在步驟b)中，所述的交聯(lián)劑可以是乙二醇二縮水甘油醚、1，4-丁二醇二縮水甘油 醚、新戊二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚、聚二甲基硅 氧烷二縮水甘油醚或二乙烯基砜中的一種，優(yōu)選1，4- 丁二醇二縮水甘油醚或聚乙二醇二 縮水甘油醚，更優(yōu)選1，4- 丁二醇二縮水甘油醚。
[0042] 在步驟c)中，所述的冷凍干燥包括在0?_80°C預(yù)凍0. 5?24小時(shí)的步驟，優(yōu)選 在-5°C?_60°C預(yù)凍1?12小時(shí)，更優(yōu)選在-10?-40°C預(yù)凍2?4小時(shí)。所述預(yù)凍，是指 在真空干燥之前，透明質(zhì)酸鹽和交聯(lián)劑的混和溶液在0?_80°C環(huán)境下冷凍，可以是在一個(gè) 特定溫度冷凍一定時(shí)間，也可以是變化溫度條件分段冷凍，例如，在_45°C預(yù)凍4小時(shí)，或者 在-80°C冷凍30分鐘、然后-40°C冷凍2小時(shí)。
[0043] 在步驟d)中，將完成c)冷凍干燥步驟之后獲得的干燥物放置在特定溫度環(huán)境保 溫，使發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，所述的保溫溫度范圍在25?55°C，優(yōu)選35?45°C ;所述的保溫時(shí)間 范圍在0. 5?24小時(shí)，優(yōu)選2?12小時(shí)，更優(yōu)選4?8小時(shí)。例如，在25°C保溫24小時(shí)， 或者在50°C保溫40分鐘；也可以是先于40°C保溫3小時(shí)，然后再于25°C保溫10小時(shí)。
[0044] 在步驟e)中，將完成d)保溫步驟的干燥物浸泡于水中，使其吸水溶脹成為凝膠， 所述的水可以采用去離子水、蒸餾水、純化水或者注射用水，優(yōu)選采用注射用水。
[0045] 在步驟e)中，所述的水的溫度，即浸泡干燥物使使其吸水溶脹成為凝膠的過(guò)程控 制溫度在40?90°C，優(yōu)選50?80°C，更優(yōu)選60?75°C。
[0046] 在步驟e)中，所述浸泡的時(shí)間為2?48小時(shí)，優(yōu)選4?24小時(shí)，更優(yōu)選6?12 小時(shí)。
[0047] 在步驟f)中，所述的冷凍干燥包括在0?_80°C預(yù)凍0. 5?24小時(shí)的步驟，優(yōu)選 在-5?-60°C預(yù)凍1?12小時(shí)，更優(yōu)選在-10?-40°C預(yù)凍2?4小時(shí)。所述預(yù)凍，是指 在真空干燥之前，透明質(zhì)酸鹽和交聯(lián)劑的混和溶液在0?_80°C環(huán)境下冷凍，可以是在一個(gè) 特定溫度冷凍一定時(shí)間，也可以是變化溫度條件分段冷凍，例如，在_35°C預(yù)凍2小時(shí)，或者 在-70°C冷凍45分鐘、然后在-5°C冷凍1小時(shí)，最后在_35°C冷凍2小時(shí)。
[0048] 本發(fā)明交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料的制備方法，其特征還在于可以在f)步驟之 前加入糖胺聚糖和/或生理活性物質(zhì)。即在第二次冷凍干燥之前，將所需的糖胺聚糖和/ 或生理活性物質(zhì)加入到凝膠中。加入的方法可以是將凝膠浸泡于含有糖胺聚糖和/或生理 活性物質(zhì)的溶液中，也可以是將凝膠干燥后再加入含有糖胺聚糖和/或生理活性物質(zhì)的溶 液。
[0049] 所述的糖胺聚糖選自透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、殼聚糖、肝素和它們的 鹽中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉、硫酸軟骨素 A鈉和殼聚糖， 更優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。
[0050] 所述的生理活性物質(zhì)選自促進(jìn)血液凝固的藥物、抗菌藥物和成軟骨誘導(dǎo)因子中的 一種、任意兩種或兩種以上的混合物。其中，所述的促進(jìn)血液凝固的藥物選自凝血酶、纖維 蛋白原、6-氨基己酸、氨甲苯酸、氨甲環(huán)酸、抑肽酶、二乙酰氨乙酸乙二胺、卡巴克洛、卡絡(luò) 磺鈉和三七氨酸中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物；所述的抗菌藥物選自青霉素、 鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、兩性霉素、桿囷膚、制霉囷素、四環(huán)素、紅霉素中的一 種、任意兩種或兩種以上的混合物；所述的成軟骨誘導(dǎo)因子選自轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF)、胰島 素樣生長(zhǎng)因子（IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)、軟骨源性發(fā)生蛋白（CDMP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子（VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF)和地塞米松中的一種、任意兩種或兩種以上的混合 物。
[0051] 采用本發(fā)明所公開(kāi)的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，以及采用本發(fā)明制備方法獲得 的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，可以用于制備軟骨組織工程細(xì)胞載體用途的醫(yī)療產(chǎn)品。例 如，制備成軟骨細(xì)胞支架，用作人或動(dòng)物的軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)的載體，也可以用作人或動(dòng) 物的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化的載體。
[0052] 采用本發(fā)明所公開(kāi)的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，以及采用本發(fā)明制備方法獲得 的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，可以用于制備治療關(guān)節(jié)軟骨損傷用途的醫(yī)療產(chǎn)品。例如，可 以制備成軟骨組織替代物，覆蓋在人或動(dòng)物的軟骨損傷部位，起到臨時(shí)的保護(hù)作用，在微骨 折技術(shù)治療軟骨損傷的手術(shù)中，可以覆蓋于手術(shù)穿刺部位，吸收骨髓細(xì)胞，同時(shí)作為細(xì)胞支 架將這些細(xì)胞固定在損傷位置，促進(jìn)軟骨組織的再生；也可以制備成細(xì)胞-支架復(fù)合物，將 人或動(dòng)物的軟骨細(xì)胞或者干細(xì)胞接種在支架材料上，形成細(xì)胞-支架復(fù)合物，在體外培養(yǎng) 一段時(shí)間或者直接移植到軟骨損傷部位，促進(jìn)軟骨組織的再生。
[0053] 采用本發(fā)明所公開(kāi)的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，以及采用本發(fā)明制備方法獲得 的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，可以用于制備止血用途的醫(yī)療產(chǎn)品。例如，可以制備成止血 膜，用于局部創(chuàng)傷、燒傷和手術(shù)創(chuàng)面的止血。
[0054] 采用本發(fā)明所公開(kāi)的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，以及采用本發(fā)明制備方法獲得 的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，可以用于制備手術(shù)防粘連用途的醫(yī)療產(chǎn)品。例如，可以制備 成防粘連膜，用于外科手術(shù)中，覆蓋在手術(shù)部位組織之間，起到隔離作用，預(yù)防粘連發(fā)生。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0055] 圖1光學(xué)顯微鏡下的支架表面結(jié)構(gòu)（15X 10,樣品：左上1-1，右上1-3,左下1-5， 右下1-7)
[0056] 圖2光學(xué)顯微鏡下的支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)（15X20,樣品1-3，左：亮視場(chǎng)，右：暗視場(chǎng)）
[0057] 圖3掃描電子顯微鏡下的支架結(jié)構(gòu)（樣品1-5，左：表面；右：內(nèi)部）
[0058] 圖4透明質(zhì)酸酶水解支架材料的1H-NMR圖譜（樣品2-6)
[0059] 圖5反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果（左：Balb/3T3細(xì)胞；右：軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合體）

【具體實(shí)施方式】
[0060] 以下實(shí)施例是為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，不是限制本發(fā)明。
[0061] 實(shí)施例1制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉細(xì)胞支架材料（第一組）
[0062] 按表1中的比例，分別取高分子透明質(zhì)酸鈉（SH，1350kDa)和低分子透明質(zhì)酸鈉 (500kDa)，加入適量0. 2 %的NaOH溶液，使透明質(zhì)酸鈉的濃度為5 %，攪拌溶解，加入適量1， 4_ 丁二醇二縮水甘油醚使其濃度為0. 2%，攪拌均勻，傾倒于底面光滑無(wú)滲透性的模具中， 按模具底面積的大小，傾倒量為〇. 2ml/cm2。將模具置于-70°C預(yù)凍1小時(shí)，然后放入冷凍 干燥機(jī)中，_20°C預(yù)凍2小時(shí)，再抽真空進(jìn)行干燥。干燥樣品置40°C保溫4小時(shí)，然后浸泡 于70°C注射用水中溶脹5小時(shí)。將溶脹的凝膠置冷凍干燥機(jī)中，-35°C預(yù)凍3小時(shí)，再抽真 空進(jìn)行干燥，即得。
[0063] 所得樣品按實(shí)施例7中描述的方法測(cè)定支架材料的厚度和孔徑。結(jié)果顯示，僅采 用高分子量透明質(zhì)酸鈉制備的支架樣品（1-7)孔徑比較均勻，但厚度不均勻，且平均孔徑 較小，作為細(xì)胞支架材料不利于營(yíng)養(yǎng)交換，影響種子細(xì)胞在支架內(nèi)的生長(zhǎng)和增殖；而僅采用 低分子量透明質(zhì)酸鈉制備的支架樣品（1-1)雖然厚度比較均勻、平均孔徑比較大，但孔徑 大小不均勻，存在少量孔徑500 μ m以上的大孔，支架容易碎裂。
[0064] 表1高分子和低分子透明質(zhì)酸鈉不同比例的支架厚度和孔徑（η = 10)

【權(quán)利要求】
1. 一種交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料，其特征在于： a) 由一組高分子透明質(zhì)酸鹽和一組低分子透明質(zhì)酸鹽經(jīng)交聯(lián)獲得； b) 支架材料中交聯(lián)的透明質(zhì)酸雙糖比例0. 5%?20% (mol/mol); c) 在等滲的水溶液中的膨脹率80%?110%。
2. 權(quán)利要求1所述細(xì)胞支架材料，其特征還在于含有糖胺聚糖和/或生理活性物質(zhì)。
3. -種交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料的制備方法，其特征在于： a) 將高分子透明質(zhì)酸鹽和低分子透明質(zhì)酸鹽混合溶解于堿性水溶液； b) 向a)溶液加入交聯(lián)劑，混合均勻； c) 將b)溶液倒入模具，冷凍干燥； d) 將c)干燥物置于25?55°C保溫0. 5?24小時(shí)； e) 將d)干燥物浸泡于水中，使溶脹為凝膠； f) 將e)凝膠冷凍干燥。
4. 權(quán)利要求1和3所述的透明質(zhì)酸鹽選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明 質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅、透明質(zhì)酸鉍、透明質(zhì)酸銨和透明質(zhì)酸四丁基銨中的一種、任意兩種或 兩種以上的混合物，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。
5. 權(quán)利要求1和3所述的高分子透明質(zhì)酸鹽平均分子量范圍在800?2500kDa，優(yōu)選 1000 ?1800kDa，更優(yōu)選 1200 ?1500kDa。
6. 權(quán)利要求1和3所述的低分子透明質(zhì)酸鹽平均分子量范圍在100?750kDa，優(yōu)選 150 ?500kDa，更優(yōu)選 200 ?400kDa。
7. 權(quán)利要求1和3所述高分子透明質(zhì)酸鹽和低分子透明質(zhì)酸鹽的比例為1 : 9? 9 : l(w/w)，優(yōu)選比例為1 : 4?4 : l(w/w)，更優(yōu)選比例為2 : 3?3 : 2(w/w)。
8. 權(quán)利要求3中a)所述透明質(zhì)酸鹽在堿性水溶液中的濃度為1 %?10% (w/v)，優(yōu)選 2 % ?7 % (w/v)，更優(yōu)選 4 % ?6 % (w/v)。
9. 權(quán)利要求3中a)所述堿性水溶液選自氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、碳酸鈉溶液和 碳酸氫鈉溶液中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物，優(yōu)選氫氧化鈉溶液和碳酸鈉溶液 中的一種或它們的混合物，更優(yōu)選氫氧化鈉溶液。
10. 權(quán)利要求3中b)所述交聯(lián)劑選自乙二醇二縮水甘油醚、1，4_ 丁二醇二縮水甘油 醚、新戊二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚、聚二甲基硅 氧烷二縮水甘油醚或二乙烯基砜，優(yōu)選1，4-丁二醇二縮水甘油醚或聚乙二醇二縮水甘油 醚，更優(yōu)選1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚。
11. 權(quán)利要求3中d)所述保溫時(shí)間為2?12小時(shí)，優(yōu)選4?8小時(shí)。
12. 權(quán)利要求3中d)所述保溫溫度為35?45 °C。
13. 權(quán)利要求3中e)所述的水選自去離子水、蒸餾水、純化水和注射用水，優(yōu)選注射用 水。
14. 權(quán)利要求3中e)所述的水的溫度為40?90°C，優(yōu)選50?80°C，更優(yōu)選60?75°C。
15. 權(quán)利要求3中e)所述浸泡的時(shí)間為2?48小時(shí)，優(yōu)選4?24小時(shí)，更優(yōu)選6? 12小時(shí)。
16. 權(quán)利要求3中c)和f)所述的冷凍干燥包括在0?-80°C預(yù)凍0. 5?24小時(shí)的步 驟，優(yōu)選在-5?_60°C預(yù)凍1?12小時(shí)，更優(yōu)選在-10?-40°C預(yù)凍2?4小時(shí)。
17. 權(quán)利要求3中在e)步驟之前加入糖胺聚糖和/或生理活性物質(zhì)。
18. 權(quán)利要求2和17所述糖胺聚糖選自透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、殼聚糖、肝 素和它們的鹽中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉、硫酸軟骨素 A鈉 和殼聚糖，更優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。
19. 權(quán)利要求2和17所述生理活性物質(zhì)選自促進(jìn)血液凝固的藥物、抗菌藥物和成軟骨 誘導(dǎo)因子中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物。
20. 權(quán)利要求19所述促進(jìn)血液凝固的藥物選自凝血酶、纖維蛋白原、6-氨基己酸、氨甲 苯酸、氨甲環(huán)酸、抑肽酶、二乙酰氨乙酸乙二胺、卡巴克洛、卡絡(luò)磺鈉和三七氨酸中的一種、 任意兩種或兩種以上的混合物。
21. 權(quán)利要求19所述抗菌藥物選自青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、兩性 霉素、桿菌肽、制霉菌素、四環(huán)素、紅霉素中的一種、任意兩種或兩種以上的混合物。
22. 權(quán)利要求19所述成軟骨誘導(dǎo)因子選自轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素樣生長(zhǎng)因子、骨形 態(tài)發(fā)生蛋白、軟骨源性發(fā)生蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子和地塞米松中的 一種、任意兩種或兩種以上的混合物。
23. 權(quán)利要求3?22所述制備方法獲得的交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料。
24. 權(quán)利要求1、2和23所述交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料用于制備軟骨組織工程細(xì)胞載 體用途的醫(yī)療產(chǎn)品。
25. 權(quán)利要求1、2和23所述交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料用于制備治療關(guān)節(jié)軟骨損傷用 途的醫(yī)療產(chǎn)品。
26. 權(quán)利要求1、2和23所述交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料用于制備止血用途的醫(yī)療產(chǎn) 品。
27. 權(quán)利要求1、2和23所述交聯(lián)透明質(zhì)酸細(xì)胞支架材料用于制備手術(shù)防粘連用途的醫(yī) 療產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】A61P41/00GK104225677SQ201310231903
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月13日
【發(fā)明者】凌沛學(xué), 陳建英, 陳倩倩, 劉少英, 王勤 申請(qǐng)人:山東省生物藥物研究院