香莢蘭乙酮及其代謝衍生物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抗心肌損傷、纖維化及心律失常的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于：采用異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌損傷的動物模型，對香莢蘭乙酮及其代謝衍生物干預(yù)心肌損傷的藥理作用及分子機制進行了研究，結(jié)果表明香莢蘭乙酮及其代謝衍生物對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷具有顯著的抑制作用，主要表現(xiàn)為抑制心肌細胞壞死，肉芽組織形成，炎細胞侵潤、纖維化形成等病理表型，以及心律失常及大劑量異丙腎上腺素誘發(fā)的猝死。全基因組基因表達分析在分子水平揭示并進一步證實了香莢蘭乙酮抗心肌損傷特別是纖維化形成的作用，特別是體現(xiàn)在香莢蘭乙酮對細胞外基質(zhì)包括膠原基因表達具有顯著的抑制作用。
【專利說明】香莢蘭乙酮及其代謝衍生物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物新用途領(lǐng)域，具體地說，是香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抗心肌損傷、纖維化及心律失常的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]心臟病(heart disease)是心臟疾病的總稱,包括風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病、高血壓性心臟病、冠心病、心肌炎等各種心臟病。
[0003]心肌纖維化是衰竭心臟的主要病理特征之一。多種病理生理機制均可導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生，包括心肌缺血損傷如心肌梗死等。心肌梗死的重要病理改變之一是大范圍缺血缺氧導(dǎo)致的不可逆的心肌細胞損傷，是導(dǎo)致心臟衰竭發(fā)生發(fā)展的重要原因。心肌纖維化是心肌缺血梗死后心室重建的重要決定因素之一，與收縮期功能阻滯，異常心臟重塑，心律失常等的發(fā)生有著密切的關(guān)系。臨床研究表明纖維化是不良心臟預(yù)后的獨立預(yù)測因子。因此有效干預(yù)心肌損傷纖維化至今仍是研究熱點。
[0004]異丙腎上腺素為β受體激動劑，臨床上用于支氣管哮喘、心臟驟停、房室傳導(dǎo)阻滯、休克等的治療。其重大不良反應(yīng)涉及心肌損傷、心律失常、猝死等。在實驗研究中，根據(jù)其心臟毒性，多用于心肌損傷動物模型的建立，廣泛用于心肌損傷的機制及藥理研究。
[0005]香英蘭乙麗(4-hydroxy-3methoxyacetophenone, apocynin, acetovanillone)又名羅布麻寧，加拿大麻素，夾竹桃麻素，乙酰香草酮，天然存在于夾竹桃科植物羅布麻的根，加拿大麻的根、莖、胡黃連等植物中。1883年德國藥學(xué)家Oswald Schmiedeberg從加拿大麻中提取獲得，1971年亦從胡黃連中提取。
[0006]中國專利文獻CN 1625422A公開了反式-二十四-15-碳烯酸和夾竹桃麻素的協(xié)同組合物及其應(yīng)用，涉及包含有效量的反式-二十四-15-碳烯酸(TCA)和夾竹桃麻素(APO)的協(xié)同肝保護藥物組合物，`本發(fā)明也涉及治療肝細胞毒性用途。但是關(guān)于香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抗心肌損傷及纖維化的藥物中的應(yīng)用目前還未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抗心肌損傷藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是，提供香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抑制心肌纖維化形成藥物中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第三個目的是，提供香莢蘭乙酮在制備拮抗心律失常的藥物中的應(yīng)用。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抗心肌損傷藥物中的應(yīng)用。
[0011]所述的香莢蘭乙酮及其代謝衍生物抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷。
[0012]所述的香莢蘭乙酮及其代謝衍生物抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細胞壞死，肉芽組織形成，炎細胞侵潤、心肌纖維化形成。[0013] 所述的香莢蘭乙酮代謝衍生物為香莢蘭乙酮雙體。
[0014]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抑制心肌纖維化形成的藥物中的應(yīng)用。
[0015]所述的香莢蘭乙酮及其代謝衍生物抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化形成。
[0016]所述的香莢蘭乙酮抑制細胞外基質(zhì)包括膠原基因表達。
[0017]所述的香莢蘭乙酮代謝衍生物為香莢蘭乙酮雙體。
[0018]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:香莢蘭乙酮在制備拮抗心律失常的藥物中的應(yīng)用。
[0019]所述的香莢蘭乙酮抑制大劑量異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心律失常的發(fā)生及猝死。
[0020]本發(fā)明優(yōu)點在于:
本發(fā)明采用異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌損傷的動物模型，對香莢蘭乙酮及其代謝衍生物干預(yù)心肌損傷的藥理作用及分子機制進行了研究，研究結(jié)果表明香莢蘭乙酮及其代謝衍生物對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷具有顯著的抑制作用，主要表現(xiàn)為抑制心肌細胞壞死，肉芽組織形成，炎細胞侵潤、纖維化形成等病理表型，以及心律失常及大劑量異丙腎上腺素誘發(fā)的猝死。全基因組基因表達分析在分子水平揭示并進一步證實了香莢蘭乙酮抗心肌損傷特別是纖維化形成的作用，特別是體現(xiàn)在香莢蘭乙酮對細胞外基質(zhì)包括膠原基因表達具有顯著的抑制作用。因此本發(fā)明為香莢蘭乙酮及其代謝衍生物抗心肌損傷及心肌纖維化的效應(yīng)提供了直接的實驗證據(jù)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1.異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌損傷模型:異丙腎上腺素溶于滅菌的緩沖磷酸鹽溶液(PBS)，按照5mg/kg體重的劑量進行腹腔內(nèi)注射，每次注射體積為100 μ L，每日一次，分別給藥一至五次。每次給藥后24小時處死小鼠，解剖心臟進行病理學(xué)觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素/伊紅染色后在光鏡下進行病理形態(tài)的觀察。圖1表明異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌缺血損傷，此外這一作用呈現(xiàn)劑量依賴性。接受5次異丙腎上腺素注射的小鼠心臟與1-4次注射的心臟相比心肌缺血損傷的程度最為嚴(yán)重，光鏡下可見大范圍的心肌壞死病灶，伴炎細胞侵潤，肉芽組織形成，因此確立以5次異丙腎上腺素注射為本研究心肌缺血模型的造模方法。
[0022]圖2.香莢蘭乙酮對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷的保護作用:香莢蘭乙酮按照以下劑量腹腔內(nèi)注射:12.5mg/kg體重、25mg/kg體重、50mg/kg體重、100mg/kg體重。30分鐘后，小鼠接受異丙腎上腺素注射，持續(xù)5天。正常對照組分別接受50 μ LDMSO及100 μ LPBS作為溶劑對照。最后一次注射24h后處死小鼠，采集心臟，進行石蠟包埋、切片及蘇木素/伊紅染色，光鏡下觀察心臟的病理形態(tài)改變。與正常對照組(a)相比較，異丙腎上腺素模型組小鼠左心室呈現(xiàn)廣泛的壞死，肉芽組織形成；而低劑量(12.5mg/kg)香莢蘭乙酮給藥的小鼠左心室表現(xiàn)為輕度的組織壞死(b);接受其他劑量(25mg/kg, 50mg/kg及100mg/kg)香莢蘭乙酮給藥的小鼠左心室未見明顯組織壞死(d-f)。
[0023]圖3.香莢蘭乙酮抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化形成:A.小鼠左心室切片進行Masson三色膠原染色，結(jié)果表明與正常對照組相比，異丙腎上腺素給藥組Masson三色陽性的區(qū)域顯著增加(切〈0.01)，與異丙腎上腺素組相比，香莢蘭乙酮治療劑量依賴性地顯著減少Masson三色陽性的區(qū)域(#/7〈0.01)。B.小鼠左心室Masson三色膠原染色代表性圖片:正常對照組(VC)，異丙腎上腺素組(ISO)及香莢蘭乙酮50mg/kg治療組(AP0)。
[0024]圖4.香莢蘭乙酮在分子水平抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化形成:免疫組織化學(xué)檢測表明纖維化形成相關(guān)的重要分子標(biāo)志物如a -SM, p-SMAD2, Timpl及Timp2在異丙腎上腺素組小鼠左心室心肌受損部位表達增強(a，c, e, g),未見這些分子標(biāo)志物在香莢蘭乙酮組小鼠左心室心肌組織的表達(b，d，f，h)。
[0025]圖5.香莢蘭乙酮顯著下調(diào)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷相關(guān)的基因表達:A.Agilent小鼠全基因組表達芯片的分析結(jié)果表明，與正常對照組相比，異丙腎上腺素組有942個基因呈現(xiàn)顯著的差異表達(/7〈0.05，差異倍數(shù)>2)，而香莢蘭乙酮可顯著改善其中438個基因的表達。B.—系列參與炎癥反應(yīng)，細胞外基質(zhì)形成及缺血損傷應(yīng)激的基因在異丙腎上腺素組表達顯著上調(diào)，而香莢蘭乙酮治療可顯著下調(diào)這些基因的表達。
[0026]圖6.香莢蘭乙酮抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的參與心肌纖維化形成細胞外基質(zhì)基因的表達:基于全基因組表達譜芯片的研究結(jié)果，進一步采用熒光實時定量PCR對參與心肌纖維化形成的細胞外基質(zhì)基因的表達進行了分析驗證，結(jié)果表明異丙腎上腺素給藥的小鼠心臟Timpl，Collal, Col3al, Col5al, Col5a2及Fibrillin與正常對照組相比較表達顯著上調(diào)，香莢蘭乙酮治療組與異丙腎上腺素組相比，這些基因的表達呈顯著的下調(diào)。
[0027]圖7.香莢蘭乙酮代謝衍生物-香莢蘭乙酮雙體(Diapocynin，DiAPO)對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷的保護作用:A.香莢蘭乙酮雙體化學(xué)結(jié)構(gòu)式。B.香莢蘭乙酮雙體按照50mg/kg體重劑量腹腔內(nèi)注射，30分鐘后，小鼠接受異丙腎上腺素注射，持續(xù)5天。正常對照組分別接受50 μ LDMSO及100 μ LPBS作為溶劑對照。最后一次注射24h后處死小鼠，采集心臟，進行石蠟包埋、切片及蘇木素/伊紅染色，光鏡下觀察心臟的病理形態(tài)改變。與正常對照組(a)相比較，異丙腎上腺素模型組小鼠左心室呈現(xiàn)心肌壞死改變，肉芽組織形成(b);香莢蘭乙酮雙體給藥的小鼠左心室未見明顯組織壞死(C)。
[0028]圖8.香莢蘭乙酮對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心律失常的作用:香莢蘭乙酮按照50mg/kg體重腹腔內(nèi)注射，30分鐘后，小鼠接受異丙腎上腺素腹腔內(nèi)注射一次，給藥劑量為100mg/kg體重。與異丙腎上腺素給藥前(a)比較，給予異丙腎上腺素后0.5h-lh時心電圖開始出現(xiàn)異常波動，其中早搏的發(fā)生頻率約為11.89%，(b, c)且持續(xù)出現(xiàn)或間斷出現(xiàn)房顫約10s-20s不等(d，e)。香莢蘭乙酮治療組偶見心電圖異常波動，包括房性期前收縮、室性期前收縮，但是出現(xiàn)的頻率約為1.7%，明顯少于異丙腎上腺素模型組，且未見房顫(f)。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0030]實施例1
在本實施方案中，我們通過病理形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)的研究手段，探討并明確了香莢蘭乙酮及其雙體衍生物對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷模型的干預(yù)效應(yīng)。研究結(jié)果表明香莢蘭乙酮或其雙體可有效地抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌細胞壞死變性，炎細胞侵潤，肉芽組織形成及纖維化形成并顯著抑制心肌纖維化形成過程中關(guān)鍵分子及基因的表達。這一研究首次揭示了香莢蘭乙酮及其衍生物對心肌損傷的治療干預(yù)作用及相關(guān)機制，提示香莢蘭乙酮相關(guān)的藥物 對于心肌損傷及損傷后纖維化形成及心律失常具有重要的治療干預(yù)價值。
[0031]一、方法
1.小鼠心肌損傷動物模型及干預(yù)
6-8周齡，體重20-25g的雄性清潔級C57BL/6J小鼠購自中國科學(xué)研究院，常規(guī)攝食及飲水喂養(yǎng)。采用異丙腎上腺素(Sigma，USA)腹腔內(nèi)注射建立心肌缺血模型。異丙腎上腺素溶解于無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)，每次給藥劑量為5mg/kg體重，給藥體積為100 μ L，每日于9:00am給藥一次，腹腔內(nèi)注射。異丙腎上腺素給藥為1_5次；香莢蘭乙酮(Sigma，USA)溶解于DMSO (Sigma，USA)，香莢蘭乙酮于異丙腎上腺素給藥前30分鐘給藥，每日一次腹腔內(nèi)注射。香莢蘭乙酮給藥劑量分別為:12.5mg/kg體重，25mg/kg體重，50mg/kg體重及100mg/kg體重，每次給藥體積為50 μ L0香莢蘭乙酮雙體于中國科學(xué)院藥物所合成正常對照組小鼠接受分別接受50 μ LDMSO及100 μ LPBS溶劑注射；異丙腎上腺素給藥小鼠接受50 μ LDMSO溶劑注射；香莢蘭乙酮及雙體治療小鼠接受100 μ LPBS溶劑注射。
[0032]2.小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)
每次給藥結(jié)束后24小時處死小鼠，采集心臟，固定于4%多聚甲醛后進行組織包埋及切片處理。組織形態(tài)學(xué)分析主要采用5 μ M厚度的石蠟切片進行蘇木素-伊紅染色，光鏡(Leica, Germany)下觀察心臟的組織形態(tài)學(xué)改變。膠原纖維染色采用Masson三色染色后光鏡下進行觀察。蘇木素-伊紅染色后對心臟病理改變進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下。I分:無心肌壞死，肉芽組織形成及炎細胞侵潤等心肌損傷的改變；2分:偶見散在、獨立的心肌壞死病灶；3分:心內(nèi)膜下層見30%或30%以下心肌損傷；4分:心內(nèi)膜下層30%-50%廣泛的心肌損傷；5分:50%以上的心內(nèi)膜下層心肌損傷。
[0033]3.小鼠心臟免疫組織化學(xué)檢測 各組石蠟切片(厚度5μΜ)或冰凍切片(厚度ΙΟμΜ)進一步進行免疫組織化學(xué)石開究，一抗包括 a -smooth muscle actin ( a SMA) (Sigma, USA), tissue inhibitorof metalloproteinase I (Timpl) (Protein Tech, China), tissue inhibitor ofmetalloproteinase 2 (Timp2) (Protein Tech, China), p-SMAD2 (Protein Tech,China)。二抗均購自Solarbio (China),包括山羊抗小鼠IgG用來檢測a SMA的表達，山羊抗兔IgG用來檢測Timpl、Timp2及p_SMAD2的水平。免疫反應(yīng)性最終采用3，3- 二氨基聯(lián)丙胺(DAB, Sigma, USA)顯色并于光鏡(Leica, Germany)下觀察記錄。
[0034]4.小鼠心臟活性氧自由基檢測
活性氧自由基探針二氫乙唳(dyhydroethidium, DHE, Invitrogen, USA)溶解于DMS0，每只小鼠按照10mg/kg體重的劑量于處死前3小時腹腔內(nèi)注射，注射體積為25 μ L。3小時后處死動物，解剖心臟，冰凍包埋及切片處理。10 μ m厚度的冰凍切片經(jīng)PBS清洗后，于突光顯微鏡(Leica, Germany)下觀察并記錄活性氧信號。
[0035]5.基因表達芯片分析:
各組小鼠心臟分離后進行組織總RNA的提取純化，各組用于基因表達芯片研究的樣品數(shù)分別為:溶劑對照組n=4 ;異丙腎上腺素組n=3;香莢蘭乙酮治療組n=5?；虮磉_芯片采用Agilent小鼠全基因組芯片。差異表達的基因定義為統(tǒng)計學(xué)顯著差異(/7〈0.05)，并且倍數(shù)差異2倍以上。
[0036]6.熒光實時定量PCR分析組織總RNA抽提純化(Qiagen, USA)后進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit, Termo, USA)0 cDNA 進一步米用 ABI Power SYBR Green PCR MasterMix 進行熒光實時定量 PCR 的分析(7900 HT Sequence Detection System, ABI, USA)。
[0037]7.統(tǒng)計學(xué)分析
實驗結(jié)果重復(fù)至少三次，數(shù)據(jù)表達為mean土S.E.M,數(shù)據(jù)分析采用student’s t_test。P<0.05定義為統(tǒng)計學(xué)顯著差異。
[0038]二、結(jié)果:
1.異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌損傷:
異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)為一種β受體激動劑，可誘導(dǎo)梗死樣心肌細胞死亡。ISO誘導(dǎo)的心肌損傷動物模型可模擬人心肌梗死過程中心臟形態(tài)及代謝的改變，在抗心肌損傷的藥物療效及機制研究中廣泛采用。本研究中采用C57/BL6J小鼠建立ISO誘導(dǎo)的心肌損傷模型。為確立一個穩(wěn)定的心肌損傷小鼠模型，首先對不同劑量ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷進行了評判。ISO按照5mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射，每日一次，給藥1-5天。如圖1所示，接受溶劑對照小鼠心肌組織形態(tài)正常，心肌纖維排列有序，未見壞死、變性及炎細胞侵潤等心肌損傷等病理改變(a)。ISO給藥一次未產(chǎn)生誘導(dǎo)心肌損傷的效應(yīng)(b)，2-5次給藥后，ISO產(chǎn)生誘導(dǎo)心肌損傷的效應(yīng)且這一效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性(c-f)，包括心肌細胞壞死樣變性，肉芽組織形成，炎細胞侵潤等。5次注射ISO誘導(dǎo)的心肌損傷最為嚴(yán)重。對心肌損傷程度進行評分的結(jié)果亦表明ISO呈劑量依賴性地誘導(dǎo)小鼠心肌損傷，基于這一結(jié)果，進一步的研究均采用5次注射ISO建立小鼠心肌損傷的模型。
[0039]2.香莢蘭乙酮可有效拮抗異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷:
本研究進一步采用香莢蘭乙酮(apocynin，ΑΡ0)對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷進行了干預(yù)。APO按照不同劑量于ISO注射前30min`腹腔內(nèi)注射給藥，每日一次，持續(xù)5日。第六天實驗結(jié)束，處死動物，分離小鼠心臟，進行組織病理學(xué)的研究。如圖2A所示，溶劑對照心肌組織形態(tài)正常(a)，ISO給藥誘導(dǎo)廣泛的心肌壞死，炎細胞侵潤及肉芽組織形成(b);而八?0干預(yù)可顯著減輕心肌損傷的程度，且這一效應(yīng)呈劑量依賴性(c:AP0 12.5mg/Kg體重；d:AP025mg/Kg體重；e:AP0 50mg/Kg體重；f: APO lOOmg/Kg體重)。進一步的研究表明APO抑制ISO誘導(dǎo)的心肌組織ROS的產(chǎn)生。如圖2B所示，與溶劑對照相比較(a)，大量的ROS生成見于ISO組心肌損傷部位(b)，而APO (50mg/Kg)干預(yù)的小鼠心臟則未見大量的ROS生成(c)。這些結(jié)果表明APO拮抗ISO誘導(dǎo)的心肌損傷的效應(yīng)可能與其抑制ROS產(chǎn)生相關(guān)。
[0040]3.香莢蘭乙酮抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化形成:
心肌纖維化定義為顯著增加的膠原體積。因此，進一步采用Masson’s三色染色對心肌組織切片中的膠原纖維進行了評估并定量。如圖3A所示，少量的Masson’s三色陽性的膠原纖維見于溶劑對照組的心肌空隙間(1.27%±0.13)，ISO組Masson’ s三色染色的膠原纖維含量顯著增加(29.5%土 1.55，而APO各劑量治療組Masson’s三色染色的膠原纖維含量顯著降低且這一效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性(ΑΡ0 12.5mg/Kg體重:IL 92%±0.85; APO 25mg/Kg體重:7.6%±0.34; APO 50mg/Kg 體重:2.35%±0.34; APO 100mg/Kg 體重:3.77%±0.45)。代表性Masson’s三色染色圖片見圖3B:溶劑對照心肌組織未見纖維化樣結(jié)締組織(a)，大量Masson’s三色染色陽性的纖維化樣結(jié)締組織可見于ISO組的小鼠左心室，特別是損傷部位(b),而這一現(xiàn)象未見于APO干預(yù)的小鼠左心室(C)。這些結(jié)果表明APO對ISO誘導(dǎo)的心肌纖維化形成具有顯著的抑制效應(yīng)。
[0041]4.香莢蘭乙酮抑制纖維化形成分子標(biāo)志物的表達:
為進一步明確APO抗心肌纖維化的效應(yīng)，本研究進一步分析了纖維化相關(guān)的關(guān)鍵分子標(biāo)志物在各組的表達。如圖4所示，在ISO誘導(dǎo)的心肌損傷模型中，a SMA在心肌損傷部位的表達顯著上調(diào)(a)，而這一現(xiàn)象未見于APO干預(yù)的小鼠心肌(b)，提示APO干預(yù)可顯著抑制損傷過程中肌成纖維細胞的激活，從而抑制纖維化形成。此外，其他纖維化形成的關(guān)鍵分子標(biāo)志物如反映介導(dǎo)纖維化形成的TGF β信號通路活性的p-SMAD2在ISO誘導(dǎo)的心肌損傷部位免疫反應(yīng)性顯著增強(c)，而其信號未見于APO干預(yù)的小鼠心肌(d)，這一結(jié)果表明APO可通過抑制纖維化形成的關(guān)鍵信號通路TGFii的活性而干預(yù)ISO誘導(dǎo)的心肌纖維化。進一步的分析表明，ISO誘導(dǎo)的纖維化形成過程中抑制膠原纖維降解的重要分子Timpl及Timp2的表達在心肌損傷部位顯著上調(diào)(e，g)，而這一異常亦可被APO所抑制(f，h)，表明APO對纖維化形成及纖維降解等重要分子環(huán)節(jié)均具有顯著的干預(yù)效應(yīng)。
[0042]5.香莢蘭乙酮對損傷心肌發(fā)揮保護作用的分子依據(jù):
為進一步在分子水平揭示APO抗心肌損傷的分子效應(yīng)及機制，本研究采用基因表達譜芯片技術(shù)對各組心臟全基因組基因表達水平進行了分析比較，如圖5A所示，與溶劑對照相比較，942個基因在ISO誘導(dǎo)條件下差異表達，而APO干預(yù)可顯著調(diào)控其中438個基因的表達，干預(yù)效應(yīng)為44.9%。進一步基因注釋表明心肌損傷反應(yīng)性基因，趨化因子配體，免疫細胞及炎細胞分子標(biāo)志物，膠原及非膠原類細胞外基質(zhì)基因的表達在ISO模型組顯著上調(diào)，而APO干預(yù)顯著抑制了這一系列基因的表達。如圖5B所示，ISO誘導(dǎo)顯著上調(diào)的基因包括損傷反應(yīng)基因Adam8;趨化因子配體Ccl3，Ccl4;膠原(Col)基因包括Cola, Col3, Col5、非膠原類細胞外基質(zhì)基因包括 fibronectin, fibrillin, tenascin 及膠原調(diào)控基因Timpl ;免疫細胞及炎癥反應(yīng)基因包括單核細胞/巨噬細胞表面標(biāo)志物及激活標(biāo)志物如 integrin a -ml (Itgam, Mac-1, CDllb), integrin α -χ (Itgax, CDllc),Schlafen (Slfn) 1，2，4，8，9等；而APO干預(yù)對這一系列介導(dǎo)組織損傷后炎性反應(yīng)及纖維化形成的基因的表達呈顯著的抑制。進一步對纖維化形成相關(guān)的重要基因基因進行了熒光實時定量PCR的驗證，驗證結(jié)果與表達譜芯片結(jié)果一致(圖6)。這些結(jié)果表明炎癥反應(yīng)基因及纖維化基因表達上調(diào)參與ISO誘導(dǎo)的心肌損傷，而APO對這些重要的損傷相關(guān)的基因表達具有顯著的抑制效應(yīng)，這亦是其抗心肌損傷中重要分子效應(yīng)及機制。
[0043]6.香莢蘭乙酮衍生物一香莢蘭乙酮雙體(Diapocynin，DiAPO)可有效拮抗異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷:
本發(fā)明進一步對香莢蘭乙酮雙體對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷的干預(yù)效應(yīng)進行了分析。DiAPO (圖7A)按照50mg/Kg體重的劑量于ISO注射前30min腹腔內(nèi)注射給藥，每日一次，持續(xù)5日。第六天實驗結(jié)束，處死動物，分離小鼠心臟，進行組織病理學(xué)的研究。如圖7B所示，溶劑對照心肌組織形態(tài)正常(a)，ISO給藥誘導(dǎo)典型的心肌壞死損傷，炎細胞侵潤及肉芽組織形成(b);而DiAPO干預(yù)可顯著抑制心肌損傷的發(fā)生。
[0044]7.香莢蘭乙酮可有效拮抗異丙腎上腺素誘發(fā)的猝死及心律失常:
表1香莢蘭乙酮對異丙腎上腺素導(dǎo)致的小鼠死亡的作用
【權(quán)利要求】
1.香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抗心肌損傷藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的香莢蘭乙酮及其代謝衍生物抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的香莢蘭乙酮及其代謝衍生物抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細胞壞死，肉芽組織形成，炎細胞侵潤、心肌纖維化形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的香莢蘭乙酮代謝衍生物為香莢蘭乙酮雙體。
5.香莢蘭乙酮及其代謝衍生物在制備抑制心肌纖維化形成的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的香莢蘭乙酮及其代謝衍生物抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的香莢蘭乙酮抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的細胞外基質(zhì)包括膠原基因表達。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的香莢蘭乙酮代謝衍生物為香莢蘭乙酮雙體。
9.香莢蘭乙酮在制備拮抗心律失常的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的香莢蘭乙酮抑制大劑量異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心律失常的發(fā)生及猝死。
【文檔編號】A61K31/12GK103550193SQ201310219508
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月5日
【發(fā)明者】張騰, 陳瑜, 賈成林, 熊敏琪, 劉麗, 崔金剛, 楊琴波, 王培偉, 李黎, 于心同, 杜霄燁 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院