太空誘變高效靈芝菌、其應(yīng)用及其膠囊制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株太空誘變高效靈芝菌、其應(yīng)用及其膠囊制劑的制備方法。對(duì)靈芝菌株進(jìn)行常規(guī)誘變，不僅效率低，且需要對(duì)大批量的原始菌株進(jìn)行誘變，變異幅度較小，很難大規(guī)模的提高發(fā)酵產(chǎn)物中目的產(chǎn)物靈芝多糖的產(chǎn)率。本發(fā)明提供了一株靈芝菌（Ganodermalucidum）S7-T7，可應(yīng)用于制備抗氧化、提高免疫力的藥物和保健品。本發(fā)明所述的靈芝菌株與常規(guī)育種方法得到的菌株相比，從基因上改變了菌株的遺傳特性，彌補(bǔ)了常規(guī)誘變所帶來(lái)的“表型延遲”和“遺傳分離現(xiàn)象”，迅速獲得高質(zhì)量的菌株并保證菌株的穩(wěn)定性，大規(guī)模的提高菌株的產(chǎn)率，不需要經(jīng)過(guò)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行大規(guī)模優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的途徑來(lái)提高產(chǎn)量。
【專利說(shuō)明】太空誘變高效靈芝菌、其應(yīng)用及其膠囊制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株太空誘變高效靈芝菌、其應(yīng)用及其膠囊制劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]靈芝，是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬的一種藥用真菌。中國(guó)古代把靈芝列為上品藥物，藥物專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載:靈芝有紫、赤、青、黃、白、黑六種，性味甘平。
[0003]現(xiàn)代藥理研究證明，靈芝具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤作用、保肝解毒作用、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和改善心肌微循環(huán)作用鎮(zhèn)靜作用、抗衰老作用、抗神經(jīng)衰弱作用等?；瘜W(xué)成分分析顯示，靈芝屬的子實(shí)體、菌絲體和孢子中含有多糖類、核苷類、呋喃類衍生物、留酵類、生物堿類、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類、三萜類、倍半萜、有機(jī)鍺、無(wú)機(jī)鹽等。
[0004]大量實(shí)驗(yàn)研究證明，靈芝的有效成分主要是多糖類物質(zhì)，靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，抗衰老，清除氧自由基，活血化瘀，抗凝血，降血糖及護(hù)肝的功效。靈芝多糖通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力間接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或者誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)，呈現(xiàn)一定的抗腫瘤作用。
[0005]提高靈芝菌株中的靈芝多糖含量一直是科研工作者的研究目標(biāo)，目前主要運(yùn)用反饋抑制理論構(gòu)建耐靈芝多糖反饋抑制的篩選模型和應(yīng)用常規(guī)誘變技術(shù)來(lái)提高靈芝菌株中靈芝多糖產(chǎn)量。利用耐靈芝多糖反饋抑制的篩選模型，篩選及優(yōu)化菌株發(fā)酵過(guò)程中所需條件，過(guò)程繁瑣，不能從根本上對(duì)菌株進(jìn)行改造，產(chǎn)率的提高有限。而對(duì)菌株進(jìn)行常規(guī)誘變，例如紫外或者微波誘變等，效率低，如想獲得高效率的靈芝菌株，需要對(duì)大批量的原始菌株進(jìn)行誘變，且該方法篩出的菌株的變異幅度較小，很難大規(guī)模的提高發(fā)酵產(chǎn)物中目的產(chǎn)物靈芝多糖的產(chǎn)率。此外常規(guī)誘變會(huì)發(fā)生“表型延遲”效應(yīng)，即當(dāng)代菌株并不表現(xiàn)出產(chǎn)量提高的優(yōu)點(diǎn)，不能及時(shí)對(duì)其進(jìn)行選育，易被丟棄，并且易發(fā)生“遺傳分離現(xiàn)象”，即突變株并不穩(wěn)定，不能長(zhǎng)久的用于大規(guī)模的靈芝菌株生產(chǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一株遺傳性更穩(wěn)定、生長(zhǎng)更快、靈芝多糖含量更高的太空誘變高效靈芝菌、其應(yīng)用及其膠囊制劑的制備方法。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7,于2011年5月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.4877，其特征在于:
其 18SrDNA 序列為 SEQ ID N0.2。
[0008]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/maS7-T7在制備藥物中的應(yīng)用。
[0009]所述的太空誘變高效靈芝菌iGanoderma Iucidum^l-rXl在制備保健品中的應(yīng)用。
[0010]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在制備藥物中的應(yīng)用,其特征在于:其在制備提高免疫力藥物中的應(yīng)用。
[0011]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在制備藥物中的應(yīng)用,其特征在于:
其在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
[0012]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于:
其在制備提聞免疫力保健品中的應(yīng)用。
[0013]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于:
其在制備抗氧化保健品中的應(yīng)用。
[0014]所述的太空誘變高效靈芝菌{Ganoderma Iucidum^l-Tl制備膠囊制劑的方法,其特征在于:
由以下步驟實(shí)現(xiàn):
步驟一:將靈芝菌株在發(fā)酵罐中培養(yǎng)7~8 d,發(fā)酵液4000 rpm離心15min,收集菌絲體,純化水洗滌菌絲體2次；
步驟二:洗滌后的菌絲體60°C烘干；` 步驟三:將干菌體粉碎后過(guò)80目篩，加入1.0%硬脂酸鎂、1.0%卡拉膠，混合均勻后按
0.5g/粒裝入膠囊,制成膠囊制劑。
[0015]步驟一中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 7H20
0.05%、VB1 0.005%、水余量。
[0016]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明所述的靈芝菌株與常規(guī)育種方法得到的菌株相比，從基因上改變了菌株的遺傳特性，彌補(bǔ)了常規(guī)誘變所帶來(lái)的“表型延遲”和“遺傳分離現(xiàn)象”，迅速獲得高質(zhì)量的菌株并保證菌株的穩(wěn)定性，大規(guī)模的提高菌株的產(chǎn)率，不需要經(jīng)過(guò)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行大規(guī)模優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的途徑來(lái)提高產(chǎn)量，而且所述菌株中靈芝多糖的含量大幅度提高，能夠用于進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，用于制備增強(qiáng)免疫力和抗氧化的藥物和保健品。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1示地面對(duì)照菌株高倍鏡觀察照片；
圖2示本發(fā)明所述靈芝菌株高倍鏡觀察照片；
圖3示地面對(duì)照菌株結(jié)晶紫染色照片；
圖4示本發(fā)明所述靈芝菌株結(jié)晶紫染色照片；
圖5示地面對(duì)照菌株掃描電鏡照片，放大倍數(shù)5000 ；
圖6示本發(fā)明所述靈芝菌株掃描電鏡照片，放大倍數(shù)5000 ；
圖7示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的Vl可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖8示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的V2可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖9示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的V3可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株；B:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖10示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的V4可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖11示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的V5可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖12示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的V6可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖13示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的V7可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖14示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的V8可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖15示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的V9可變區(qū)；A:地面對(duì)照菌株:本發(fā)明所述靈芝菌株；
圖16示地面對(duì)照菌株和本發(fā)明所述靈芝菌株SDS-PAGE分析結(jié)果泳道 1:分子量 Marker ;從上至下依次為 97.2kDa、66.4kDa、44.3kDa、29.0kDa,20.lkDa、14.3kDa ；
泳道2:地面對(duì)照菌株裂解物；
泳道3:本發(fā)明所述靈芝菌株第I代菌體裂解物；
泳道4:本發(fā)明所述靈芝菌株30代傳代菌體裂解物。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0019]本發(fā)明所述的一株太空誘變高效靈芝菌、Ganoderma lucidum') S7-T7,于2011年5月19日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,建議分類命名為靈芝(Ganochrma lucidum),保藏編號(hào)為CGMCC N0.4877。
[0020]下述內(nèi)容中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑。
[0021]一、篩選培養(yǎng):
本發(fā)明所述的靈芝菌iGanoderma lucidum),是一株利用神舟七號(hào)載人航天器將待突變的地面對(duì)照菌株S7-D7 (保藏編號(hào)為CGMCC 5.0706)帶上太空，經(jīng)誘變使生物基因組DNA的堿基產(chǎn)生變異，并造成DNA的斷裂和重組，產(chǎn)生基因突變。然后在地面進(jìn)行篩選，比較空間誘變獲得的20株單克隆菌株菌絲日生長(zhǎng)長(zhǎng)度和液體培養(yǎng)菌體干重后，獲得的一株有利、高效的正突變菌株。其具體篩選過(guò)程如下:
1、培養(yǎng)基
PDA 液體培養(yǎng)基:馬鈴薯 200.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, VB1 0.01 g/L ；
PDA 固體培養(yǎng)基:馬鈴薯 200.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 3.0 g/L7VB1 0.01 g/L，瓊脂 20.0 g/L。[0022]2、空間誘變
2008年9月，將待突變的地面對(duì)照菌株S7-D7分為2份，1份作為對(duì)照菌株于4°C保存，1份搭載神舟七號(hào)載人航天器進(jìn)行空間誘變。
[0023]3、誘變菌株篩選
每50mL試管接入15mL左右PDA固體培養(yǎng)基制成斜面，挑取經(jīng)空間誘變獲得的單克隆S7-T7菌株20株，分別接種于試管斜面上，于25 °C恒溫培養(yǎng)5 d，在菌絲生長(zhǎng)前沿做標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量日生長(zhǎng)長(zhǎng)度。從固體培養(yǎng)基中挑取上述20株單克隆菌株，分別接種于含50 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25°C恒溫培養(yǎng)7 d，12000 rpm離心，收集菌體，70°C恒溫干燥24 h，分別稱取菌體干重。試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，試驗(yàn)過(guò)程中地面對(duì)照菌株S7-D7作為對(duì)照，結(jié)果如表1所示。
[0024]表1空間誘變菌株生長(zhǎng)速度的測(cè)定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma7wcii//7?)S7-T7,于2011年5月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.4877，其特征在于:
其 18SrDNA 序列為 SEQ ID N0.2。
2.權(quán)利要求1所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloiferaaS7-T7在制備藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma7wci<*?)S7-T7在制備保健品中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/maA/ci<*?)S7-T7在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于: 其在制備提高免疫力藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的太空誘變高效靈芝菌7mii/_)S7-T7在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于: 其在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/maA/ci<*?)S7-T7在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于: 其在制備提聞免疫力保健品中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的太空誘變高效靈芝菌7mii/?)S7-T7在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于: 其在制備抗氧化保健品中的應(yīng)用。
8.利用權(quán)利要求1所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma7wci<*?)S7-T7制備膠囊制劑的方法，其特征在于: 由以下步驟實(shí)現(xiàn): 步驟一:將靈芝菌株在發(fā)酵罐中培養(yǎng)7~8 d,發(fā)酵液4000 rpm離心15min,收集菌絲體,純化水洗滌菌絲體2次； 步驟二:洗滌后的菌絲體60°C烘干； 步驟三:將干菌體粉碎后過(guò)80目篩，加入1.0%硬脂酸鎂、1.0%卡拉膠，混合均勻后按0.5g/粒裝入膠囊,制成膠囊制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/maA/ci<*?)S7-T7制備膠囊制劑的方法，其特征在于: 步驟一中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%>MgSO4.7H20 0.05%、VB1 0.005%、水余量。
【文檔編號(hào)】A61K36/074GK103548556SQ201310217079
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月4日
【發(fā)明者】趙恒
申請(qǐng)人:神舟太空產(chǎn)品高科技成果推廣中心集團(tuán)有限公司