叔丁基-4-羥基苯甲醚新用途

叔丁基-4-羥基苯甲醚新用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及叔丁基-4-羥基苯甲醚的新用途。本發(fā)明具體公開了叔丁基-4-羥基苯甲醚在制備M2型巨噬細(xì)胞分化抑制劑或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化抑制劑中的用途，基于此，本發(fā)明還進(jìn)一步將叔丁基-4-羥基苯甲醚應(yīng)用于預(yù)防或治療腫瘤的組合物中。
【專利說明】叔丁基-4-羥基苯甲醚新用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及叔丁基-4-羥基苯甲醚新用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 叔丁基-4-羥基苯甲醚（BHA)，其分子式為CnH160 2，呈無色或微黃色蠟狀固體。叔 丁基-4-羥基苯甲醚可采用下列方法制備：
[0003] 1)制備中間體對羥基苯甲醚：將對氨基苯甲醚和亞硝酸鈉加入反應(yīng)荃，在硫酸存 在下進(jìn)行重氮化。反應(yīng)完畢后保溫過濾，并將濾液緩慢加入熱水中進(jìn)行水解。生成得對羥 基苯甲醚即刻用蒸汽提餾出來，冷凝后用有機(jī)溶劑苯萃取。經(jīng)濃縮蒸餾去除溶劑，可得對羥 基苯甲醚；
[0004] 2) BHA的合成：將溶劑苯、叔丁醇和對羥基苯甲醚依次加入反應(yīng)釜加熱溶解，然后 加入催化劑磷酸或硫酸，于80°C強(qiáng)烈攪拌下回流反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，放料靜置分層。有機(jī)相 先后用10%的氫氧化鈉溶液和水洗至中性。用蒸餾法除去溶劑，再經(jīng)乙醇重結(jié)晶得成品。
[0005] BHA已知最常用的用途是作為食品抗氧化劑。添加于食品中的抗氧化作用3-BHA 比2-BHA強(qiáng)1. 5-2倍，但兩者混合有一定的協(xié)同作用，因此，含有高比例3-BHA的混合物，其 效力幾乎與純3-BHA相仿。BHA能與油脂氧化過程產(chǎn)生的過氧化物作用，使油脂自動氧化 的連鎖反應(yīng)切斷，防止油脂繼續(xù)氧化，對酸類、2,6_二叔丁基對甲酚、沒食子酸丙酯、對苯二 酚、甲硫氨酸、卵磷酯、硫代二丙酸等也有抗氧化作用。BHA與其他抗氧劑混合與增效劑檸 檬酸等并用，其抗氧化作用更顯著。除抗氧化作用外BHA還具有相當(dāng)強(qiáng)的抗菌力，具有抗霉 效果。BHA主要是作為食品添加劑，用于油脂、豬油、魚貝鹽腌品、魚貝干制品、椒鹽餅干、炸 馬鈴薯薄片、方便面、油炸點(diǎn)心等的油的抗氧化，也可用作飼料添加劑和汽油添加劑，其中 2-BHA還可用作生化試劑?，F(xiàn)有技術(shù)中對于BHA除抗氧化劑外的用途研究較少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供叔丁基-4-羥基苯甲醚（BHA)的新用途。
[0007] 本發(fā)明第一方面提供了叔丁基-4-羥基苯甲醚（BHA)在制備M2型巨噬細(xì)胞分化 抑制劑或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化抑制劑中的用途。
[0008] 所述M2型巨噬細(xì)胞分化抑制劑是指：能抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞的制 劑。
[0009] 所述腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化抑制劑是指：能抑制巨噬細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì) 胞的制劑。
[0010] 進(jìn)一步的，所述巨噬細(xì)胞來源于單核細(xì)胞。
[0011] 進(jìn)一步的，所述M2型巨噬細(xì)胞可以是M2a型、M2b型和M2c型巨噬細(xì)胞等。
[0012] 一般而言，巨噬細(xì)胞來源于血液循環(huán)中的單核細(xì)胞。血液循環(huán)中的單核細(xì)胞穿過 毛細(xì)血管內(nèi)皮，進(jìn)而遷移到不同的組織中分化成為組織特異性的巨噬細(xì)胞。在單核細(xì)胞分 化成為巨噬細(xì)胞的過程中，細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生了很大的改變。巨噬細(xì)胞可以分化為Ml 型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞是巨噬細(xì)胞分化的主要表型。Ml型巨噬細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮抗 感染的作用。M2型巨噬細(xì)胞者則有著促進(jìn)細(xì)胞生長和傷口愈合的作用。本發(fā)明經(jīng)研究發(fā) 現(xiàn)，BHA特異性抑制M-CSF與IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞分化，而對GM-CSF、LPS與IFN γ 誘導(dǎo)的Ml型巨噬細(xì)胞分化沒有顯著性抑制作用。本發(fā)明的研究表面明叔丁基-4-羥基苯 甲醚（BHA)可以抑制來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞，基于此認(rèn)為，叔丁 基-4-羥基苯甲醚（BHA)可用于制備M2型巨噬細(xì)胞分化抑制劑。
[0013] 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumour-associated macrophages ΤΑΜ)是外周血單核細(xì)胞浸 潤到實(shí)體腫瘤組織中而演變成的巨噬細(xì)胞。當(dāng)單核細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，它的分化方向?qū)⒂?腫瘤微環(huán)境所決定。在腫瘤微環(huán)境中缺乏單核細(xì)胞分化為Ml型巨噬細(xì)胞所需的IFN-γ及 細(xì)菌分解產(chǎn)物等分子，但具有使單核細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞所需的種種分子。近年來相 關(guān)研究表明M2型巨噬細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞有著許多共同生物特性和生物功能。基于 本發(fā)明研究表明BHA可以抑制來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞，我們推測 認(rèn)為，BHA對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化同樣有抑制作用。
[0014] 本發(fā)明第二方面，提供了叔丁基-4-羥基苯甲醚（BHA)作為抑制巨噬細(xì)胞分化為 M2型巨噬細(xì)胞的有效成分，在制備預(yù)防或治療與巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)的疾 病的組合物中的用途。
[0015] 所述組合物可以是藥物或保健品。
[0016] 本發(fā)明第三方面，提供了叔丁基-4-羥基苯甲醚（BHA)作為抑制巨噬細(xì)胞分化為 M2型巨噬細(xì)胞和/或抑制巨噬細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的有效成分，在制備預(yù)防或治 療腫瘤的組合物中的用途。
[0017] 進(jìn)一步的，所述藥物或保健品通過抑制巨噬細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來抑制 腫瘤的發(fā)生、增長或轉(zhuǎn)移。
[0018] 所述BHA作為抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞和/或抑制巨噬細(xì)胞分化為腫 瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的有效成分是指：所述組合物中，可以BHA為其唯一抑制巨噬細(xì)胞分化為 M2型巨噬細(xì)胞和/或抑制巨噬細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的有效成分，或者也可以將 BHA作為其抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞和/或抑制巨噬細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì) 胞的有效成分之一與其他具有同樣功效的成分同時(shí)含有。
[0019] 所述組合物中還進(jìn)一步可選擇地含有基于其他機(jī)理預(yù)防或治療腫瘤的有效成分， 可選擇地含有對預(yù)防或治療腫瘤的有效成分起輔助、增效或緩釋作用的成分。
[0020] 所述預(yù)防或治療腫瘤的組合物可以為藥物或保健品。
[0021] 所述預(yù)防或治療腫瘤是指：預(yù)防性降低腫瘤發(fā)生或復(fù)發(fā)的幾率，或者消除腫瘤、抑 制腫瘤進(jìn)一步發(fā)展或轉(zhuǎn)移。
[0022] 本發(fā)明所述預(yù)防或治療的腫瘤選自其發(fā)生發(fā)展或轉(zhuǎn)移與巨噬細(xì)胞分化為腫瘤相 關(guān)巨噬細(xì)胞相關(guān)的腫瘤?？梢詾榱夹阅[瘤或惡性腫瘤?？梢允窍到y(tǒng)腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫 瘤、泌尿和男性生殖系統(tǒng)腫瘤、女性生殖系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤、骨腫瘤、 縱隔腫瘤、甲狀腺癌、五官科腫瘤、皮膚軟組織腫瘤中其發(fā)生發(fā)展或轉(zhuǎn)移與巨噬細(xì)胞分化為 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞相關(guān)的腫瘤。其中良性腫瘤可包括但不限于：口腔良性腫瘤、肺良性腫 瘤、胰腺良性腫瘤、良性甲狀腺瘤、鼻部良性腫瘤、直腸良性腫瘤、纖維瘤、血管瘤、乳腺良 性腫瘤、肝臟良性腫瘤、子宮肌瘤、卵巢囊腫等；其中惡性腫瘤可包括但不限于：食管癌、胃 癌、大腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、小腸腫瘤、鼻咽癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌、睪 丸腫瘤、陰莖癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、乳腺癌、顱內(nèi)腫瘤、椎 管內(nèi)腫瘤、骨軟骨瘤、骨樣骨瘤、骨母細(xì)胞瘤、軟骨瘤、軟骨母細(xì)胞瘤、軟骨粘液樣纖維瘤、非 骨化性纖維瘤、骨血管瘤、骨巨細(xì)胞瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、軟骨肉瘤、骨纖維肉瘤、骨惡性纖 維組織細(xì)胞瘤、脊索瘤、骨轉(zhuǎn)移瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、縱隔腫瘤、甲狀腺癌、耳 部惡性腫瘤、鼻腔和鼻竇惡性腫瘤、喉癌、口腔腫瘤、皮膚癌、惡性黑色素瘤、軟組織腫瘤等。
[0023] 鑒于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生，增長，以及腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中已知的關(guān)鍵 作用，因此認(rèn)為，抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化將能有效控制與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞相關(guān)的腫 瘤的發(fā)生，增長，以及腫瘤的轉(zhuǎn)移。
[0024] 本發(fā)明第四方面公開了一種預(yù)防或治療腫瘤的組合物，所述組合物含有抑制巨噬 細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞有效量的BHA及輔料。
[0025] 進(jìn)一步的，所述組合物為藥物組合物或保健品組合物。
[0026] 進(jìn)一步的，所述組合物中，所述BHA的重量百分含量至少為0. 05wt%，較佳為 l-99wt%，最佳為 10_80wt%。
[0027] 所述組合物可以BHA為唯一藥效成分，或者所述組合物還同時(shí)含有一種或多種其 他預(yù)防或治療腫瘤的有效成分。所述有效成分可選自：抑制核酸（DNA和RNA)生物合成的 藥物：如氟脲嘧啶、替加氟、優(yōu)福定、脫氧氟尿苷、阿糖胞苷、羥基脲、六甲嘧胺、甲氨蝶呤、 6_巰嘌呤等；直接破壞DNA結(jié)構(gòu)與功能的藥物：包括烷化劑如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、氮芥 類抗腫瘤藥、亞硝脲類抗腫瘤藥、甲烷磺酸酯類烷化劑等，鉬類制劑和抗腫瘤抗生素如絲裂 霉素、平陽霉素、阿克拉霉素、米托蒽醌、表柔比星等；干擾轉(zhuǎn)錄過程阻止RNA合成的藥物： 如放線菌素 D、柔紅霉素、阿霉素等；影響蛋白質(zhì)合成與功能的藥物：如長春堿類、高三尖杉 酯堿、依托泊甙、替尼泊甙、紫杉醇等；影響激素平衡的藥物：如雌激素、雄激素、抗雌激素、 腎上腺皮質(zhì)激素等；抗腫瘤輔助治療藥物：如昂丹司瓊、亞葉酸鈣等。特別是肺癌、肝癌、胃 癌、直腸癌、乳腺癌、子宮頸癌等的常用抗腫瘤藥物。
[0028] 所述組合物中還可選擇地含有對預(yù)防或治療腫瘤的有效成分起輔助、增效或緩釋 作用的成分。
[0029] 所述輔料的含量范圍一般為0. 1-99. 95wt%，優(yōu)選的含量為1-99%，最優(yōu)選為 20-90%。
[0030] 所述輔料為常用的藥物或保健品用輔料，可包括（但不限于）糖類，如乳糖、葡萄 糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖 維素和甲基纖維素；黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫 酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘 油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ;潤濕劑，如月桂基硫酸鈉； 著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩 沖液等，這些物質(zhì)根據(jù)需要用于幫助配方的穩(wěn)定性或有助于提高活性或它的生物有效性或 在口服的情況下產(chǎn)生可接受的口感或氣味。
[0031] 本發(fā)明的組合物可以被制成各種常見的劑型，包括但不限于經(jīng)胃腸道給藥劑型， 如常用的散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑、混懸劑等；非經(jīng)胃腸道給藥劑型，包括 注射給藥劑型：如注射劑，呼吸道給藥劑型：如噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑等；皮膚給藥劑型 ： 如外用溶液劑、噴霧劑、氣霧劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、貼劑等；粘膜給藥劑型： 如滴眼劑、滴鼻劑、眼用軟膏劑、含漱劑、舌下片劑、粘貼片及貼膜劑等；腔道給藥劑型：如 栓劑、氣霧劑、泡騰片、滴劑及滴丸劑等。較佳的，為經(jīng)胃腸道給藥劑型和注射給藥劑型。
[0032] 在本發(fā)明揭示可以BHA作為抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞或腫瘤相關(guān)巨噬 細(xì)胞有效成分并公開了其在組合物中的含量的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)采 用常規(guī)技術(shù)手段選擇合適的輔料制備獲得以BHA為相關(guān)有效成分的上述各種劑型的藥物 或保健品。
[0033] 本發(fā)明第四方面公開了一種針對罹患腫瘤的對象治療腫瘤的方法，為不間斷地向 對象提供安全有效量的BHA。
[0034] 安全有效量的BHA推薦為5-100mg/kg體重/天。
[0035] 由于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在體內(nèi)的分化是一個(gè)不間斷地連續(xù)過程，BHA需要不間斷 地供給才能有效地在體內(nèi)抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化，進(jìn)而對對腫瘤起到有效的抑制作 用。在動物模型中，間斷使用BHA對腫瘤抑制作用非常有限。
[0036] 所述罹患腫瘤的對象為哺乳動物，如人。
[0037] 本發(fā)明提供了 BHA的新用途，進(jìn)一步拓寬了 BHA的應(yīng)用前景，且由于BHA為已知的 常用食品添加劑，因此毒性低，使用安全性佳。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1巨噬細(xì)胞分化抑制試驗(yàn)結(jié)果
[0039] A :為對照組的空白對照試驗(yàn)結(jié)果
[0040] B :為對照組Ml分化試驗(yàn)結(jié)果
[0041] C :為對照組M2分化試驗(yàn)結(jié)果
[0042] D:為BHA預(yù)處理組的空白對照試驗(yàn)結(jié)果
[0043] E:為BHA預(yù)處理組Ml分化試驗(yàn)結(jié)果
[0044] F:為BHA預(yù)處理組M2分化試驗(yàn)結(jié)果
[0045] 圖2巨噬細(xì)胞分化抑制試驗(yàn)流式檢測結(jié)果
[0046] a :為對照組Ml分化試驗(yàn)后，流式細(xì)胞儀檢測Ml型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志蛋白分 子⑶86的表達(dá)結(jié)果；
[0047] b :為BHA預(yù)處理組Ml (⑶86)分化試驗(yàn)后，流式細(xì)胞儀檢測Ml型巨噬細(xì)胞特異表 面標(biāo)志蛋白分子CD86的表達(dá)結(jié)果；
[0048] c :為對照組M2分化試驗(yàn)后，流式細(xì)胞儀檢測M2型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志蛋白分 子⑶163的表達(dá)結(jié)果；
[0049] d:為BHA預(yù)處理組M2 (⑶163)分化試驗(yàn)后，流式細(xì)胞儀檢測M2型巨噬細(xì)胞特異表 面標(biāo)志蛋白分子⑶163的表達(dá)結(jié)果。
[0050] 1峰：分化處理前⑶86的檢測峰
[0051] 2峰：分化處理后⑶86的檢測峰
[0052] Γ峰：分化處理前⑶163的檢測峰
[0053] 2'峰：分化處理后⑶163的檢測峰
[0054] 圖3 :腫瘤抑制試驗(yàn)?zāi)[瘤體積檢測結(jié)果

【具體實(shí)施方式】
[0055] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0056] 實(shí)施例1巨噬細(xì)胞分化抑制試驗(yàn)
[0057] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
[0058] 1.人全血分離單個(gè)核細(xì)胞。
[0059] 2.六孔板培養(yǎng)3-6小時(shí)，吸去培養(yǎng)基，漂洗兩次。單核細(xì)胞貼壁生長。
[0060] 3.單核細(xì)胞用BHA(80 μ M)預(yù)處理1小時(shí)。設(shè)不處理組為對照組。
[0061] 4.培養(yǎng)：RPMI-1640 培養(yǎng)基，10%(vol/vol)FBS，2mM 谷氨酰胺，青霉素（100U/ml) 和鏈霉素（l〇〇yg/ml)。
[0062] 5.細(xì)胞培養(yǎng)6天：培養(yǎng)基含人重組GM-CSF (10ng/ml) or M-CSF (25ng/ml)。隔天換 液。
[0063] 6. Ml 分化：細(xì)胞培養(yǎng) 6 天（GM-CSF)后，用 LPS(100ng/ml)和 IFN · (40ng/ml)刺 激24小時(shí)。這些分化為Ml型巨噬細(xì)胞。
[0064] 7. M2分化：細(xì)胞培養(yǎng)6天（M-CSF)后，IL-4(25ng/ml)刺激24小時(shí)。這些分化為 M2型巨噬細(xì)胞。
[0065] 顯微鏡下觀察各組不同時(shí)期的狀態(tài)，見圖1。
[0066] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GM-CSF+LPS+IFN γ和M-CSF+IL-4誘導(dǎo)Ml和M2型巨噬細(xì)胞 分化(細(xì)胞形態(tài)變化)。BHA特異性抑制M-CSF+IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞分化，但對 GM-CSF+LPS+IFNY誘導(dǎo)的Ml型巨噬細(xì)胞分化沒有顯著性抑制作用。
[0067] 這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)論進(jìn)一步得到以下實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
[0068] 流式細(xì)胞儀檢測Ml和M2型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志蛋白分子的表達(dá)來確定Ml和 M2型巨噬細(xì)胞的分化：
[0069] Ml型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志蛋白分子：⑶86
[0070] M2型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志蛋白分子：CD163
[0071] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
[0072] 首先按以上實(shí)驗(yàn)步驟分化Ml和M2型巨噬細(xì)胞，一組細(xì)胞在分化前一小時(shí)加入BHA (80 μ M)，另一組細(xì)胞做為對照直接分化。然后
[0073] 1.用2mL PBS洗滌液洗滌細(xì)胞兩次，300g離心5分鐘，棄上清；
[0074] 2.用PBS洗滌液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1 X 106個(gè)/ml ;
[0075] 3.取100ul調(diào)節(jié)好細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液到流式管底部，加入熒光標(biāo)記抗體 anti-⑶86或anti-⑶163各20uL，混勻后常溫避光反應(yīng)20分鐘；（同時(shí)平行進(jìn)行同型對 照管的染色)。
[0076] 4.加入2ml PBS洗漆液，300g離心5分鐘，棄上清；
[0077] 5.加入0. 5mL PBS洗滌液重懸細(xì)胞，上流式儀分析。
[0078] 各組細(xì)胞的流式檢測結(jié)果如圖2 :
[0079] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
[0080] GM-CSF+LPS+IFN γ誘導(dǎo)Ml型巨噬細(xì)胞分化導(dǎo)致Ml型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志蛋白 分子⑶86的表達(dá)在分化后的這些細(xì)胞表面增高。BHA預(yù)先處理對GM-CSF+LPS+IFN γ誘導(dǎo) 的⑶86表達(dá)增高沒有顯著性抑制作用。
[0081] M-CSF+IL-4誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞分化導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志蛋白分子 ⑶163的表達(dá)在分化后的這些細(xì)胞表面增高。BHA預(yù)先處理對M-CSF+IL-4誘導(dǎo)的⑶163表 達(dá)增高有明顯的抑制作用。
[0082] 所以，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明BHA特異性抑制M-CSF+IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì) 胞分化而對GM-CSF+LPS+IFNY誘導(dǎo)的Ml型巨噬細(xì)胞分化沒有顯著性抑制作用。
[0083] 實(shí)施例2腫瘤抑制試驗(yàn)
[0084] 小鼠：雌性C57/BL6小鼠（購自SLACCAS)，6?8周時(shí)接種腫瘤細(xì)胞。
[0085] 腫瘤模型：培養(yǎng)LLC小鼠腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)基為DMEM加10%血清，接種于C57/BL6小 鼠右側(cè)腹皮下。每只小鼠一次接種含50%基底膜基質(zhì)的100ul培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)為lxlO 6個(gè)。
[0086] 檢測試劑劑型與劑量：BHA(購自Sigma-Aldrich(Cat#B1253))溶解于玉米油中，濃 度為40mg/ml。試驗(yàn)分為BHA實(shí)驗(yàn)小鼠組與對照組，入選小鼠體重：19 ± 2g/只。BHA實(shí)驗(yàn)小 鼠組：8只，200mgBHA/kg/天灌胃給藥7天后接種腫瘤細(xì)胞，接種腫瘤細(xì)胞后，按200mgBHA/ kg/天持續(xù)灌胃給藥，并對小鼠腫瘤體積進(jìn)行測量，觀察17天。對照組：8只，以與給藥組等 體積的玉米油灌胃給藥。
[0087] 測量與數(shù)據(jù)繪圖：使用測量器測定腫瘤的兩徑，一周兩次。腫瘤體積計(jì)算公式：腫 瘤體積=(長X寬 2)Χ〇· 5。腫瘤的平均體積或體重使用graph program Prism5(GraphPad) 繪制。小鼠腫瘤體積數(shù)據(jù)見圖3。
[0088] 17天時(shí)，BHA組小鼠平均腫瘤體積小于對照組，分別為267±24. 1mm3， 434±52. 5mm3。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2. 888，p=0. 016)。該試驗(yàn)結(jié)果說明BHA具有預(yù)防與 抑制腫瘤的效果。
[0089] 上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【權(quán)利要求】
1. 叔丁基-4-羥基苯甲醚在制備M2型巨噬細(xì)胞分化抑制劑或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化 抑制劑中的用途。
2. 叔丁基-4-羥基苯甲醚作為抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞的有效成分，在制備 預(yù)防或治療與巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)的疾病的組合物中的用途。
3. 叔丁基-4-羥基苯甲醚作為抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞和/或抑制巨噬細(xì) 胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的有效成分，在制備預(yù)防或治療腫瘤的組合物中的用途。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述組合物通過抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型 巨噬細(xì)胞和/或抑制巨噬細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來抑制腫瘤的發(fā)生、增長或轉(zhuǎn)移。
5. -種預(yù)防或治療腫瘤的組合物，所述組合物含有抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì) 胞或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞有效量的BHA及輔料。
6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述組合物中，所述BHA的重量百分含量 至少為0. 05%。
7. 如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述組合物中，所述BHA的重量百分含量 為 l-99wt%。
8. 如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述組合物中，所述BHA的重量百分含量 為 10-80wt%。
9. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述組合物以BHA為唯一藥效成分，或者 所述組合物還同時(shí)含有一種或多種其他預(yù)防或治療腫瘤的有效成分。
10. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述組合物為藥物或保健品。
【文檔編號】A61K31/085GK104208050SQ201310211441
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月30日
【發(fā)明者】曲建寧 申請人:曲建寧