專利名稱：鄂西香茶菜素作為Wnt信號(hào)通路抑制劑及抗癌藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體地涉及小分子鄂西香茶菜素(henryin)在生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)腸腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，目前臨床治療主要有三大手段:手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療。手術(shù)治療和放射治療主要針對(duì)的是局部或區(qū)域性腫瘤，對(duì)發(fā)生全身多處轉(zhuǎn)移的腫瘤只能依賴化療。目前臨床使用的化療藥物多為細(xì)胞毒類藥物，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞缺乏足夠的選擇性，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常的組織細(xì)胞也產(chǎn)生不同程度的損傷作用，導(dǎo)致治療效果和患者的生命質(zhì)量均受到影響。大量的研究結(jié)果表明fct信號(hào)通路的過度激活與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，90%的結(jié)腸腫瘤中均發(fā)生了該信號(hào)通路基因的突變或者表達(dá)異常，基于fct信號(hào)通路與結(jié)腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系，負(fù)調(diào)控Wnt信號(hào)通路的抑制劑具有重要的抗腫瘤藥物成藥前景，靶向fct信號(hào)通路的抗腫瘤藥物研究對(duì)于改善結(jié)腸癌的治療具有重要的意義。天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎、多樣的特點(diǎn)，是抗腫瘤藥物以及藥物先導(dǎo)分子的重要來源。唇形科香茶菜屬植物在民間被用于預(yù)防和治療炎癥、胃腸道感染以及癌癥等疾病。以往的研究表明該屬植物中富含的對(duì)映-貝殼杉烷二萜類化合物(如毛萼乙素，冬凌草甲素等)在腫瘤和炎癥等疾病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明涉及的化合物鄂西香茶菜素是從民間藥用的該屬植物魯山冬凌草(Isodon rubescens var.1ushanensis)中分離得到的。目前，現(xiàn)有技術(shù)中沒有有關(guān)化合物鄂西香茶菜素作為fct信號(hào)通路抑制劑，以及化合物鄂西香茶菜素在制備預(yù)防和治療結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供化合物鄂西香茶菜素作為Wnt信號(hào)通路抑制劑，以及化合物鄂西香茶菜素在制備預(yù)防和治療結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開了如下技術(shù)方案:化合物鄂西香茶菜素作為Wnt信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用。如所述的應(yīng)用，鄂西香茶菜素通過直接阻斷β -catenin/TCF的蛋白結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成以實(shí)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路抑制。如所述的應(yīng)用，鄂西香茶菜素通過抑制Wnt信號(hào)通路以實(shí)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路靶基因表達(dá)抑制。如所述的應(yīng)用，鄂西香茶菜素通過選擇性抑制Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯以實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制。本發(fā)明同時(shí)提供了化合物鄂西香茶菜素在制備預(yù)防和治療結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。如所述的應(yīng)用，鄂西香茶菜素通過選擇性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯從而顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
如所述的應(yīng)用，鄂西香茶菜素通過選擇性抑制Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。如所述的應(yīng)用，鄂西香茶菜素通過抑制結(jié)腸癌內(nèi)源Wnt信號(hào)通路靶基因表達(dá)從而顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。如所述的應(yīng)用，于鄂西香茶菜素通過直接阻斷β-catenin/TCF的蛋白結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成從而顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下優(yōu)益性:本發(fā)明的小分子化合物鄂西香茶菜素是從民間藥用植物唇形科香茶菜屬植物Isodon rubescens var.1ushanensis中分離獲得的對(duì)映-貝殼杉燒型二職化合物,鄂西香茶菜素藥理作用強(qiáng)，藥理機(jī)制明晰，具有較高的安全性，有很好的藥用價(jià)值。鄂西香茶菜素是本發(fā)明在fct信號(hào)抑制劑篩選中發(fā)現(xiàn)的具有Wnt信號(hào)通路抑制活性(IC5tl=0.6μΜ)的小分子化合物，本發(fā)明進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)鄂西香茶菜素具有顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。鄂西香茶菜素能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HCT116的增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性，其半數(shù)生長(zhǎng)抑制常數(shù)GI5tl值分別為0.27 μ M和0.90 μ Μ，對(duì)正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞(XD-841-C0N以及支氣管上皮細(xì)胞Beas-2B的毒性較小(GI5tl分別為2.98 μ M和3.55 μ Μ)。鄂西香茶菜素抑制Wnt信號(hào)通路靶基因(Cyclin Dl和C-myc)的表達(dá)，從而將結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯于G1期。蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鄂西香茶菜素直接抑制i3-catenin/TCF4的結(jié)合，通過靶向抑制Wnt信號(hào)通路從而將結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯于G1期。以上數(shù)據(jù)表明鄂西香茶菜素是一個(gè)極具開發(fā)應(yīng)用前景的防治結(jié)腸癌的藥物。本發(fā)明的化合物鄂西香茶菜素可經(jīng)口或不經(jīng)過口給藥，給藥量因藥物不同而各有不同，對(duì)成人來說，每天1-1OOOmg比較合適。經(jīng)口服給藥時(shí)，首先使化合物與常規(guī)的藥用輔劑如賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤(rùn)滑齊 、抗氧化劑、包衣劑、著色劑、芳香劑、表面活性劑等混合，將其制成顆粒劑、膠囊、片劑等形式給藥；非經(jīng)口給藥時(shí)可以注射液、輸液劑或栓劑等形式給藥。制備上述制劑時(shí)，可使用常規(guī)的制劑技術(shù)。
圖1顯示鄂西香茶菜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖2A顯示鄂西香茶菜素對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480和HCTl 16)以及正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞(XD-841-C0N和正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的生長(zhǎng)抑制作用。以不同濃度的鄂西香茶菜素處理細(xì)胞72小時(shí)，MTS方法檢測(cè)細(xì)胞存活率，從而計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。圖2B顯示順鉬對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480和HCT116)以及正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞(XD-841-C0N和正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的生長(zhǎng)抑制作用。以不同濃度的順鉬處理細(xì)胞72小時(shí)，MTS方法檢測(cè)細(xì)胞存活率，從而計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。圖2C顯示鄂西香茶菜素對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480和HCTl 16)以及正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞(XD-841-C0N和正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度GI5tl,順鉬作為對(duì)照藥物。
圖2D顯示鄂西香茶菜素對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞HCTl 16的細(xì)胞周期阻滯作用。鄂西香茶菜素4 μ M處理細(xì)胞12小時(shí)與24小時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果表明鄂西香茶菜素處理使得HCT116細(xì)胞處于Gl期的比例增加，而且具有明顯的時(shí)間依賴效應(yīng)。圖3A，3B顯示鄂西香茶菜素處理的SW480細(xì)胞中的差異基因表達(dá)譜分析結(jié)果。
4μ M鄂西香茶菜素處理SW480細(xì)胞12小時(shí)后提取總mRNA做基因芯片檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)做進(jìn)一步的GO annotation和信號(hào)通路分析,使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為BioCarta and KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。相對(duì)于對(duì)照組(0.5%DMS0處理12小時(shí)的SW480細(xì)胞)，表達(dá)上調(diào)2倍或者下調(diào)2倍的基因被確定為差異表達(dá)基因。分析結(jié)果顯示在鄂西香茶菜素處理的SW480細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路受到了顯著的影響。圖3C顯示鄂西香茶菜素對(duì)于Wnt信號(hào)通路報(bào)告基因活性的影響。不同濃度的鄂西香茶菜素處理Wntl轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞，SW480細(xì)胞以及HCT116細(xì)胞24小時(shí)，利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)報(bào)告基因活性。結(jié)果表明鄂西香茶菜素劑量依賴地抑制外源以及內(nèi)源激活的fct信號(hào)通路活性。圖3D顯示鄂西香茶菜素對(duì)于NF-KB信號(hào)通路活性的影響。應(yīng)用TNFa處理HEK293T細(xì)胞以激活NF- κ B信號(hào)通路，然后以4 μ M鄂西香茶菜素處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鄂西香茶菜素對(duì)于NF-K B-Luc的活性沒有影響，表明鄂西香茶菜素是Wnt信號(hào)通路的特異抑制劑。圖中顯示數(shù)據(jù)是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的mean土SD，*P〈0.05, **P〈0.01, NS,與對(duì)照相比差異不顯著。圖4A顯示鄂西香茶菜素及其類似物的結(jié)構(gòu)。圖4B顯示鄂西香茶菜素及其類似物對(duì)于HEK293T細(xì)胞中的Topflash報(bào)告基因活性的影響。以wntl和ST-Luc轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞3小時(shí)候后，應(yīng)用不同濃度的鄂西香茶菜素或其類似物處理細(xì)胞24小時(shí)，然后檢測(cè)報(bào)告基因活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)phyllostachysin F和oridonin (冬凌草甲素)和鄂西香茶菜素一樣具有wnt信號(hào)通路抑制活性,而enmenol,minheryin (^Periocalyxin B (毛萼乙素)對(duì)于wnt信號(hào)通路沒有影響。
圖4C顯示鄂西香 茶菜素及其類似物對(duì)于SW480細(xì)胞中的wnt信號(hào)通路抑制活性(IC50, 24小時(shí))以及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性(GI5tl, 72小時(shí))的比較。圖4D顯示鄂西香茶菜素及其類似物處理不同腫瘤細(xì)胞株48小時(shí)對(duì)于細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示鄂西香茶菜素對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，并且相對(duì)于其他腫瘤細(xì)胞(肺癌細(xì)胞A549)以及正常細(xì)胞(CCD-841-C0N和BEAS-2B)體現(xiàn)出明顯的選擇性，而enmenol,minheryin C對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)沒有影響。類似物毛萼乙素EriocalyxinB對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞均體現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒活性。圖5A顯示基因表達(dá)譜分析顯示鄂西香茶菜素抑制SW480細(xì)胞中的系列Wnt信號(hào)通路靶基因的表達(dá)。4 μ M鄂西香茶菜素處理SW480細(xì)胞12小時(shí)后提取總mRNA做基因芯片檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)做進(jìn)一步的GO annotation和信號(hào)通路分析。相對(duì)于對(duì)照組(0.5%DMS0處理12小時(shí)的SW480細(xì)胞)，表達(dá)上調(diào)2倍或者下調(diào)2倍的基因被確定為差異表達(dá)基因。圖5B，5C顯示實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示鄂西香茶菜素抑制wntl轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞以及SW480細(xì)胞中的Cyclin Dl和C-myc的表達(dá)。以不同濃度的鄂西香茶菜素處理細(xì)胞
12小時(shí)，然后提取mRNA做實(shí)時(shí)定量PCR分析，β -actin作為內(nèi)參。圖5E，5F分別顯示鄂西香茶菜素下調(diào)Wntl轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞，SW480細(xì)胞以及HCTl 16細(xì)胞中Axin2, CyclinDl和Survivin的蛋白表達(dá)。4μΜ鄂西香茶菜素分別處理細(xì)胞6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，裂解細(xì)胞獲取細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫印跡分析。.*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01。圖6Α, 6Β顯示鄂西香茶菜素不影響SW480細(xì)胞中β -catenin蛋白總量以及β -catenin蛋白的磷酸化,也不影響β -catenin蛋白在SW480細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的分布。以不同濃度的鄂西香茶菜素處理SW480細(xì)胞24小時(shí)，裂解細(xì)胞分離獲得胞質(zhì)和胞核部分做免疫印跡分析，Lamin A/C和β-actin分別作為胞核和胞質(zhì)的標(biāo)記蛋白。圖6C顯示鄂西香茶菜素能夠抑制由于LiCl或者β-catenin引起的Wnt信號(hào)通路的激活。HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染報(bào)告基因ST-Luc以及野生型β-catenin或者突變型β-catenin (S37A)，或者應(yīng)用LiCl (20mM)處理3個(gè)小時(shí)，然后加入不同濃度的鄂西香茶菜素處理24小時(shí)，檢測(cè)報(bào)告基因活性。圖6D顯示鄂西香茶菜素在SW480細(xì)胞中影響P_catenin/TCF4的結(jié)合。以不同濃度鄂西香茶菜素處理細(xì)胞12小時(shí)，然后做免疫共沉淀分析β -catenin/TCF4的結(jié)合是否收到影響。以對(duì)wnt信號(hào)通路沒有抑制活性的類似物enmenol (20 μ M)和minheryin C(20 μ M)作為對(duì)照。圖中Hen指鄂西香茶菜素，En指enmenol, Min指minheryin C。圖6E顯示鄂西香茶 菜素直接阻斷β -catenin/TCF4的體外結(jié)合。純化重組人β -catenin (0.8 μ g)蛋白和TCF4(0.4yg)與不同濃度的鄂西香茶菜素在4攝氏度蛋白共同孵育2小時(shí),應(yīng)用飽和了 β -catenin抗體的A/G凝膠顆粒pull down β _catenin/TCF4復(fù)合體，然后做免疫共沉淀檢測(cè)。以對(duì)wnt信號(hào)通路沒有抑制活性的類似物enmenol(20 μ Μ)和minheryin C (20 μ Μ)作為對(duì)照。圖中Hen指鄂西香茶菜素，En指enmenol，Min指minheryin C。圖6F顯示圖6D, 6E中的免疫印跡實(shí)驗(yàn)的量化結(jié)果，數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。圖中Hen指鄂西香茶菜素，En指enmenol, Min指minheryin C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。實(shí)施例1:鄂西香茶菜素的制備。干燥的魯山冬凌草(Isodon rubescens var.lushanensis)的葉4Kg,粉碎后用丙酮/水溶液室溫浸泡，提取液合并，減壓蒸餾除去溶劑，粗提物懸浮于水中，用EtOAc萃取，減壓回收溶劑得浸膏117g。該浸膏硅膠柱層析分離得6個(gè)部分:A-F。部分B (28g):經(jīng)MCI柱層析得到3個(gè)部分B1-B3，其中B1經(jīng)硅膠柱層析(石油醚:丙酮1:0 -0:1，梯度洗脫)得到兩個(gè)化合物的混合物，后經(jīng)半制備RP-18-HPLC (甲醇:水，30:70)分離得化合物鄂西香茶菜素(11.3mg)。鄂西香茶菜素(henryin)(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)分子式為C22H32O6,分子量為392,白色無定形粉末;13C-NMR(C5D5N, 100MHz) δ 209.l(s，C_15), 150.2 (s, C-16)，116.0 (t, C-17)，81 5 (d, C-l)，76.4 (d, C_14)，74.7 (d, C_7)，65.0 (t, C_20)，62.1 (s, C_8)，56.4 (d, C_9), 52.2 (d, C-5)，47.2 (d, C-13)，46.0 (s, C_10)，39.9 (t, C_3)，33.3 (q, C_18)，33.2 (s, C_4), 31.8 (t,C-2), 31.0 (t, C-12)，30.4 (t, C_6), 21.5 (q, C_19)，20.4 (t, C_ll) ; OAc: 170.8，21.3q。實(shí)施例2:
鄂西香茶菜素選擇性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯。本發(fā)明應(yīng)用MTS法檢測(cè)了鄂西香茶菜素化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。在加藥作用72小時(shí)以后，與細(xì)胞毒化療藥物順鉬(cisplatin)體現(xiàn)出來的廣譜抑制作用比較，鄂西香茶菜素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出了選擇性的增殖抑制作用(SW480，HCT116細(xì)胞的半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度GI50分別為0.27 μ M和0.90 μ Μ),而對(duì)正常細(xì)胞(人正常肺上皮細(xì)胞Beas_2B和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(XD-841-C0N)則表現(xiàn)出較弱的細(xì)胞毒性(GI50分別為3.55 μ M與
2.98 μ Μ)(圖2A，2B，2C，)。通過分析鄂西香茶菜素對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鄂西香茶菜素(4 μ Μ)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，越來越多的HCTl 16結(jié)腸癌細(xì)胞被阻滯在Gl期(81%，24小時(shí))(圖2D)。實(shí)施例3:鄂西香茶菜素選擇性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中的Wnt信號(hào)通路。本發(fā)明首先采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了鄂西香茶菜素處理的人結(jié)腸癌細(xì)胞的差異基因表達(dá)。鄂西香茶菜素(4 μ Μ)與SW480孵育12小時(shí)，提取SW480細(xì)胞中的總RNA進(jìn)行基因差異性表達(dá)分析。結(jié)果表明在鄂西香茶菜素處理后的SW480細(xì)胞中，大量腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的基因發(fā)生了差異性的表達(dá)。通過對(duì)差異表達(dá)基因的分析發(fā)現(xiàn)，fct信號(hào)通路基因及其下游靶基因的表達(dá)受到了明顯的抑制，信號(hào)通路分析證明fct信號(hào)通路是主要受影響的信號(hào)通路(圖3A, 3B)。在大多數(shù)結(jié)腸癌細(xì)胞株中，由于不同的基因突變導(dǎo)致了 Wnt信號(hào)通路的異常激活，本發(fā)明進(jìn)一步應(yīng)用報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)了檢測(cè)了鄂西香茶菜素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)源fct信號(hào)的抑制作用，結(jié)果顯示，在與細(xì)胞孵育24小時(shí)后，鄂西香茶菜素劑量依賴性地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HCT116中的Wnt信號(hào)。在Wntl轉(zhuǎn)染或氯化鋰(LiCl)處理的HEK293T細(xì)胞中加藥處理24小時(shí)后，鄂西香茶菜素同樣能夠劑量依賴性的抑制被激活的Wnt信號(hào)(圖3C)。為了確定鄂西香茶菜素對(duì)Wnt信號(hào)的抑制作用是否具有特異性，本發(fā)明同樣采用報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)了鄂西香茶菜素對(duì)腫瘤壞死因子TNFa激活的NF-κ B信號(hào)通路的作用，以NF- κ B信號(hào)通路的抑制劑MG132作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示MG132能夠顯著抑制NF- κ B信號(hào)，而鄂西香茶菜素(4 μ Μ)則沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，表明鄂西香茶菜素對(duì)Wnt信號(hào)通路具有選擇性抑制作用(圖3D)。實(shí)施例4:鄂西香茶菜素抑制Wnt信號(hào)通路的構(gòu)效關(guān)系分析。本發(fā)明應(yīng)用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探討了鄂西香茶菜素及其類似物的構(gòu)效關(guān)系。類似物phyllostachysin F和oridonin (冬凌草甲素)和鄂西香茶菜素一樣同為碳15位為酮基取代和碳14位為β羥基取代，都表現(xiàn)出了明顯的Wnt信號(hào)抑制作用(IC50分別為0.7 μ M和5 μ Μ),而Enmenol和Minheryin C缺乏碳15位的酮基取代,Eriocalyxin B (毛萼乙素)缺乏碳14位的β羥基取代則沒有表現(xiàn)出任何Wnt信號(hào)抑制活性(圖4Α, 4Β, 4C)。與Wnt信號(hào)通路抑制活性對(duì)應(yīng)，Enmenol和Minheryin C對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480不具有生長(zhǎng)抑制作用，毛萼乙素盡管顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HCT116的生長(zhǎng)，也同時(shí)抑制其他腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞(肺癌A549，人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD-841-C0 N以及支氣管上皮細(xì)胞Beas_2B)的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出廣譜的細(xì)胞毒作用，可能與文獻(xiàn)報(bào)道的該化合物是NF-κ B信號(hào)通路抑制劑有關(guān)(圖 4C, 4D)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在具有Wnt信號(hào)抑制活性的對(duì)映-貝殼杉烷型二萜化合物中，碳15位的酮基取代和碳14位的β羥基取代可能是其抑制Wnt信號(hào)通路的有效基團(tuán)。除了這些主要有效基團(tuán)以外，其它取代基也參與了鄂西香茶菜素對(duì)fct信號(hào)的抑制作用，如碳7位和碳I位的羥基取代以及其空間構(gòu)型可能是決定鄂西香茶菜素抑制fct信號(hào)通路特異性的有效化學(xué)結(jié)構(gòu)。實(shí)施例5:鄂西香茶菜素抑制內(nèi)源Wnt信號(hào)通路靶基因的表達(dá)?；蛐酒瑪?shù)據(jù)分析表明，在鄂西香茶菜素處理的SW480細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路靶基因Axin2，Cyclin Dl, SP5, DKKl, NOSI, PPAR δ和FGF20等的表達(dá)均受到明顯的抑制(圖5Α)。本發(fā)明進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR核實(shí)了鄂西香茶菜素對(duì)fct信號(hào)通路靶基因CyclinDl, c-Myc和Axin2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，在HEK293T和SW480細(xì)胞中，鄂西香茶菜素(24小時(shí))能夠劑量依賴地降低CyclinDl, c-Myc以及Axin2的表達(dá)(圖5B, 5C)。同時(shí),應(yīng)用Western印跡分析檢測(cè)了鄂西香茶菜素對(duì)這些Wnt祀基因蛋白水平的影響，與mRNA表達(dá)水平一致，HEK293T，HCT116以及SW480細(xì)胞中的CyclinDUSurvivin和Axin2的蛋白水平隨著與鄂西香茶菜素孵育時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。此外，P21蛋白的表達(dá)也受到了抑制(圖5D，5E，5F)。實(shí)施例6:鄂西香茶菜素通過直接阻斷β-catenin/TCF的蛋白結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成。β -catenin聚集并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)是Wnt信號(hào)通路被激活的標(biāo)志性事件。本發(fā)明首先檢測(cè)了鄂西香茶菜素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞`中β-catenin蛋白核轉(zhuǎn)位的影響。不同濃度的鄂西香茶菜素與SW480細(xì)胞孵育24小時(shí)后，對(duì)SW480細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離處理，并采用Westernblot分析β-catenin蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的分布變化，同時(shí)檢測(cè)β-catenin總蛋白以及磷酸化形式。結(jié)果顯示，鄂西香茶菜素不影響β-catenin蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的相對(duì)分布，β-catenin蛋白總量與磷酸化形式也沒有發(fā)生明顯變化(圖6A，6B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鄂西香茶菜素不影響β -catenin蛋白的核轉(zhuǎn)位及其穩(wěn)定性，可能作用在β-catenin蛋白核轉(zhuǎn)移的下游。本發(fā)明分別應(yīng)用LiCL處理HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染野生型β -catenin以及磷酸化位點(diǎn)突變的β -catenin以激活該細(xì)胞中的Wnt信號(hào),發(fā)現(xiàn)鄂西香茶菜素對(duì)激活的fct信號(hào)依然顯示劑量依賴性的抑制作用，進(jìn)一步提示鄂西香茶菜素作用在Wnt信號(hào)通路的下游(圖6C)。接下來本發(fā)明采用免疫共沉淀的方法檢測(cè)鄂西香茶菜素對(duì)β-catenin蛋白與TCF4轉(zhuǎn)錄因子相互作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鄂西香茶菜素處理(12小時(shí))的SW480細(xì)胞中，β-catenin蛋白與TCF4轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合收到了明顯的抑制(圖6D,6F)。進(jìn)一步的體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鄂西香茶菜素直接阻斷β-catenin蛋白與TCF4蛋白的結(jié)合，從而抑制fct信號(hào)通路和結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞增殖(圖6E，圖6F)。實(shí)施例7:取實(shí)施例1中化合物鄂西香茶菜素，按常規(guī)法加注射用水，精濾，灌封滅菌后可制成注射液。
實(shí)施例8:取實(shí)施例1中化合物鄂西香茶菜素，將其溶于無菌注射用水中，用無菌漏斗過濾，分裝，低溫冷凍干燥后無菌熔封即得粉針劑。實(shí)施例9:取實(shí)施例1中化合物鄂西香茶菜素，按常規(guī)法配以各種藥用輔料可制成片劑。使用化合物鄂西香茶菜素作為藥物活性成分，使用幾種賦形劑作為制備組合藥物片劑的輔料成分，按照一定比例配比制成每片含有藥物成分1-1OOmg的片劑樣品，表I給出普通片劑的配方比例。將一定數(shù)量化合物鄂西香茶菜素與賦形劑輔料制備成不同劑量片劑制劑(如表
I):將幾種賦形劑輔料與原料藥均勻混合，加入1%羥甲基纖維素鈉溶液適量制成軟料，過篩制粒，濕粒烘干并過篩整粒，加入硬脂酸鎂和滑石粉混合均勻后壓片即得。表I取實(shí)施例1中化合物Henryin組合藥物片劑的原料藥和輔料配方
權(quán)利要求
1.化合物鄂西香茶菜素作為fct信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于鄂西香茶菜素通過直接阻斷β-catenin/TCF的蛋白結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成以實(shí)現(xiàn)fct信號(hào)通路抑制。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于鄂西香茶菜素通過抑制fct信號(hào)通路以實(shí)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路靶基因表達(dá)抑制。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于鄂西香茶菜素通過選擇性抑制fct信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯以實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制。
5.化合物鄂西香茶菜素在制備預(yù)防和治療結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于鄂西香茶菜素通過選擇性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯從而顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于鄂西香茶菜素通過選擇性抑制Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于鄂西香茶菜素通過抑制結(jié)腸癌內(nèi)源Wnt信號(hào)通路靶基因表達(dá)從而顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于鄂西香茶菜素通過直接阻斷β-catenin/TCF的蛋白結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成 從而顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及小分子化合物鄂西香茶菜素作為Wnt信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用，以及鄂西香茶菜素在制備預(yù)防和治療結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的鄂西香茶菜素藥理活性強(qiáng)，作用機(jī)制明晰，安全低毒，穩(wěn)定性好，可作為新型藥物，保健品和/或膳食添加劑，也可以作為研究Wnt信號(hào)通路的工具。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103230388SQ201310185250
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者李艷, 孫漢董, 普建新, 李興堯, 張海波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所