一種增強(qiáng)免疫功能的林蛙卵提取物制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種林蛙卵多糖提取物的制備方法及其在增強(qiáng)免疫方面的應(yīng)用。其特征是以林蛙卵為原料，用酶解法提取林蛙卵多糖，過(guò)濾或離心后的溶液，用3倍體積無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉后，得到沉淀為多糖提取物，將其冷凍干燥或者烘干，制成浸膏或干粉。而乙醇液在40℃以下回收。林蛙卵多糖對(duì)離體小鼠脾臟具有不同程度促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，且呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，在濃度為0.001μg/mL仍有較強(qiáng)的促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用。在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，林蛙卵多糖樣品在促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面效果較明顯。在對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子影響方面，林蛙卵多糖對(duì)血清中TNF-α和IL-1β產(chǎn)生量的影響具有顯著變化?？捎糜谥苽涿庖咝运幬?，也可作為食品添加劑使用。本發(fā)明的提取方法以及提取物溶劑不限制于實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例中所提到的。
【專利說(shuō)明】一種增強(qiáng)免疫功能的林蛙卵提取物制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種林蛙卵提取物，屬于中藥技術(shù)和醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域，涉及林蛙卵提取 物的制備方法及其對(duì)免疫機(jī)能的作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)林娃[1] (R. t. chensinensis)，按分類學(xué)來(lái)講，屬兩棲綱、無(wú)尾目、娃科、林娃 屬。地方上俗稱田雞、哈什蟆，我們從形態(tài)上觀察中國(guó)林蛙，它頭部扁平，可看到是黑褐色和 黑色的體色，體表粗糙，60-80mm為其普遍身體長(zhǎng)度，個(gè)別個(gè)體存在不同。另一特點(diǎn)呈現(xiàn)"背 褶在額部呈折狀"，可觀察到背褶有多處黑色斑點(diǎn)，背部擾上也有此特點(diǎn)，另外觀察鼓膜發(fā) 現(xiàn)，存在大的三角形黑色斑點(diǎn)，黑色橫條紋體現(xiàn)在肢體背面，我國(guó)東北是林蛙的主產(chǎn)區(qū)。Li Ang等人 [2]得出結(jié)論，認(rèn)為林蛙主要分布在我國(guó)北方。產(chǎn)自長(zhǎng)白山的林蛙在質(zhì)量最優(yōu)，與其 他林蛙相比，無(wú)論是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值還是藥用價(jià)值，均占首位。林蛙是我國(guó)特有的藥食兩用的經(jīng) 濟(jì)動(dòng)物之一，并且保健功能卓越 [3]。并且在美容方面功效較好，帶動(dòng)了林蛙產(chǎn)業(yè)發(fā)展。中 國(guó)林蛙被認(rèn)為是R. temporaria的亞種[4]。后來(lái)吳政安（1981)提升為種[5]。謝鋒等（1999) [6]用分類學(xué)方法和數(shù)質(zhì)分類學(xué)方法相結(jié)合。研究結(jié)果是：北方人們所稱的哈士蟆，原來(lái)是 生活在東北的居群--中國(guó)林蛙，是我國(guó)的蛙類的一新記錄，稱為東北林蛙R. dybowskii。 但是，《中華人民共和國(guó)藥典》（2010版）仍然標(biāo)注為R. t. chensinensis。分類學(xué)上的爭(zhēng) 議雖沒(méi)有結(jié)束，但是，并不影響林蛙的開(kāi)發(fā)和利用。林蛙專門以昆蟲(chóng)類為其主要食物。林蛙 產(chǎn)品是〃純綠色食品"，是具有滋陰補(bǔ)腎、健腦益智、平肝養(yǎng)胃、延緩衰老、滋補(bǔ)健壯和提高 免疫力等的最佳進(jìn)補(bǔ)良藥之一。中國(guó)林蛙的蛋白質(zhì)含量最多，還存在糖類、18種氨基酸以及 多種維生素和激素類 [7] [8]等。山哈，收錄于《本草綱目》中，就是如今的中國(guó)林蛙。
[0003] 多糖在我們的生活環(huán)境中起到很大的作用，在陸地上普遍存在于動(dòng)物、菌物和植 物中，在海洋生物中存在也較為普遍，植物多糖最貼近于我們得生活(如人參多糖、石斛多 糖、刺五加多糖等)。動(dòng)物多糖則主要分為四類，其中以肝素為主，其余分別為硫酸軟骨素、 透明質(zhì)酸、甲殼質(zhì)(如林蛙油多糖、鹿茸多糖、鮑魚(yú)多糖、殼聚糖等)?？傊嗵鞘菢?gòu)成生命不 可或缺的重要組成部分，多糖是一類由多個(gè)單糖組成，是高分子化合物。自從上世紀(jì)50年 代多糖受到醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，經(jīng)過(guò)眾多的臨床實(shí)驗(yàn)和藥理實(shí)驗(yàn)證明，多糖擁有較高的藥 用價(jià)值和較好的藥理活性作用，并被廣泛的應(yīng)用到保健食品藥品中去。無(wú)論是動(dòng)、植物多糖 還是微生物多糖，基本都擁有提高機(jī)體免疫力、抗氧化和抗衰老、抗疲勞、降血脂、抗腫瘤和 保肝等藥理作用。
[0004] 提到林蛙卵，多數(shù)人會(huì)想起林蛙卵油，它是林蛙卵重要的研究成分，目前研究較 廣，而林蛙卵多糖卻少有研究。林蛙卵多為剖取林蛙油后的副產(chǎn)品，產(chǎn)量也較大。因此，對(duì) 林蛙卵的活性成分進(jìn)行深入研究具有一定的資源學(xué)意義。林蛙卵成分復(fù)雜，含有水分、多 糖、蛋白質(zhì)、磷脂類、氨基酸、脂肪酸、多種微量元素等基本成分。堿法作為提取多糖的方 法之一。劉曉丹 [54]等得出了減法的提取工藝，得到林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖，其含量可達(dá) 24.01mg/g。張小勇等[55]運(yùn)用ICP-MS法，測(cè)定出林蛙卵中含有多種豐富的微量元素。這對(duì) 今后的開(kāi)發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。從林蛙卵中檢測(cè)到的脂肪酸主要是，有硬脂酸、肉豆蘧 酸、棕櫚酸、油酸和亞油酸。有報(bào)道稱而油酸和亞油酸[56]則是降血脂的主要基礎(chǔ)物質(zhì)。劉 磊[57]和李政 [58]等學(xué)者，分別采用HPLC法測(cè)定林蛙卵中磷脂含量和等離子光譜法測(cè)定林 蛙卵中微量元素的含量。結(jié)果顯示：林蛙卵中含有多種人體必須微量元素以及磷脂，可能起 到防治高血壓的作用。
[0005] 近年來(lái)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，林蛙卵具有在醫(yī)藥、保健品領(lǐng)域開(kāi)發(fā)的潛力，是又一新型原 料，更可充分提高林蛙資源的利用率。林蛙卵在抗腫瘤、抗驚厥、抗疲勞、抗氧化，降血脂和 治療肝損傷等方面具有顯著效果。有關(guān)學(xué)者 [59]將林蛙卵酶解后，進(jìn)行了體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)，證 明林蛙卵可以緩解疲勞癥狀。張肅等[6° ]，將林蛙卵蛋白分為三個(gè)劑量組別，高劑量組效果 明顯，抗疲勞效果最好。蘆紅艷等[61]的研究表明，林蛙卵酶解液對(duì)去卵巢大鼠的高血脂癥 狀有改善作用，并能很好的抑制肝細(xì)胞損傷，因此林蛙卵在預(yù)防心腦血管疾病方面有待開(kāi) 發(fā)。還有學(xué)者 [62Μ63]通過(guò)大鼠（高脂模型）的血清進(jìn)行TC、TG、HDL-C和LDL-C的測(cè)定，也說(shuō) 明了林蛙卵具有調(diào)節(jié)血脂的效果。在對(duì)肝損傷模型小鼠的肝臟和血清等指標(biāo)的測(cè)定中，林 蛙卵油可降低肝損傷效果。林蛙卵油有保護(hù)肝臟的效果 [64]。有研究認(rèn)為林蛙卵核糖核酸 酶具有免疫調(diào)節(jié)的能力[65]。由此可見(jiàn)林蛙卵具有很好的開(kāi)發(fā)價(jià)值，并為保健食品藥品的研 發(fā)提供了基礎(chǔ)。
[0006] 基于以上研究，本實(shí)驗(yàn)研究林蛙卵多糖提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)林蛙 卵多糖在免疫調(diào)節(jié)方面具有很好的療效。因此，林蛙卵在增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面有著重要的 開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明提供了該林蛙卵多糖提取物的制備方法，其特征在于：
[0008] 準(zhǔn)確稱取林蛙卵干粉分別加入一定量的蒸餾水放入搖床中100r/min浸泡2h后取 出，調(diào)節(jié)所需pH值。加入酶試劑，放到搖床中，100r/min，在55°C下酶解，之后在沸水浴 中加熱lOmin滅酶活性，5000r/min離心lOmin，去除沉淀，取其上清液，用Sevage法除蛋 白，倒入分液漏斗中充分震蕩20-30min，靜置，待其分層后，將其上下層分別進(jìn)行9000r/ min離心15min，取其上清液混合，加入3倍體積無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，低溫靜置過(guò)夜，第二天 9000r/min離心15min,取沉淀干燥，即得林娃卵多糖提取物。
[0009] 本發(fā)明的積極效果在于：本發(fā)明提供了一種具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的林蛙卵提取 物。該提取物具有顯著的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的作用。
[0010] 本發(fā)明提供了該林蛙卵提取物的提取制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0011] 本發(fā)明可以以單一或組合物的形式通過(guò)口服給藥方式施用于免疫力低下的患者。 也可以制備成片劑、軟膠囊劑、膠囊劑等。
[0012] 本發(fā)明的施藥量可根據(jù)給藥途徑及組合情況，患者年齡、體重、疾病和患病程度等 而變化。
[0013] 實(shí)驗(yàn)例1林蛙卵提取物中多糖含量的測(cè)定
[0014] 1 材料
[0015] 中國(guó)林蛙將林蛙處死后，剖取林蛙卵烘干，粉碎過(guò)80目篩，存于干燥處。林蛙卵提 取物(實(shí)驗(yàn)室自制)。其他化學(xué)試劑(分析純）：北京化工廠。
[0016] 2.儀器
[0017]
【權(quán)利要求】
1. 一種增強(qiáng)免疫功能的林蛙卵多糖提取物及其制備方法具體方法：稱取林蛙卵干粉 分別加入一定量的蒸餾水放入搖床中l(wèi)〇〇r/min浸泡2h后取出，調(diào)節(jié)所需pH值。加入酶試 齊[J，放到搖床中，l〇〇r/min，在55°C下酶解，之后在沸水浴中加熱lOmin滅酶活性，5000r/ min離心lOmin，去除沉淀，取其上清液，用Sevage法除蛋白，倒入分液漏斗中充分震蕩 20-30min，靜置，待其分層后，將其上下層分別進(jìn)行9000r/min離心15min，取其上清液混 合，加入3倍體積無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，低溫靜置過(guò)夜，第二天9000r/min離心15min，取沉 淀干燥，即得林蛙卵多糖提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1，林蛙卵多糖提取物中含有多糖含量為2. 67%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1，林蛙卵多糖對(duì)離體小鼠脾臟具有不同程度促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 的作用，且呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，在濃度為0. 001 μ g/mL仍有較強(qiáng)的促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作 用。在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，林蛙卵多糖樣品在促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面效果較明顯。在對(duì)小鼠血 清中細(xì)胞因子影響方面，林蛙卵多糖對(duì)血清中TNF-α和IL-Ιβ產(chǎn)生量的影響具有顯著變 化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1，所得的林蛙卵多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的效果。林蛙卵多糖可用 于制作增強(qiáng)免疫力的藥物。
【文檔編號(hào)】A61K35/56GK104138393SQ201310172889
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月9日
【發(fā)明者】衛(wèi)功慶, 陳大勇, 蔡鳳坤, 楊靖, 李碩, 李慧萍, 張連學(xué) 申請(qǐng)人:衛(wèi)功慶