專利名稱：高效表達(dá)的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因及其表達(dá)蛋白的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中基因表達(dá)領(lǐng)域，特別涉及一種高效表達(dá)的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因，還涉及其表達(dá)蛋白的用途。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱〃豬藍(lán)耳病〃，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起,病毒感染后可以導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、返情、產(chǎn)死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能破壞豬的免疫系統(tǒng)，引起混合感染或繼發(fā)感染。我國于1995年底爆發(fā)此病，并迅速蔓延到全國多個省份。在許多規(guī)?；i場，PRRS陽性率很高，有的可達(dá)80%以上。自2006年以來，我國部分地區(qū)豬場發(fā)生了由PRRSV變異株導(dǎo)致的高致病性藍(lán)耳病。該病在臨床上以發(fā)病豬高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為主要特征，具有更高的發(fā)病率和死亡率，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病目前有滅活苗使用，但是免疫效果不盡理想。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)是由活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在某些抗原和細(xì)胞因子刺激下產(chǎn)生，可刺激造血細(xì)胞的增殖和分化、促進(jìn)粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞形成集落，增強其功能的一類細(xì)胞因子。GMCSF具有的生物學(xué)活性有:誘導(dǎo)造血前體細(xì)胞分化增殖，維持造血前體細(xì)胞和成熟血細(xì)胞的存活；增強中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞·的吞噬和殺傷功能；誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，并向疫苗注射部位集聚，使其具有明顯的增強疫苗免疫反應(yīng)的作用。因此它在疾病的治療、預(yù)防及作為疫苗佐劑方面具有廣泛的應(yīng)用前景。Inumaru 和 Takamatsu 在 1995 年首先克隆了 pGMCSF 基因，Inumaru 等在 1998 年用桿狀病毒表達(dá)了具有生物學(xué)活性的PGMCSF，隨后國內(nèi)外學(xué)者用大腸桿菌原核表達(dá)載體、質(zhì)粒真核表達(dá)載體、腺病毒等表達(dá)了 PGMCSF，對其生物學(xué)活性進(jìn)行了大量研究。本課題組也曾將pGMCSF克隆入真核表達(dá)載體pVAXl°，轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞后pGMCSF的表達(dá)量和活性較低。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)表達(dá)量和活性低的問題，本發(fā)明提供了一種能夠高效表達(dá)的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因。本發(fā)明還提供了所述豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)蛋白在高效增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答中的用途。本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的:
一種聞效表達(dá)的豬粒細(xì)胞巨曬細(xì)胞集落刺激因子基因，其核昔酸序列如序列表中序列2所示。
一種序列2的基因通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆至真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒。一種所述的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的合成方法，包括以下步驟
1、將真核質(zhì)粒pVAXf改造為pMVAX廣:
由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882,在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和&oRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列I所示,將此段基因序列通過5^1/^boRI酶切位點插入pVAXf載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，提取質(zhì)粒經(jīng)篩選得到SstV雙酶切陽性克隆，命名為PMVAXle ；
所述 pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為:5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，,
所述 17 啟動子序列為:5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ；
2、構(gòu)建表達(dá)pGMCSF的重組真核質(zhì)粒pMVAXl°-pGMCSF:
2.1設(shè)計一對擴(kuò)增pGMCSF蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下: pGMCSF-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGCTCCCACCCGCCCA-3’， pGMCSF-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTACTTTTTGACTGGCCCC-3’，
在上游引物pGMCSF-Fwd的5’端引入&oRI限制性內(nèi)切酶位點和Kozak序列，在下游引物pGMCSF-Rev的5’端引入通ol限制性內(nèi)切酶位點；
2.2從豬的脾淋巴細(xì)胞提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出pGMCSF蛋白基因的PCR產(chǎn)物；
2.3用feoRI/ZAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得包含序列I的載體基因片段1，pGMCSF蛋白基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pGMCSF蛋白的基因片段2，將載體基因片段I和基因片段2連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得pMVAXl°-pGMCSF，在真核質(zhì)粒pVAXl°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示，插入過程示意圖如圖1所示。步驟2.2 中 PCR 反應(yīng)體系為 25μ ，含 cDNA lPL，Mg2+ 1.5mmol/L,dNTP 200Mmol/L,IOXLA PCR Buffer 2.5μ ，pGMCSF-Fwd和 pGMCSF-Rev 濃度均為 400nmol/L，TaKaRa LA Taq2U;反應(yīng)條件為:預(yù)變性95° C 5min，然后進(jìn)行35個循環(huán)，循環(huán)條件為95° C45s，60° C45s, 72° C 45s ;然后72° C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。一 種所述的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的表達(dá)蛋白在增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是:
(1)含有序列表中序列2的真核質(zhì)粒pMVAXl°-pGMCSF表達(dá)pGMCSF蛋白基因，突破了通過pVAXl°載體表達(dá)pGMCSF過程中遇到的表達(dá)量較低和活性較差的局限性，表達(dá)量提高了6.6 倍;
(2)豬體試驗證明，序列表中序列2基因的表達(dá)蛋白pGMCSF表達(dá)活性很高，能夠顯著增強高致病性PRRSV滅活疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，專用于對高致病性PRRSV引起的疾病的預(yù)防及減少豬場的經(jīng)濟(jì)損失。
圖1為本發(fā)明將真核質(zhì)粒pVAXl°改造為pMVAXl°及克隆pGMCSF蛋白基因入pMVAXl°的不意 圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒pMVAXfAiIzfe0RI雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2, OOO DNA Marker,
I為重組陽性質(zhì)粒ρΜνΑΧΓ的5^1/^boRI雙酶切結(jié)果；
圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒pMVAXl°-pGMCSF的&0RI/ZA0I雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2, 000 DNA Marker,
I和2為兩個不同重組陽性質(zhì)粒pMVAXr-pGMCSF的&0RI/ZA0I雙酶切結(jié)果；
圖4為本發(fā)明重組質(zhì)粒pMVAXf-pGMCSF表達(dá)的pGMCSF的Western_blot檢測，其中 泳道I為空載體質(zhì)粒PVAXf轉(zhuǎn)染HEK-293A后Western-blot檢測條帶，
泳道2為改造的空載體質(zhì)粒pMVAXf轉(zhuǎn)染HEK-293A后Western-blot檢測條帶，
泳道 3 為 pVAXf-pGMCSF 轉(zhuǎn)染 HEK-293A 后 Western-blot 檢測條帶，
泳道 4 為 pMVAXf-pGMCSF 轉(zhuǎn)染 HEK-293A 后 Western-blot 檢測條帶；
圖5為通過骨髓細(xì)胞增殖試驗測定的重組質(zhì)粒pMVAXl°-pGMCSF表達(dá)的pGMCSF生物學(xué)活性；
圖6為重組質(zhì)粒pMVAXl°-pGMCSF表達(dá)的pGMCSF對PRRSV滅活疫苗中和抗體的增強作
用；
圖7為通過外周血淋巴細(xì) 胞增殖試驗測定的重組質(zhì)粒pMVAXf-pGMCSF表達(dá)的pGMCSF對PRRSV滅活疫苗細(xì)胞免疫的增強作用。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因進(jìn)行進(jìn)一步說明。.將真核質(zhì)粒ρνΑΧΓ改造為PMVAXle 1.1插入基因的人工合成
參考GenBank公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列(GenBank No: V00882),在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入Τ7啟動子序列和&0RI酶切位點，將這段基因序列拼接在一起交由TaKaRa公司人工合成，具體編碼的包含Rabbit β -Globin Intron II基因的核苷酸序列見序列表中序列I,并克隆入T載體。所述pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為 5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，,
所述 Π 啟動子序列為 5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ；
1.2 pMVAXf的構(gòu)建及鑒定
從T載體上5^1/^boRI雙酶切目的基因并膠回收，與同樣經(jīng)過5^1/^boRI雙酶切的真核質(zhì)粒pVAXl°并膠回收的載體片段在16° C過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，37° C過夜培養(yǎng)16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37° C過夜振蕩培養(yǎng)，第二天提取質(zhì)粒，進(jìn)行5^1/^boRI雙酶切鑒定，鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為pMVAXf，見圖2，交由TaKaRa公司測序，插入的基因片段序列與序列表中序列I相吻合。.pGMCSF蛋白的基因克隆入PMVAXle2.1引物的設(shè)計及合成
根據(jù)GenBank公布的pGMCSF的基因序列(GenBank n0.NM_213861),設(shè)計一對擴(kuò)增pGMCSF蛋白的基因序列的特異性引物，在上游引物pGMCSF-Fwd的5’端引入&0RI限制性內(nèi)切酶位點和Kozak序列，在下游引物pGMCSF-Rev的5’端引入通ol限制性內(nèi)切酶位點，引物序列如下:
pGMCSF-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGCTCCCACCCGCCCA-3’，pGMCSF-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTACTTTTTGACTGGCCCC-3’，
兩條引物pGMCSF-Fwd和pGMCSF-Rev橫跨pGMCSF蛋白編碼區(qū)，預(yù)計擴(kuò)增片段長度為418bp,引物由TaKaRa公司合成。2.2豬脾淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)及總RNA的提取
無菌采集約克豬的脾，用淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞，用10%胎牛血清的1640液在37° C、含CO2 5v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素(PHA)刺激12h后，用TRIzoI試劑提取總RNA，作為RT-PCR的模板。2.3 RT-PCR 擴(kuò)增
以RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶01 igo d (T)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，pGMCSF-Fwd和pGMCSF-Rev為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為 25μ ，含 cDNA lPL，Mg2+ 1.5mmol/L,dNTP 200Mmol/L,IOXLA PCR Buffer 2.5μ , pGMCSF-Fwd 和 pGMCSF-Rev 的濃度均為 400nmol/L，TaKaRa LATaq 2U。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95° C 5min ;然后進(jìn)行35個循環(huán)，循環(huán)條件為95° C 45s,60° C 45s, 72° C 45s;然后72° C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收獲得PGMCSF蛋白基因的PCR產(chǎn)物。2.4重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
用feoRI/ZAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得到包含序列I的載體基因片段1，pGMCSF的蛋白基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pGMCSF蛋白的基因片段2，將載體基因片段I和基因片段2連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，37° C過夜培養(yǎng)16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37° C過夜振蕩培養(yǎng)，第二天提取質(zhì)粒，進(jìn)行feoRI/ZAoI雙酶切鑒定。鑒定為陽性的質(zhì)粒pMVAXl°-pGMCSF交由TaKaRa公司測序，酶切鑒定結(jié)果如圖3所示。構(gòu)建過程示意圖如圖1所示。用Vector NTI和DNAStar軟件分析所插入的基因序列和推導(dǎo)氨基酸序列，相比較于真核質(zhì)粒pVAXl°，pMVAXl°-pGMCSF中插入的核苷酸序列如序列表中序列2所示，推導(dǎo)氨基酸序列如序列表中序列3所示。 重組真核質(zhì)粒pMVAXl°-pGMCSF的表達(dá)鑒定
3.1重組質(zhì)粒pMVAXf-pGMCSF轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞HEK-293A
實驗組:具體操作按Lipofectamine 2000 (Invitrogen)說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染在6孔細(xì)胞板上進(jìn)行，在轉(zhuǎn)染的前一天，消化HEK-293A細(xì)胞，用10%的胎牛血清DMEM(不含抗生素)稀釋細(xì)胞，使其密度達(dá)到2.5 X IO5個細(xì)胞/mL，在6孔細(xì)胞板上每孔接種2.5mL,于37° C、含C025v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在滅菌的1.5mL的離心管中先加入500μ 37° C預(yù)熱的OPT1-MEM無血清培養(yǎng)基，然后加入1.θμδ的重組質(zhì)粒pMVAXf-pGMCSF，輕輕混勻；在另一個滅菌的
1.5mL的離心管中先加入500μ 37° C預(yù)熱的OPT1-MEM無血清培養(yǎng)基，然后加入2.5μ Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑,輕輕混勻,在 室溫放置5min ;然后將兩個1.5mL的離心管中的液體混勻在一起，室溫放置20min ;從CO2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，棄去上清，把液體混合物輕輕加入到細(xì)胞面上，然后立即把細(xì)胞板放入CO2培養(yǎng)箱中；溫育6h后，吸掉上清，輕輕加入2.0mL 37° C預(yù)熱的10%的胎牛血清DMEM，放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后反復(fù)凍融細(xì)胞轉(zhuǎn)染物2次，12000rpm離心5min，得到凍融裂解上清，待檢。對照組1:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為空載體質(zhì)粒pVAXl°，其余方法同實驗組一致，作為對照。對照組2:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為改造的空載體質(zhì)粒pMVAXl°，其余方法同實驗組一致，作為對照。對照組3:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為pVAXl°-pGMCSF，其余方法同實驗組一致，作為對照。所述pVAXl°-pGMCSF為在真核質(zhì)粒載體pVAXl°中只插入pGMCSF基因，而不插入Rabbit β -Globin Intron II 基因。3.2 重組質(zhì)粒 pMVAXf-pGMCSF 表達(dá)的 pGMCSF 的 Western-blot 檢測
參照Bio-Rad公司半干轉(zhuǎn)印儀操作說明進(jìn)行電轉(zhuǎn)印，然后進(jìn)行免疫檢測。將麗春紅染色后的NC膜轉(zhuǎn)移至封閉液中，室溫輕搖Ih后4° C封閉過夜；傾去封閉液，用洗滌液TBST洗膜5次,每次5 min,然后加入pGMCSF單克隆抗體(R&D Systems公司),室溫下振蕩Ih ;再用TBST洗膜5次，每次5min，然后加入以封閉液1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，室溫振蕩Ih ;再用TBST洗膜5次,每次5min,最后用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(Supersignal WestPico Trial Kit)進(jìn)行顯色，在X膠片上曝光、顯影和定影觀察。試驗同時設(shè)立β-actin對照，一抗為β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司)，二抗為1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP。
經(jīng)檢測，pGMCSF得到了正確的表達(dá)，分子量約25kD。pMVAXf-pGMCSF表達(dá)的 pGMCSF 明顯高于 pVAXf-pGMCSF。經(jīng)過 Bio-Rad ChemiDoc XRS System 分析，pMVAXl°-pGMCSF 表達(dá)的 pGMCSF 的量是 pVAXl°-pGMCSF 的 7.6 倍(提高了 6.6 倍)。對照組 I和對照組2均無表達(dá)。如圖4所示。3.3重組質(zhì)粒pMVAXf-pGMCSF表達(dá)的pGMCSF生物學(xué)活性檢測
參考Maliszewski等方法，采用骨髓細(xì)胞增殖試驗測定GMCSF的活性。步驟如下:
無菌取出豬股骨，將其用高壓滅菌的手術(shù)骨鉗橫斷，用滅菌鑷子從橫斷面插入，使之形成較大空隙，然后將滅菌的PBS (雙蒸水配制)加入空隙中，反復(fù)吹打，使骨髓細(xì)胞均勻分布在PBS中；將骨髓細(xì)胞懸液置于IOmL的滅菌離心管中，1500 2000rpm離心5 IOmin ;吸去上清液，沉淀經(jīng)PBS重懸后，用紅細(xì)胞裂解液裂解15 30min，以1500 2000rpm離心5 lOmin，沉淀即得所需的骨髓細(xì)胞；
細(xì)胞計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至7.5 X IO5個/mL ;鋪板，將細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞板中，IOOPL/孔；加入10倍比稀釋的ΗΕΚ-293Α細(xì)胞凍融裂解上清，100 /孔，每個稀釋度重復(fù)3個孔；37° C下培養(yǎng)7d,然后用MTT法測定細(xì)胞的增殖程度，測定OD57tol的值，計算刺激指數(shù)SI = HEK-293A細(xì)胞凍融裂解上清的刺激孔的OD值/只含DMEM完全培養(yǎng)基的未刺激孔的OD值。使用上述步驟3.1中得到的上清稀釋后分別進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖5。從圖中可以看出pMVAXl°-pGMCSF表達(dá)的pGMCSF具有很高的生物學(xué)活性，1:25稀釋時濃度太高具有副作用，1:200稀釋時活性最高，隨著稀釋度的提高呈劑量依賴性，刺激骨髓細(xì)胞增殖的最小劑量為1:1600稀釋；而pVAXl°-pGMCSF表達(dá)的pGMCSF刺激骨髓細(xì)胞增殖的最小劑量為1:200稀釋。 重組真核質(zhì)粒表達(dá)的pGMCSF對高致病性PRRSV滅活疫苗免疫應(yīng)答的增強作用
4.1豬體實驗分組
選取3周齡的健康仔豬(豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌等均為抗原陰性和抗體陰性)50頭，每組5頭。實驗組:將pMVAXf-pGMCSF 500ug/頭與高致病性PRRSV滅活疫苗(SD-JN株，由本實驗室自行制備，制備方法同高致病性豬藍(lán)耳病滅活苗NVDC-JXAl株)I頭份合用免疫3周齡的健康仔豬，頸部肌肉注射。一免后28天，以相同的劑量方法加強免疫一次。于一免后28天(二免前)、一免后42、56天分別采血測定中和抗體；一免后42、56天分別采集肝素抗凝血，用PRRSV SD-J N株濃縮抗原進(jìn)行刺激，MTT法測定外周血淋巴細(xì)胞增殖活性。對照組1:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為pVAXl°-pGMCSF，其余方法同實驗組—致。對照組2:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為PBS，其余方法同實驗組一致。對照組3:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為空載體質(zhì)粒pVAXl°，其余方法同實驗
組一致。對照組4:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為改造的空載體質(zhì)粒pMVAXl°，其余方
法同實驗組一致。對照組5:僅注射PBS，不注射滅活苗。對照組6:僅按照500ug/頭的劑量注射空載體質(zhì)粒pVAXl°，不注射滅活苗。對照組7:僅按照500ug/頭的劑量注射空載體質(zhì)粒pMVAXl°，不注射滅活苗。對照組8:僅按照500ug/頭的劑量注射pVAXl°-pGMCSF，不注射滅活苗。對照組9:僅按照500ug/頭的劑量注射pMVAXl°-pGMCSF，不注射滅活苗。4.2體液免疫反應(yīng)檢測
如圖6，經(jīng)檢測，一免后42、56天實驗組的中和抗體顯著高于對照組1，平均中和抗體在一免后42天實驗組為1:16，對照組I為1:9 ;在一免后56天實驗組為1:26，對照組I為1:13 ;對照組2-4產(chǎn)生的中和抗體很低，為滅活疫苗產(chǎn)生的中和抗體，一免后42天為1:4，一免后56天為1:8，對照組5-9無中和抗體產(chǎn)生。4.3細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測
如圖7，經(jīng)檢測，一免后42、56天實驗組的PRRSV特異性的外周血淋巴細(xì)胞增殖活性顯著高于對照組1，而對照組I也顯著高于對照組2-9。
權(quán)利要求
1.一種聞效表達(dá)的豬粒細(xì)胞巨曬細(xì)胞集落刺激因子基因，其核昔酸序列如序列表中序列2所示。
2.—種權(quán)利要求1所述序列2的基因通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆至真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒。
3.—種權(quán)利要求1所述的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的合成方法，其特征是包括以下步驟: (1)將真核質(zhì)粒pVAXf改造為pMVAX廣:由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882,在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和&oRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列I所示,將此段基因序列通過5^1/^boRI酶切位點插入pVAXf載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，提取質(zhì)粒經(jīng)篩選得到SstV雙酶切陽性克隆，命名為PMVAXle ； 所述 pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為:5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，, 所述 17 啟動子序列為:5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ； (2)構(gòu)建表達(dá)pGMCSF的重組真核質(zhì)粒pMVAXl°-pGMCSF: ①設(shè)計一對擴(kuò)增PGMCSF基因 序列的特異性引物，引物序列如下:pGMCSF-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGCTCCCACCCGCCCA-3’，pGMCSF-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTACTTTTTGACTGGCCCC-3’， 在上游引物pGMCSF-Fwd的5’端引入&oRI限制性內(nèi)切酶位點和Kozak序列，在下游引物pGMCSF-Rev的5’端引入通ol限制性內(nèi)切酶位點； ②從豬的脾臟提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出pGMCSF基因的PCR產(chǎn)物； ③用feoRI/ZAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得包含序列I的載體基因片段l，pGMCSF基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pGMCSF蛋白的基因片段2，將載體基因片段I和基因片段2連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行/ZAoI雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得pMVAXl°-pGMCSF，真核質(zhì)粒PVAXl0中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟②中PCR反應(yīng)體系為25μ ，含cDNA μ , Mg2+ 1.5mmol/L, dNTP 200Mmol/L，10X LA PCR Buffer 2.5μ ，pGMCSF-Fwd和pGMCSF-Rev 濃度均為 400nmoI/L，TaKaRa LA Taq 2U ;反應(yīng)條件為:預(yù)變性 95。C 5min，然后進(jìn)行35個循環(huán)，循環(huán)條件為95° C 45s，60° C 45s, 72° C 45s;然后72° C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。
5.一種權(quán)利要求1所述的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的表達(dá)蛋白在增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中基因表達(dá)領(lǐng)域，特別涉及一種高效表達(dá)的豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因，如序列表中序列2所示，還涉及豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)蛋白在增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。含有序列表中序列2的真核質(zhì)粒pMVAX1 表達(dá)pGMCSF蛋白基因，突破了通過pVAX1 載體表達(dá)pGMCSF過程中遇到的表達(dá)量較低和活性較差的局限性，表達(dá)量提高了6.6倍；豬體試驗證明，序列表中序列2基因的表達(dá)蛋白pGMCSF表達(dá)活性很高，能夠顯著增強高致病性PRRSV滅活疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，專用于對高致病性PRRSV引起的疾病的預(yù)防及減少豬場的經(jīng)濟(jì)損失。
文檔編號A61P31/14GK103194455SQ20131011903
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者杜以軍, 齊靜, 王金寶, 吳家強, 黃保華, 郭立輝, 陳蕾, 叢曉燕, 孫文博, 任素芳, 李俊, 時建立, 呂偉 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所