專利名稱：一種食管癌相關(guān)基因-4的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食管癌相關(guān)基因，更具體的說涉及一種食管癌相關(guān)基因-4的用途，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食管癌相關(guān)基因-4 (ECRG4)最初是Bi等人識別并克隆，他們發(fā)現(xiàn)與正常成人食管上皮相比，食管鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中ECRG4的表達(dá)明顯降低。因此，認(rèn)為ECRG4可能是一種新的候選腫瘤抑制基因。近年來對于食管癌相關(guān)基因_4 (ECRG4)在食道癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤和前列腺癌中的研究也較多。如李林蔚等在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)博士研究生學(xué)位論文中披露的一種食管癌相關(guān)基因4在食管鱗狀細(xì)胞癌中的功能研究中提及的ECRG4是食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的候選抑癌基因，認(rèn)為啟動子高甲基化可能是ECRG4在ESCC轉(zhuǎn)錄失活的主要機(jī)制，認(rèn)為ECRG4可能是通過參與NF- κ B通路調(diào)控C0X-2的表達(dá)來發(fā)揮其抑癌功能，可以作為ESCC的潛在治療藥物。但是，現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于ECRG4的報道均是針對ECRG4在抑癌作用方面的研究，并沒有報道ECRG4在預(yù)防或治療肝炎(如丙肝)中應(yīng)用的相關(guān)文獻(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種食管癌相關(guān)基因-4 (ECRG4)的新的用途，能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)防或治療肝炎的技術(shù)效果。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的，一種食管癌相關(guān)基因_4的用途，所述的食管癌相關(guān)基因_4用于預(yù)防或治療肝炎。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)食管癌相關(guān)基因-4 (ECRG4)在肝炎病毒感染的患者外周血單個核細(xì)胞中低表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ECRG4基因啟動子區(qū)甲基化是ECRG4在肝炎病毒感染細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)的原因。因此，本發(fā)明通過研究ECRG4對肝炎的預(yù)防或治療作用，發(fā)現(xiàn)將ECRG4基因轉(zhuǎn)入肝炎感染細(xì)胞，能夠逆轉(zhuǎn)肝炎病毒的免疫逃避，促進(jìn)免疫細(xì)胞對肝炎病毒感染細(xì)胞的識別和殺傷作用，從而達(dá)到抗感染的目的，實現(xiàn)預(yù)防或治療的作用。在上述的食管癌相關(guān)基因-4的用途中，作為優(yōu)選，所述的食管癌相關(guān)基因_4(ECRG4)用于預(yù)防或治療丙肝。在上述的食管癌相關(guān)基因_4的用途中，作為優(yōu)選，所述食管癌相關(guān)基因_4通過克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.1得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4后用于預(yù)防或治療丙肝。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4能夠作為一個分子藥，同樣能夠促使ECRG4過表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞對丙肝病毒(HCV)感染細(xì)胞的識別和殺傷作用，實現(xiàn)預(yù)防或治療丙肝的效果。在上述的食管癌相關(guān)基因_4的用途中，作為優(yōu)選，所述的食管癌相關(guān)基因_4(ECRG4)用于使免疫細(xì)胞識別和殺傷丙肝病毒感染細(xì)胞。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:
本發(fā)明的食管癌相關(guān)基因-4 (ECRG4)的新用途，與現(xiàn)有的將ECRG4用于抑癌的用途不同，本發(fā)明的ECRG4基因轉(zhuǎn)入肝炎病毒(尤其是HCV)感染細(xì)胞后，能夠逆轉(zhuǎn)肝炎病毒(尤其是HCV)的免疫逃避，促進(jìn)免疫細(xì)胞對肝炎病毒感染細(xì)胞(尤其是HCV感染細(xì)胞)的識別和殺傷作用，從而達(dá)到抗感染(尤其是HCV感染)的目的，實現(xiàn)預(yù)防或治療肝炎的效果，優(yōu)選情況下，本發(fā)明所述的ECRG4誘發(fā)免疫細(xì)胞識別和殺傷丙肝病毒(HCV)感染細(xì)胞，實現(xiàn)預(yù)防或治療丙肝的效果。
圖1是本發(fā)明實施例中的丙肝患者和正常人的外周血單個核細(xì)胞內(nèi)的ECRG4表達(dá)的檢測結(jié)果圖。圖2是現(xiàn)有的pcDNA3.1的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是本發(fā)明的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4是本發(fā)明對照組的CTL殺傷實驗檢測結(jié)果圖。圖5是本發(fā)明實驗組的CTL殺傷實驗檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
和附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明，但是本發(fā)明并不限于這些實施例。本發(fā)明的食管癌相關(guān)基因-4的用途，所述的食管癌相關(guān)基因_4 (ECRG4)用于預(yù)防或治療肝炎。作為優(yōu)選，所述的食管癌相關(guān)基因_4 (ECRG4)用于預(yù)防或治療丙肝；更進(jìn)一步的優(yōu)選，通過將食管癌相關(guān)基因_4克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4后再用 于預(yù)防或治療丙肝。更具體的說，通過將本發(fā)明的ECRG4基因轉(zhuǎn)入HCV感染細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)HCV感染細(xì)胞的免疫逃避，實現(xiàn)促進(jìn)免疫細(xì)胞對HCV感染細(xì)胞的識別和細(xì)胞殺傷，從而達(dá)到抗HCV感染的目的，實現(xiàn)預(yù)防或治療丙肝的效果。以下更進(jìn)一步說明ECRG4基因能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)防或治療丙肝的作用。一.丙肝患者外周血單個核細(xì)胞內(nèi)ECRG4檢測取20份丙肝病毒(HCV)陽性患者肝素抗凝的外周血(以健康體檢的正常人外周血做對照)，將HCV患者肝素抗凝的外周血(以體檢健康的正常人外周血做對照)和淋巴細(xì)胞分離液加入離心管中，采用常規(guī)的方法進(jìn)行密度梯度離心分離外周血淋巴細(xì)胞，以 RIPA 緩沖液(25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM EDTA, l%Triton-X-100, 1% 脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate) , 0.1%SDS, pH7.4)裂解細(xì)胞，加入IX蛋白酶抑制劑(購買自Pierce公司，美國)，在3500r/min且控制溫度在4°C的條件下進(jìn)行離心IOmin,取上清。然后利用Bio-Rad分析試劑盒(購買自Bio-Rad公司，美國)來檢測蛋白濃度。以ant1-ECRG4(l:400,購買自 Sigma 公司，美國)和 β-actin (1:10000，購買自 Sigma 公司，美國)為一抗，40 μ g的上樣量來進(jìn)行Western blot檢測，檢測其中ECRG4蛋白表達(dá)情況，具體分析結(jié)果如圖1所示。二.HCV感染的胎肝細(xì)胞制備1.培養(yǎng)人胎肝細(xì)胞取凍存的人胎肝細(xì)胞，經(jīng)37°C復(fù)蘇后，加入含有10%胎牛血清的DMEM (購買自Gibco公司)5mL，在1000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心5分鐘，去除凍存液，加入含有10%胎牛血清的DMEM，在37°C，5%C02的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到人胎肝細(xì)胞。2.HCV感染胎肝細(xì)胞取上述培養(yǎng)的人胎肝細(xì)胞以I X IO5細(xì)胞/孔的濃度種入6孔培養(yǎng)板，以含有10%胎牛血清的DMEM為培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)過夜,然后,加入丙肝病毒(HCV)陽性患者血清0.5ml,以正常人血清做對照，進(jìn)行體外感染人胎肝細(xì)胞，并以含有10%胎牛血清DMEM補足培養(yǎng)液，感染4h后，棄去培養(yǎng)上清，采用PBS緩沖液清洗4次后，加入含有10%胎牛血清的DMEM再進(jìn)行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24h、48h和72h時取培養(yǎng)細(xì)胞采用常規(guī)的免疫組化及RT-PCR加以鑒定即可，得到感染有HCV的人胎肝細(xì)胞。三.ECRG4過表達(dá)人胎肝細(xì)胞制備1.ECRG4表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的參考序列NM_032411.2(C2orf40):以上游引物5’ -GCGGATCCCTGCCTCCCCCGCGCG-3’，和下游引物 5’ -CTAGCGGCCGCACAGCGTGTGGCAAGTCATGGT-3’為引物對，通過PCR擴(kuò)增從人乳腺組織中擴(kuò)增ECRG4基因片段，基因長度517bp，上述PCR擴(kuò)增的條件為94°C變性5min后，進(jìn)入循環(huán)程序，所述的循環(huán)程序為:94°C變性30秒，60°C退火30，72°C延伸I分鐘，共循環(huán)25次，然后再在72°C延伸lOmin，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，再經(jīng)BamHI和Notl酶切后，克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒p cDNA3.1的BamHI和Notl酶切位點，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4，將該重組質(zhì)粒經(jīng)酶切加以鑒定,具體的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4的結(jié)構(gòu)如圖2所示。2.ECRG4過表達(dá)的人胎肝細(xì)胞制備取上述感染有HCV的人胎肝細(xì)胞以I X IO5細(xì)胞/孔的濃度種入6孔培養(yǎng)板，以含有10%胎牛血清的DMEM為培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)過夜，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50%-80%融合時，在轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6(購買自Roche公司，美國)的輔助下，用質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4 (以空白質(zhì)粒pcDNA3.1做對照)去轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染8h后棄去培養(yǎng)上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后用600mg/L的G418 (購買自Sigma公司)來篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，即ECRG4過表達(dá)的人胎肝細(xì)胞。四.ECRG4抑制丙肝病毒(HCV)感染將淋巴細(xì)胞分離液和HCV感染患者的肝素抗凝的外周血加入離心管中，然后采用常規(guī)的方法進(jìn)行密度梯度離心提取HCV感染患者的外周血單個核細(xì)胞，以此細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞；另外，以上述pcDNA3.1-ECRG4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的感染有HCV的人胎肝細(xì)胞為靶細(xì)胞(以轉(zhuǎn)染有空白質(zhì)粒的細(xì)胞做對照)，以效靶比為5:1進(jìn)行細(xì)胞殺傷實驗，24h后，消化所有的細(xì)胞，經(jīng)PI染色后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞殺傷情況。具體的檢測結(jié)果如圖4和圖5所示。五.丙肝外周血單個核細(xì)胞中ECRG4啟動子區(qū)的甲基化情況分析取丙肝外周血單個核細(xì)胞樣本及體檢健康的正常人外周血淋巴細(xì)胞標(biāo)本各15個樣本，提取基因組DNA,取0.5 2 μ g的DNA經(jīng)EZ DNA Methylation Kit (購買自ZYMO Research公司，美國)處理后，選取ECRG4啟動子區(qū)特異性引物M-C2orf40-F:5’ -TGGGTTTTYGGAATTTAGTTTG-3’ 和 M_C2orf40-R: 5’ -RATCAAAACCAAAACAACAAACC-3’ 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAquick PCR Purification Kit (購買自QIAGEN公司，美國)純化后連入T載體(購買自上海生工生物工程有限公司)，然后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)(Invitrogen, San Francisco, CA, USA),從每個樣本隨機(jī)挑取10個克隆,采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序，采用常規(guī)的方法測序即可，本實施例中的測序由上海生工生物工程有限公司完成。然后分析ECRG4啟動子區(qū)CpG島，與對照相比，高于均值二倍的被認(rèn)為是甲基化。測序結(jié)果顯示，丙肝外周血單個核細(xì)胞中ECRG4啟動子區(qū)的甲基化比例非常高，15個樣本全部有不同程度的甲基化，而正常對照組則無甲基化出現(xiàn)，差異十分顯著，P< 0.05。因此，可以看出ECRG4啟動子區(qū)的甲基化是ECRG4在HCV感染細(xì)胞中低表達(dá)的原因。以下是對實驗結(jié)果的具體分析，從圖1中可以看出，證實了 HCV患者外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)ECRG4的表達(dá)水平明顯低于正常對照，差異顯著，P < 0.05。圖2是現(xiàn)有的pcDNA3.1的結(jié)構(gòu)示意圖，圖3是重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4的結(jié)構(gòu)示意圖。從圖5可以看出，HCV感染患者的外周血單個核細(xì)胞對ECRG4過表達(dá)組(實驗組)的殺傷比例為43.63%，顯著高于圖4所示的對照組的殺傷比例10.87%，P < 0.05。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4介導(dǎo)ECRG4轉(zhuǎn)基因入胎肝細(xì)胞，逆 轉(zhuǎn)了 HCV的免疫逃避，誘發(fā)了免疫細(xì)胞對HCV感染細(xì)胞的識別和殺傷作用，從而也說明了所述的ECRG4能夠預(yù)防或治療丙肝的效果。以上實驗結(jié)果采用常規(guī)的SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間差異進(jìn)行t檢驗。本發(fā)明中所描述的具體實施例僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。盡管對本發(fā)明已作出了詳細(xì)的說明并引證了一些具體實施例，但是對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，只要不離開本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。
權(quán)利要求
1.一種食管癌相關(guān)基因-4的用途，其特征在于，所述的食管癌相關(guān)基因-4用于預(yù)防或治療肝炎。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食管癌相關(guān)基因_4的用途，其特征在于，所述的食管癌相關(guān)基因-4用于預(yù)防或治療丙肝。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的食管癌相關(guān)基因_4用途，其特征在于，所述食管癌相關(guān)基因_4通過克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ECRG4后用于預(yù)防或治療丙肝。
4.根據(jù)權(quán)利要求2-3任意一項所述的食管癌相關(guān)基因_4用途，其特征在于，所述的食管癌 相關(guān)基因_4用于使免疫細(xì)胞識別和殺傷丙肝病毒感染細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食管癌相關(guān)基因-4的用途，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。提供一種食管癌相關(guān)基因-4(ECRG4)的新的用途，所述食管癌相關(guān)基因-4用于預(yù)防或治療肝炎，尤其用于預(yù)防或治療丙肝。與現(xiàn)有將ECRG4用于抑癌的用途不同，所述ECRG4基因轉(zhuǎn)入肝炎病毒(尤其是HCV)感染細(xì)胞后，能夠逆轉(zhuǎn)肝炎病毒(尤其是HCV)的免疫逃避，促進(jìn)免疫細(xì)胞對肝炎病毒感染細(xì)胞(尤其是HCV感染細(xì)胞)的識別和殺傷作用實現(xiàn)抗感染(尤其是HCV感染)的目的，實現(xiàn)預(yù)防或治療肝炎的效果。
文檔編號A61P1/16GK103110960SQ20131007011
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者陳佳玉, 劉池波, 王海寶, 金曉燕 申請人:陳佳玉, 劉池波, 王海寶