一種cea陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域,具體公開了一種腺病毒載體介導(dǎo)癌胚抗原CEA抗原肽基因轉(zhuǎn)染制備樹突狀細胞腫瘤疫苗的方法，a.構(gòu)建載有CEA抗原肽基因的穿梭載體質(zhì)粒，并利用293細胞包裝成載有CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA,b.DC細胞的分離,培養(yǎng)和鑒定,c.利用重組腺病毒AD-CEA轉(zhuǎn)染DC細胞，獲得AdCEA-DC疫苗,c.AdCEA-DC疫苗的細胞學實驗。本發(fā)明利用腺病毒作為基因載體，將CEA抗原肽基因高效轉(zhuǎn)入DC細胞，通過內(nèi)源性內(nèi)持續(xù)刺激獲得了具有高效呈遞癌胚抗原CEA抗原肽能力的DC疫苗，并可以誘導(dǎo)特異性的CTL，解決了現(xiàn)有技術(shù)獲得的DC疫苗呈遞抗原能力較弱，特異性不強的問題。
【專利說明】一種CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域。具體涉及了一種腺病毒載體介導(dǎo)癌胚抗原CEA抗原肽基因轉(zhuǎn)染制備CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌和大腸癌是目前我國發(fā)病率很高的惡性腫瘤，胃癌占消化道惡性腫瘤的第一位，大腸癌發(fā)病率已經(jīng)上升到第四位。目前大腸癌，胃癌首選的有效治療方法仍是手術(shù)切除，但切除率較低，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移較高。術(shù)后綜合治療以放療，化療為主，但毒副作用大，患者往往難以接受。因此，胃癌和大腸癌預(yù)后欠佳，需要尋找新的更有效的治療方法。
[0003]隨著科學的不斷進展，腫瘤的生物治療異軍突起，已經(jīng)成了繼手術(shù)，放療，化療后的第四大腫瘤治療技術(shù)，在改善患者生存質(zhì)量，降低復(fù)發(fā)率方面的重要作用已經(jīng)得到越來越多的認可和重視。樹突細胞(dendritic cells, DC)是人體內(nèi)功能最強大的專職抗原呈遞細胞(antigen process cells, APC),能誘導(dǎo)出抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反應(yīng),在人體抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用。DC細胞表面的MHC分子可以和腫瘤抗原結(jié)合，然后遞呈給T細胞，誘導(dǎo)T細胞活化，激活初始免疫應(yīng)答，在體內(nèi)發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。因此自從DC強大的遞呈抗原功能被發(fā)現(xiàn)以來，就得到了人們的廣泛關(guān)注，目前國內(nèi)外圍繞以DC為核心的抗腫瘤免疫治療研究積累了大量的經(jīng)驗。不過盡管以DC為基礎(chǔ)的免疫治療副作用輕微，能誘導(dǎo)出一定的抗腫瘤免疫反應(yīng)，多數(shù)研究所獲得的臨床效果還是 有限。
[0004]癌胚抗原(CEA)是一種廣為人知的廣譜腫瘤標志物。最早是在1965年由加拿大學者Gold和Freedman首先從胎兒結(jié)腸及結(jié)腸癌的提取物中發(fā)現(xiàn)，在多種類型的腫瘤上都有表達。人們把有CEA表達的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90%以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70%以上的非小細胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標。CEA在正常組織、癌組織和胚胎中表現(xiàn)出復(fù)雜的表達模式，尤其是CEA表現(xiàn)出選擇性的上皮細胞表達。盡管CEA在一些正常組織中也有微量存在，但它在腫瘤組織中的表達遠遠高于正常組織。因此CEA是一種比較理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對CEA的免疫應(yīng)答，故而人們一直尋求多種途徑增強CEA的免疫原性。
[0005]癌胚抗原(CEA)是一種廣為人知的廣譜腫瘤標志物。最早是在1965年由加拿大學者Gold和Freedman首先從胎兒結(jié)腸及結(jié)腸癌的提取物中發(fā)現(xiàn)，在多種類型的腫瘤上都有表達。人們把有CEA表達的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90%以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70%以上的非小細胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標。CEA在正常組織、癌組織和胚胎中表現(xiàn)出復(fù)雜的表達模式，尤其是CEA表現(xiàn)出選擇性的上皮細胞表達。盡管CEA在一些正常組織中也有微量存在，但它在腫瘤組織中的表達遠遠高于正常組織。因此CEA是一種比較理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對CEA的免疫應(yīng)答，故而人們一直尋求多種途徑增強CEA的免疫原性。
[0006]目前腫瘤的基因治療也已經(jīng)成了一個熱點。腺病毒是一種DNA雙鏈無包膜病毒，基因組為36kb，基因背景清楚，在美國應(yīng)用多年，證明對人體是無害的。腺病毒載體以其宿主范圍廣，轉(zhuǎn)染效率高，不整合到宿主基因組中，僅瞬時表達，安全性高，易制備高滴度腺病毒等優(yōu)點而成為人類基因治療中最理想的病毒載體之一。一般將El或E3基因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體，El基因缺失喪失復(fù)制能力，但可以在El補償細胞如293細胞中復(fù)制。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]針對現(xiàn)階段應(yīng)用常規(guī)方法所誘導(dǎo)的DC細胞受腫瘤免疫抗原性強度影響大，免疫激發(fā)力較弱等方面的不足。本發(fā)明提供了一種腺病毒載體介導(dǎo)癌胚抗原CEA抗原肽基因轉(zhuǎn)染制備DC細胞疫苗的方法，使獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗具有更強的免疫激發(fā)能力，并且不需要制備腫瘤抗原，讓DC疫苗的制備不再受腫瘤細胞來源較少，抗原蛋白成本較高的限制。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，設(shè)計一種一種CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，該方法由以下步驟組成:
a.構(gòu)建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA；
b.分離和培養(yǎng)DC細胞；
c.采用重組腺病毒AD-CEA轉(zhuǎn)染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC。
[0009]在所述的步驟(a)中將載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，培養(yǎng)至出毒，得到原代毒種；用原代毒種感染293細胞，待2-3天細胞病變后，進行濃縮純化，獲得擴增后的重組腺病毒AD-CEA。
[0010]在所述的步驟(b)中的DC細胞包括下列細胞:外周血單個核細胞培養(yǎng)的DC細胞，骨髓來源的DC細胞，臍帶血來源的DC細胞。
[0011]在所述的步驟(C)中，包括以下步驟:
Cl:采用步驟A中制備的重組腺病毒AD-CEA病毒液感染步驟B中制備的DC細胞；
C2:采用含有GM-GSF和IL-4的完全培養(yǎng)液，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)步驟Cl中感染后的DC細胞；
C3:到第5天，在步驟C2中培養(yǎng)的DC細胞中加入TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)3天，第8天獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗AdCEA-DC，光鏡下形態(tài)學鑒定，并用流式細胞儀檢測細胞表型 CDla，CD80，CD83，CD86，HLA-DR0
[0012]所述的步驟A中所述的重組腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，該病毒缺失El區(qū)和E3區(qū)，并且在El區(qū)位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表達盒，該表達盒依次包括:啟動子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因編碼序列，聚腺苷酸信號序列。
[0013]所述的步驟A中所述的癌胚抗原CEA抗原肽，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:1所
/Jn ο
[0014]所述的步驟C中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，是通過腺病毒為載體將癌胚抗原CEA抗原肽基因轉(zhuǎn)入DC細胞中獲得的，可以表達癌胚抗原CEA抗原肽基因。
[0015]所述的步驟C獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA_DC，CEA抗原肽基因陽性表達率在20%-100%。
[0016]所述的步驟C中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC可誘導(dǎo)出對CEA表達陽性腫瘤細胞有特異性殺傷作用的CTL。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，所述的載有CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA是通過AdMax系統(tǒng)包裝得到的。所述的DC細胞是采用Ficoll密度梯度離心法分離收集人的外周血單個核細胞，培養(yǎng)l_2h后棄取懸浮細胞，留下貼壁細胞得到的。所述的GM-GSF的濃度為1000U/mL，IL-4的濃度為1000U/mL，TNF-a的濃度為200U/mL。從用腺病毒AD-CEA感染分離到的DC細胞到CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC的成熟需培養(yǎng)8天。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明創(chuàng)新優(yōu)越之處有以下幾點:首先，首次使用腺病毒載體介導(dǎo)癌胚抗原CEA抗原肽基因轉(zhuǎn)染制備樹突狀細胞，獲得了 CEA陽性腫瘤特異性的DC疫苗；其次，所使用的癌胚抗原CEA抗原肽基因相對CEA全長基因選擇了有效序列，具有更強的特異性；再者，只是將腺病毒作為一個載體來轉(zhuǎn)染DC細胞，獲得成熟的DC疫苗后再用于人體，避免了腺病毒作為基因藥物直接用于人體可能導(dǎo)致的不良免疫反應(yīng)；另外，轉(zhuǎn)入DC細胞的抗原基因可以持續(xù)內(nèi)源表達腫瘤抗原，使本發(fā)明具有強大的免疫激發(fā)能力，可以克服腫瘤抗原直接刺激DC細胞后由于抗原復(fù)合物降解對誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答產(chǎn)生的不利影響；而且，不需要制備腫瘤抗原致敏DC細胞，省去了制備抗原的成本，并且對于僅能獲得少量腫瘤細胞，無法大量制備抗原的患者，更具有實用意義；最后，轉(zhuǎn)入的基因具有腫瘤特異性，可避免自身抗原刺激DC細胞造成自身免疫疾病的風險。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是質(zhì)粒TOC316的圖譜。 [0020]圖2是腺病毒AD-CEA的產(chǎn)毒照片，細胞變圓，成葡萄狀。
[0021]圖3是普通DC和本方法所制備的CEA陽性腫瘤特異性疫苗AdCEA-DC的光鏡圖片；圖A為對照組DC，圖B為AdCEA-DC，AdCEA-DC表現(xiàn)出成熟DC的形態(tài)，和對照組DC差別不大，更傾向于聚集。
[0022]圖4是流式細胞儀分析三組DC細胞的表面標志表達情況，本發(fā)明制備的DC疫苗AdCEA-DC的⑶80，⑶83，⑶86，⑶la，HLA-DR等表面標志表達高于蛋白致敏組和未致敏對照組。
[0023]圖5是不同組DC細胞誘導(dǎo)的CTL對LoVo，SW620, HGC-27，BEL-7402等腫瘤細胞的殺傷活性，我們所發(fā)明方法制備的疫苗AdCEA-DC對這些CEA陽性腫瘤細胞的殺傷活性更高。*代表和對照DC組相比有顯著差異，**代表和對照DC組相比有極顯著差異。
【具體實施方式】
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進行進一步詳細說明；本申請中的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0025]實施例1:
(一)構(gòu)建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA:
1.構(gòu)建含有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質(zhì)粒H)C316-CEA:CEA的氨基酸序列來自GeneBank公布的CEA氨基酸和核苷酸序列M17303，根據(jù)本公司的預(yù)測結(jié)果，選擇癌胚抗原CEA抗原肽為CEA580-CEA639短肽片段基因，共60個氨基酸，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:1所示。
[0026]根據(jù)GeneBank中的序列設(shè)計引物，進行PCR獲得癌胚抗原CEA抗原肽基因，和PDC316質(zhì)?！緢D1】連接獲得含有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質(zhì)粒H)C316-CEA。
[0027]2.將構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒H)C316-CEA和腺病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，具體步驟如下:
(1)提前一天將293細胞種6孔板，每孔5X105cells/mL密度的細胞2mL，這樣到轉(zhuǎn)染前293細胞的密度約為80% ；
(2)每個轉(zhuǎn)染孔取腺病毒骨架質(zhì)粒4μ g，PDC316-CEA穿梭載體質(zhì)粒I μ g，加300 μ LOpt1-mem無血清培養(yǎng)基混合均勻，室溫放置5min ；
(3)取10μ L脂質(zhì)體Lipofectamine2000用300 μ L Opt1-mem無血清培養(yǎng)基混合均勻，室溫放置5min ；
(4)將兩者混合，室溫放置20min，再將混合物加入細胞中。放在37°C,5% C02培養(yǎng)箱中孵育；
(5)6小時后，更換新鮮的5%血清DMEM培養(yǎng)基。
[0028]3.原代重組腺病毒AD-CEA的收獲，具體步驟如下:
(1)轉(zhuǎn)染后第3天，將長滿的293細胞用胰蛋白酶消化傳代到T25培養(yǎng)瓶中，用5%血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
(2)到第五天的時候補加IOmL新鮮的5%血清DMEM培養(yǎng)基；
(3)約到第7天會觀察到出毒現(xiàn)象，細胞變大變圓，呈葡萄狀【圖2】；
(4)繼續(xù)培養(yǎng)到第11天，細胞大部分病變并脫落，將已出毒的培養(yǎng)瓶放在_70°C冰箱到37°C水浴反復(fù)凍融3次；取凍融液5000r/min離心5min，收集上清即得到原代毒種；
4.重組腺病毒AD-CEA的擴增，具體步驟如下:
(1)提前兩天將293細胞傳代，每個T25瓶放入4X105cells/mL密度的細胞5mL，這樣用于病毒擴增的293細胞密度約為90% ；
(2)將原代病毒取ImL加入瓶中感染293細胞，此時的MOI大約為5；
(3)放在在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天后大部分細胞會發(fā)生病變，呈葡萄狀。收集細胞并重懸于ImL PBS緩沖液；
(4)將細胞重懸液于-70°C冰箱到37°C水浴反復(fù)凍融3次，5000r/min離心5min收集上清，0.22 μ m濾膜過濾后即得到擴增后的重組腺病毒AD-CEA，分裝后儲存在_70°C冰箱。
[0029]
(二)采用重組腺病毒AD-CEA轉(zhuǎn)染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC: 1.DC細胞的獲取和分離，具體步驟如下:
Cl)取人外周血50mL，肝素抗凝，加入50mL生理鹽水得到IOOmL稀釋血液。將IOOmL稀釋血液緩緩加到50mL淋巴細胞分離液上，2000r/min水平離心20min，取中間的白色細胞層即獲得單個核細胞(PBMC)；
(2)用RPMI1640培養(yǎng)基將單個核細胞制成細胞懸液，以4X 106cellS/mL的密度加入6孔培養(yǎng)板中，在37°C，5 % C02條件下培養(yǎng)2h，輕輕洗去懸浮細胞，剩下的細胞即為DC細胞。[0030]2.重組腺病毒AD-CEA轉(zhuǎn)染DC細胞及后續(xù)處理，具體步驟如下:
(1)將剩下的貼壁DC細胞分為3組:基因轉(zhuǎn)染組，蛋白致敏組和未致敏對照組；
(2)基因轉(zhuǎn)染組中洗去懸浮細胞后，加入ImL無血清RPMI1640培養(yǎng)基。然后在其中加入AD-CEA病毒液IOOuL (MOI=IOO),于37°C，5 % C02條件感染5h后，更換成2mL含GM-GSF (1000U/mL)的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基；
(3)其余兩組每孔用2mL含GM-GSF(1000U/mL)的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0031]3.三組細胞的后續(xù)處理，具體步驟如下:
(1)到第三天，三組細胞均加入終濃度為1000U/mL的IL-4，隔天半量更換含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)液；
(2)到第五天各組除了更換含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)液外，蛋白致敏組需加入CEA蛋白(I μ g/mL)每孔IOOuL ;未致敏對照組加入PBS緩沖液每孔100uL。三組同時都要加入終濃度為 200U/mL 的 TNF- α。
[0032]4.重組腺病毒AD-CEA轉(zhuǎn)染獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC的收獲及鑒定，具體步驟如下:
(1)繼續(xù)培養(yǎng)三天，到第八天即成熟【圖3】。收集三組DC細胞，用50mL生理鹽水重懸。1500r/min水平離心10min后,棄上清重新用50mL生理鹽水重懸沉淀細胞,共洗3遍；
(2)最后用適當量生 理鹽水重懸洗過3遍的細胞沉淀，調(diào)整DC細胞密度在5X106cells/mL，獲得三組DC細胞；
(3)DC標志物的鑒定:培養(yǎng)8d的細胞數(shù)為5X106cells/mL的基因轉(zhuǎn)染組DC、蛋白致敏組DC和未致敏組DC各取50 μ L，加入1:20的滅活兔血清10 μ L，4°C冰箱孵育lOmin，分別加入熒光抗體 10 μ L(FITC-ant1-CDla、PE-anti_CD83、FITC-anti_CD80、PE-anti_CD86、PE-ant1-HLA-DR)，4°C暗處反應(yīng)30 min, PBS洗滌3遍后，震蕩懸浮細胞后流式細胞儀檢測其表面標志表達情況【圖4】。
[0033](4)重組腺病毒AD-CEA轉(zhuǎn)染DC效率的檢測:收集基因轉(zhuǎn)染組DC，用PBS緩沖液洗2次，取細胞數(shù)為5X105置于流式細胞儀專用試管中，加入小鼠抗人CEA單抗(I / 200)，二抗用FITC標記的兔抗鼠單抗10uL，4°C冰箱中避光反應(yīng)30 min,再用PBS洗3次，震蕩懸浮細胞后上流式細胞儀分析病毒感染效率。
[0034]
(三)AdCEA-DC疫苗的細胞體外實驗:
1.細胞毒性淋巴T細胞(CTL)的誘導(dǎo)，具體步驟如下:
Cl)以含人血清的RPMI 1640為培養(yǎng)基，取三組不同的DC細胞和自體T淋巴細胞，按DC:T細胞=1:20的比例混合，調(diào)節(jié)細胞濃度為2Χ 106cells/mL，96孔板每孔加入100 μ L ；
(2)使用含有 IL-2 (500U/mL)，GM-GSF(1000U/mL)和 IL-4 (1000U/mL)的 RPMI1640 培養(yǎng)液除繼續(xù)培養(yǎng)5天，期間每隔I天，進行半量換液，獲得3組不同的CTL。
[0035]2.三組CTL對幾種CEA陽性腫瘤細胞的體外特異性殺傷效應(yīng)，具體步驟如下:
(1)收集3組CTL作為效應(yīng)細胞，分別以LoVo(人結(jié)腸癌細胞株)，SW620(人結(jié)腸癌細胞株)，HGC-27 (人胃癌細胞株)為CEA陽性靶細胞，BEL-7402 (人肝癌細胞株)為陰性靶細胞；
(2)取96孔板，將靶細胞以lX105cellS/mL的密度每孔接入100μ L，培養(yǎng)3天后靶細胞長滿，設(shè)定不同的效靶比加入不同的CTL，效靶比為20:1，每種效靶比設(shè)3個復(fù)孔，每孔終體積含培養(yǎng)液200 μ L ;
(3)繼續(xù)在37°C ,5% C02培養(yǎng)箱中孵育44 h，然后每孔加入20 μ L 5mg/mL的MTT混勻。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將培養(yǎng)液吸干，每孔加入二甲基亞砜IOOuL,震蕩15min后在酶標儀上測570 nm處OD值。通過所測OD值，以及單純效應(yīng)細胞和單純靶細胞為陰性對照所測OD值，利用公式算得CTL的殺傷活性。
[0036]CTL殺傷活性=靶細胞對照組OD值-(實驗組OD值-效應(yīng)細胞對照組OD值)/靶細胞對照組O D值【圖5】。
【權(quán)利要求】
1.一種CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟: a.構(gòu)建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA； b.分離和培養(yǎng)DC細胞； c.采用重組腺病毒AD-CEA轉(zhuǎn)染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA_DC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(a)包括如下工藝步驟: al:將載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，培養(yǎng)至出毒，得到原代毒種； a2:用原代毒種感染293細胞，待2-3天細胞病變后，進行濃縮純化，獲得擴增后的重組腺病毒AD-CEA 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(b)中的DC細胞包括下列細胞:外周血單個核細胞培養(yǎng)的DC細胞，骨髓來源的DC細胞，臍帶血來源的DC細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(c)包括如下工藝步驟: cl:采用步驟(a)中制備的重組腺病毒AD-CEA病毒液感染步驟(b)中制備的DC細胞； c2:采用含有GM-GSF和IL-4的完全培養(yǎng)液，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)步驟(Cl)中感染后的DC細胞； c3:到第5天，在步驟(c2)中培養(yǎng)的DC細胞中加入TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)3天，第8天獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗AdCEA-DC，光鏡下形態(tài)學鑒定，并用流式細胞儀檢測細胞表型 CDla，CD80, CD83, CD86, HLA-DR0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(a)中所述的重組腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，該病毒缺失El區(qū)和E3區(qū)，并且在El區(qū)位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表達盒，該表達盒依次包括:啟動子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因編碼序列，聚腺苷酸信號序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(a)中所述的癌胚抗原CEA抗原肽的堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(c)中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，是通過腺病毒為載體將癌胚抗原CEA抗原肽基因轉(zhuǎn)入DC細胞中獲得的，可以表達癌胚抗原CEA抗原肽基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(c)中用來感染DC的重組腺病毒AD-CEA的使用MOI值為50-1000。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(c)中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，CEA抗原肽基因陽性表達率在20%-100%ο
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(c)中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC可誘導(dǎo)出對CEA表達陽性腫瘤細胞有特異性殺傷作用的CTL。
【文檔編號】A61K39/00GK104001185SQ201310059166
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月26日
【發(fā)明者】付建喜, 葉永清, 蘇國新 申請人:上?？氯R遜生物技術(shù)有限公司