核糖體蛋白s5在催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)中的用途的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：核糖體蛋白s5在催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核糖體蛋白S5的新用途，具體地說(shuō)，是核糖體蛋白S5在催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)中的用途。
背景技術(shù)：
核糖體蛋白S5 (Ribosomal protein S5, RPS5)是真核生物核糖體的重要組成部分，在蛋白質(zhì)翻譯方面起調(diào)控作用。大量文獻(xiàn)報(bào)道，RPS5涉及細(xì)胞分化和凋亡的調(diào)節(jié)，RPS5表達(dá)異常與某些腫瘤的發(fā)生有關(guān)，具體可參見(jiàn)以下文獻(xiàn):(l)Tsiftsoglou AS, et al.Commitment of murine erythroleukemia (MEL) cells to terminal differentiationis associated with coordinated expression of globin and ribosomal genes.ProgClin Biol Res, 1982; 102 pt A: 69-79 ； (2) Vizirianakis IS, et al.Expressionof ribosomal protein S5 cloned gene during differentiation and apoptosis inmurine erythroIeukemia (MEL) cells.0ncol Res, 1999; 11: 409-419 ；(3)MatragkouCNj et al.The potential role of ribosomal protein S5 on cell cycle arrest andinitiation of murine erythroIeukemia cell differentiation.J Cell Biochem，2008;104: 1477-1490。可見(jiàn)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)RPS5結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，進(jìn)一步闡明RPS5在各種疾病中的作用機(jī)制，將為這些疾病的診斷和基因治療開(kāi)辟一個(gè)新的研究領(lǐng)域。但是目前關(guān)于RPS5具體作用機(jī)制的研究報(bào)道尚少，如中國(guó)期刊《解放軍醫(yī)學(xué)雜志》，2011年4月I日，第36卷，第4期，刊出的論文《核糖體蛋白S5的醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展》指出“多數(shù)研究認(rèn)為RPS5在氨基酸組成上很有特點(diǎn)，因含有大量精氨酸和賴(lài)氨酸而呈堿性，且堿性氨基酸較集中。該基因編碼的117個(gè)氨基酸中堿性、酸性氨基酸各為22個(gè)(占18.8% )，堿性、酸性氨基酸都集中在某幾個(gè)區(qū)域。這種中性的蛋白質(zhì)在與其他蛋白質(zhì)或基團(tuán)結(jié)合時(shí)，非特異性結(jié)合明顯降低；同時(shí)堿性、酸性氨基酸集中在某幾 個(gè)區(qū)段，可能提高了特異性結(jié)合的水平，在功能上將表現(xiàn)為蛋白質(zhì)之間結(jié)合的特異性增強(qiáng)，功能專(zhuān)一。RPS5蛋白不存在跨膜區(qū)，提示其不能作為膜受體起作用，也不可能是定位于膜的錨定蛋白或者離子通道等?！薄６壳瓣P(guān)于RPS5能夠催化蛋白質(zhì)分子脫磷酸的作用、RPS5與蛋白磷酸酶的關(guān)系國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。蛋白磷酸酶是具有催化磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類(lèi)酶分子，與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，共同構(gòu)成了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開(kāi)關(guān)系統(tǒng)。真核生物中的蛋白磷酸酶具有不同的結(jié)構(gòu)和功能，根據(jù)其底物特異性和催化結(jié)構(gòu)域可分為三類(lèi):第一類(lèi)為酪氨酸蛋白磷酸酶類(lèi)(protein tyrosine phosphatases, PTPs),包括酪氨酸蛋白磷酸酶和雙特異性蛋白磷酸酶(dual specificity phosphatases, DSPs);第二類(lèi)為磷酸化蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases, PPPs),含有催化亞基與多種調(diào)節(jié)亞基，代表性家族成員包括 PPl (protein phosphatase I )、PP2A、PP2B、PP4、PP5、PP6 和 PP7 ;第三類(lèi)為金屬依賴(lài)的蛋白憐酸酶(Metal-dependent protein phosphatases, PPMs),包括PP2C和丙酮酸脫氫酶磷酸酶，這類(lèi)酶與PPPs不同，其不需要調(diào)節(jié)亞基，以單體發(fā)揮作用，結(jié)構(gòu)上含有特定的結(jié)構(gòu)域和保守序列基序來(lái)決定底物的特異性，而且對(duì)廣譜的蛋白磷酸酶抑制劑okadaic acid不敏感。其中，金屬離子通過(guò)活化水分子進(jìn)行脫磷酸化反應(yīng),對(duì)PPPs和PPMs起催化和中心的作用(Shi Y.Serine/threonine phosphatases: mechanism throughstructure.Cell, 2009; 139: 468—484.)。PP2C屬于Mn2+/Mg2+依賴(lài)的高度保守的蛋白磷酸酶。目前人類(lèi)基因組中已發(fā)現(xiàn)16條PP2C基因，編碼至少22種不同的PP2C亞型。PP2C在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝中發(fā)揮重要的作用，此外，還主要參與調(diào)節(jié)應(yīng)激信號(hào)。異常的PP2C活性與多種病理狀態(tài)如腫瘤、糖尿病、心血管疾病、阿爾海默氏病等以及環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)如核輻射、紫外照射、受傷應(yīng)激等有關(guān)，具體可參見(jiàn)以下文獻(xiàn):(I) Lammers T, et al.Role of type 2C proteinphosphatases in growth regulation and in cellular stress signaling.Crit RevBiochem Mol Biol, 2007; 42:437-461;(2) Lu g, et al.Functional diversity ofmammalian type 2C protein phosphatase isoforms: new tales from an old family.Clin Exp Pharmacol Physiol, 2008; 35: 107-112。Akt/蛋白激酶B和MAPK通路在細(xì)胞存活、增殖、生長(zhǎng)、分化中發(fā)揮重要作用。Akt和MAPK通路參與了多種疾病和病理過(guò)程，例如腫瘤、膿毒癥、器官纖維化、炎癥、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)精神疾病如阿爾海默氏病和躁狂抑郁癥等以及環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)如核輻射、紫外照射、受傷應(yīng)激等。Akt可在磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和磷脂酰肌醇依賴(lài)的蛋白激酶(PDKl)作用下磷酸化而活化，但在蛋白磷酸酶如PPl、PP2A、PHLPP等作用下脫磷酸化而滅活。研究表明，多種病理狀態(tài)如腫瘤以及環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)如核輻射等與Akt和MAPK通路(Erk，JNK，P38)的激活有關(guān)，具體參見(jiàn)以下文獻(xiàn):(l)Datta SR，et al.Cellularsurvival: a play in three Akts.Genes Devj 1999;13: 2905-2927; Cho H，et al.1nsulin resistance and a diabetes mellitus—like syndrome in mice lacking theprotein kinase Akt2 (PKB beta).Science, 2001; 292:1728-1731 ; (2) Lee UE，etal.Mechanisms of hepatic fibrogenesis.Best Pract Res Clin Gastroenterol,2011; 25: 195-206 ； (3) McConnell JLj et al.Targeting protein serine/threoninephosphatases for drug development.Mol Pharmacol, 2009;75:1249-1261 ; (4)Muthusamy V， et al.the UV response of the skin: a review of the MAPKj NFkappaBand TNFalpha signal transduction pathways.Arch Dematol Res, 2010; 302: 5-17 ；
(5)ZhangJYj et al.The role of the c-Jun N-terminal kinase signaling pathwaysin skin cancer.Am J cancer res, 2012; 2:691—698。糖原合酶激酶3 (glycogen synthase kinase 3，GSK3)，包括 α 和 β 2 個(gè)亞型，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與了細(xì)胞膜到細(xì)胞核的信號(hào)傳導(dǎo)、基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活等許多細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，因此，其參與了腫瘤、阿爾海默氏病、內(nèi)毒素血癥、全身性炎癥、糖尿病等多種病理過(guò)程。內(nèi)毒素是細(xì)菌感染造成膿毒癥(sepsis)的主要成分。GSK3是Akt的直接底物，Akt使GSK3磷酸化而抑制其活性。實(shí)驗(yàn)研究表明GSK3抑制劑TDZD-8、SB216763和SB415286能抑制內(nèi)毒素血癥和全身性炎癥相關(guān)的肝、腎、肺等多器官損傷和功能障礙，此外，bisarylmaleimide等GSK3抑制劑能有效治療糖尿病。碳酸鋰能抑制GSK3，臨床上用于治療躁狂抑郁癥患者。具體參見(jiàn)以下文獻(xiàn):(DWoodgett JR.Judging a protein by more than its name: GSK-3.Sci STKE 2001;2001: RE12; Krema A, et al.GSK3 and Alzheimer’ s disease: facts and fiction.Frontiers in Molecular Neuroscience, 2011;4: 1-10 ； (2) Beaulieu JM, et al.TheAkt-GSK-3 signaling cascade in the actions of dopamine.TRENDS Pharmacol Sci,2007; 28:166-172 ； (3) Dugo L, et al.GSK-3 β inhibitors attenuate the organinjury/dysfunction caused by endotoxemia in the rat.Crit Care Med, 2005;33: 1903-1912 ； (4) Engler TA, et al.The development of potent and selectivebisarylmaleimide GSK3 inhibitors.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2005; 15:899-903。另外，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00910199252.0，提供了一類(lèi)硫代苦參堿化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽類(lèi)的制備方法，還提供了這類(lèi)化合物能抑制參與炎癥過(guò)程的細(xì)胞因子產(chǎn)生和核轉(zhuǎn)錄因子NFk B轉(zhuǎn)錄活性，可用于制備治療細(xì)胞因子和核轉(zhuǎn)錄因子NFk B參與的諸如慢性炎癥等相關(guān)的炎癥性疾病和病理過(guò)程的藥物(Hu H, et al.Synthesis and in vitroinhibitory activity of matrine derivatives towards pro-1nflammatory cytokines.Bioorg Med Chem Lett, 2010; 20: 7537-7539)。但是目前關(guān)于這類(lèi)化合物與RPS5的作用未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種核糖體蛋白S5 (RPS5)的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種RPS5或其激動(dòng)劑或抑制劑的用途。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種篩選RPS5激活劑或抑制劑的方法。為實(shí)現(xiàn)上 述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
RPS5在催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)中的用途。所述的RPS5是作為一種PP2C樣蛋白磷酸酶催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)。所述的蛋白質(zhì)分子可以是憐酸化Akt、憐酸化bisamide rhodamine-110 peptide、磷酸化GSK3 β、磷酸化P70S6K、磷酸化ERK等。所述的RPS5分離或純化于哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞，優(yōu)選由常規(guī)的基因工程重組技術(shù)制備生產(chǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
RPS5或其激動(dòng)劑或抑制劑的用途，用于調(diào)控Akt或MAPK信號(hào)通路。RPS5或其激動(dòng)劑或抑制劑的用途，用于制備治療Akt或MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程的組合物。該組合物可用于提高或抑制RPS5的表達(dá)水平或活性。所述的RPS5或其激動(dòng)劑或抑制劑選自:
a)—種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有編碼RPS5或其激動(dòng)劑或抑制劑的基因及與操作性相關(guān)的表達(dá)調(diào)控序列；或
b)一種重組融合蛋白，所述的重組融合蛋白包括含有RPS5蛋白或其激動(dòng)劑或抑制劑及促進(jìn)蛋白穿透或進(jìn)入細(xì)胞的序列；或
c)經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的RPS5蛋白的氨基酸序列；
或
d)苦參堿類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽類(lèi)。所述的苦參堿類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽類(lèi)可根據(jù)專(zhuān)利號(hào)ZL 200910199252.0的中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)制得。優(yōu)選的，所述的苦參堿類(lèi)化合物是13-甲氨基-18-硫代苦參喊。所述的Akt或MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程可以是:腫瘤、膿毒癥、器官纖維化、炎癥、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)精神疾病如阿爾海默氏病和躁狂抑郁癥等以及環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)如核輻射、紫外照射、受傷應(yīng)激等。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種篩選RPS5激活劑或抑制劑的方法，包括以下步驟:
1)將RPS5與磷酸化底物接觸，檢測(cè)RPS5對(duì)所述的磷酸化底物的影響，作為對(duì)照組；
2)將候選物質(zhì)與RPS5或RPS5表達(dá)體系接觸，再將所得的RPS5與步驟I)所述的磷酸化底物接觸，檢測(cè)RPS5對(duì)磷酸化底物的影響，作為測(cè)試組；
3)比較對(duì)照組和測(cè)試組的RPS5的活性，判定所述的候選物質(zhì)是RPS5的激活劑或抑制劑。所述的磷酸化底物是磷酸化Akt、磷酸化雙酰胺若丹明-110肽(bisamiderhodamine-110 peptide)或4-硝基苯磷酸二鈉(pNPP),但不僅限于此。所述的RPS5表達(dá)體系選自:細(xì)胞體系或動(dòng)物體系。若候選物質(zhì)提高或抑制RPS5表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于制備治療Akt和MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程的潛在物質(zhì)`。所述的方法還可以包括以下步驟:對(duì)所述的RPS5的激動(dòng)劑或抑制劑進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于治療Akt或MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程有用的組合物。需要說(shuō)明的是:
RPS5及其用途
在本發(fā)明中，所用的RPS5蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動(dòng)物。此外，所述的RPS5蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)重組RPS5蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的RPS5蛋白。任何適合的RPS5蛋白均可用于本發(fā)明。所述的RPS5蛋白包括全長(zhǎng)的RPS5蛋白或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的RPS5蛋白的氨基酸序列可以與GenBank登錄號(hào):NP_001000.2所示的序列基本上相同。經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的RPS5蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。RPS5蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到，一般來(lái)說(shuō)，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變生物活性。見(jiàn) Watson 等，Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/Cummings Pub.C0.P224。任何一種RPS5蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，RPS5蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長(zhǎng)的RPS5蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長(zhǎng)RPS5蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長(zhǎng)RPS5蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的RPS5蛋白，比如，可采用為了延長(zhǎng)其半衰期和/或增加其有效性而加以修飾或改良的RPS5蛋白。所述經(jīng)過(guò)修飾或改良的RPS5蛋白可以是一種RPS5的融合蛋白，或其可包含被取代的氨基酸。所述經(jīng)過(guò)修飾或改良的RPS5蛋白可以是與天然存在的RPS5蛋白具有較大的差異，但也能治療Akt和MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程，且不會(huì)帶來(lái)其它不良影響或毒性。也就是說(shuō)，任何不影響RPS5蛋白的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。根據(jù)RPS5蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相應(yīng)的核苷酸編碼序列。優(yōu)選的，所述的RPS5蛋白的核苷酸序列可以與GenBank登錄號(hào):NM_001009.3所示的序列基本上相同。的激動(dòng)劑及其用途
所述的RPS5的激動(dòng)劑包括RPS5活性促進(jìn)劑、表達(dá)上調(diào)劑、穩(wěn)定劑等。任何可提高RPS5蛋白的活性、促進(jìn)RPS5蛋白的表達(dá)、促進(jìn)RPS5的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)、維持RPS5蛋白的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)RPS5蛋白有效作用時(shí)間均可用于本發(fā)明，作為治療Akt和MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程的有效物質(zhì)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的RPS5的激動(dòng)劑選自(但不限于):中國(guó)專(zhuān)利號(hào)ZL200910199252.0提供的苦參堿類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽類(lèi)，優(yōu)選13-甲氨基-18-硫代苦參堿。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的RPS5蛋白的激動(dòng)劑包括(但不限于):在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可表達(dá)(優(yōu)選過(guò)表達(dá))RPS5的表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建物。通常，所述表達(dá)載體包含一基因盒，所述的基因盒含有編碼RPS5的基因及與之操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。所述的“操作性相連”或“可操作的連于”指這樣一種狀況，即線(xiàn)性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線(xiàn)性DNA序列其它部分的 活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。本發(fā)明中，RPS5多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于本發(fā)明。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因盒翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含RPS5的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。轉(zhuǎn)化載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的RPS5蛋白的激動(dòng)劑包括(但不限于):一重組融合蛋白，所述重組蛋白包括含有RPS5蛋白或其激動(dòng)劑及促進(jìn)蛋白穿透/進(jìn)入細(xì)胞的序列，如穿透肽PEP-1、TAT或細(xì)胞表面抗體等。制備融合蛋白方法為本領(lǐng)域研究人員所熟知，包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、蛋白質(zhì)的純化技術(shù)等。的抑制劑及其用途
所述的RPS5的抑制劑包括RPS5活性和表達(dá)抑制劑。任何可抑制RPS5蛋白的活性、抑制RPS5蛋白的表達(dá)、或抑制RPS5的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為治療Akt和MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程的有效物質(zhì)。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的RPS5的抑制劑包括(但不限于):經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的RPS5蛋白的氨基酸序列。RPS5蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列部分拮抗或完全拮抗RPS5的功能。例如RPS5 D140A突變體及其缺失體RPSSh5ci和RPS5151_2Q4。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的RPS5的抑制劑包括(但不限于):任何一種RPS5蛋白的生物活性片段。在這里，RPS5蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，部分拮抗或完全拮抗RPS5的功能。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的RPS5蛋白的抑制劑包括(但不限于):在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可表達(dá)(優(yōu)選過(guò)表達(dá))，部分拮抗或完全拮抗RPS5的功能的RPS5蛋白或其生物活性片段的表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的RPS5蛋白的抑制劑包括(但不限于):含上述RPS5抑制劑的RPS5蛋白及促進(jìn)蛋白穿透/進(jìn)入細(xì)胞的序列，如穿透肽PEP-UTAT或細(xì)胞表面抗體等重組融合蛋白或其生物活性片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于制備上述的重組融合蛋白。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、蛋白質(zhì)的純化技術(shù)等。組合物
本發(fā)明的組合物可直接用于治療Akt和MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程。此外還可同時(shí)與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語(yǔ)“主要由…組成”和“由…組成”包含在術(shù)語(yǔ)“含有”中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效性”或“有效劑量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適合于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副作用(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明的組合物含有安全有效量的RPS5蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。這類(lèi)載體包括(但并不限于):生理鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式所匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明所述的RPS5蛋白或其激動(dòng)劑/抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來(lái)確定(例如通過(guò)臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于:所述的RPS5蛋白或其激動(dòng)劑/抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的RPS5蛋白或其激動(dòng)劑/抑制劑每天以約0.00 001mg-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的0.0001mg-30mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予，能得到令人滿(mǎn)意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
本發(fā)明的RPS5蛋白或其激動(dòng)劑/抑制劑的給藥方式?jīng)]有特別地限制，可以是全身的或局部的。例如，本發(fā)明的RPS5蛋白或其激動(dòng)劑可通過(guò)靜脈注射、口服、皮下注射、皮內(nèi)注射等的方式給藥動(dòng)物，較為優(yōu)選的是口服和靜脈注射。在得知了所述的RPS5蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來(lái)將所述的RPS5蛋白或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進(jìn)行，比如可直接將RPS5蛋白通過(guò)諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過(guò)一定的途徑將攜帶RPS5基因的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性的RPS5蛋白。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可將所述的RPS5蛋白直接給藥于哺乳動(dòng)物(比如人)，或者，可將編碼RPS5蛋白的基因通過(guò)常規(guī)的方法克隆到適當(dāng)?shù)妮d體(如常規(guī)原核或真核表達(dá)載體、或病毒載體如皰疫病毒載體或腺病毒載體)中，將所述的載體導(dǎo)入到可表達(dá)所述的RPS5蛋白的細(xì)胞中，使所述的細(xì)胞表達(dá)RPS5蛋白。可通過(guò)將適量的所述細(xì)胞引入的哺乳動(dòng)物身體的適當(dāng)部位，實(shí)現(xiàn)RPS5蛋白的表達(dá)。RPS5蛋白的激動(dòng)劑/抑制劑的給藥方式主要取決于所述激動(dòng)劑/抑制劑的類(lèi)型和特性，這是本領(lǐng)域人員可以評(píng)估的?；钚缘臋z測(cè)方法
本發(fā)明提供一種檢測(cè)RPS5活性的方法，所述的方法包括:RPS5的底物和檢測(cè)RPS5對(duì)底物的影響。所述的RPS5底物可以是(但不限于):磷酸化Akt、磷酸化雙酰胺若丹明-110妝(bisamide rhodamine-110 peptide)、4_硝基苯憐酸二鈉(pNPP)。優(yōu)選的是憐酸化Akt。磷酸酶的底物是一種磷酸化的物質(zhì)，磷酸化物質(zhì)可以是其特異性底物，也可以是非特異性底物。這些使本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到，一般來(lái)說(shuō)，非特異性底物基本上不會(huì)影響檢測(cè)蛋白磷酸酶的生物活性。所述檢測(cè)RPS5對(duì)底物的影響，可以采用(但不限于)Western-Blot法，也可以采用分光光度法或熒光分光光度法等。篩選RPS5的激活劑或抑制劑的方法
在得知了所述的RPS5蛋白作為PP2C樣蛋白磷酸酶的用途后，可以基于該特征來(lái)篩選RPS5的激活劑或抑制劑。篩選RPS5的激活劑或抑制劑的方法包括:將候選物質(zhì)與RPS5的體系，或與表達(dá)RPS5的體系接觸。若所述候選物質(zhì)可提高或抑制RPS5的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是RPS5的激活劑或抑制劑，可用于制備治療Akt和MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的RPS5體系。所述的RPS5的體系可以是重組表達(dá)的RPS5或分離或純化的內(nèi)源性RPS5。所述的表達(dá)RPS5的體系可以是細(xì)胞體系，所述的細(xì)胞可以是內(nèi)源性表達(dá)RPS5的細(xì)胞；或可以是重組表達(dá)RPS5的細(xì)胞或RPS5沉默的細(xì)胞。所述的表達(dá)RPS5的體系還可以是動(dòng)物體系(如RPS5轉(zhuǎn)基因小鼠，或RPS5敲除小鼠)。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的體系是重組表達(dá)的RPS5。將重組表達(dá)RPS5作為用于篩選與RPS5結(jié)合；較佳地， 影響RPS5底物如Akt水平的RPS5激動(dòng)劑或抑制劑分子模型。
作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方式，所述的體系是RPS5表達(dá)的細(xì)胞體系。將這種細(xì)胞作為用于篩選RPS5激動(dòng)劑或抑制劑的細(xì)胞模型。作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方式，所述的體系是動(dòng)物模型體系。較佳地，所述的動(dòng)物模型可以是RPS5轉(zhuǎn)基因或基因敲除的動(dòng)物模型。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括:對(duì)獲得的RPS5激動(dòng)劑或抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定用于治療Akt和MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程真正有用的物質(zhì)。本發(fā)明對(duì)于RPS5表達(dá)的檢測(cè)方法，可以采用常規(guī)的蛋白定量或半定量檢測(cè)技術(shù)，例如(但不限于)=SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等；可以采用常規(guī)的mRNA檢測(cè)技術(shù)，例如(但不限于):PCR法，報(bào)告基因法等。本發(fā)明對(duì)于RPS5活性的檢測(cè)方法，可以采用(但不限于)Western-Blot法，分光光度法，熒光分光光度法等。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn):RPS5是Akt的磷酸酶，直接使Akt脫磷酸化而抑制Akt活性。RPS5以單體形式發(fā)揮作用，其活性依賴(lài)金屬離子(Mg2+、Mn2+),對(duì)廣譜的蛋白磷酸酶抑制劑okadaicacid不敏感，符合PP2C的特性。RPS5結(jié)構(gòu)上包含PP2C催化結(jié)構(gòu)域，突變實(shí)驗(yàn)和缺失實(shí)驗(yàn)證明該結(jié)構(gòu)域?yàn)镽PS5活性所必需。RPS5D140A及其缺失體RPSS^和RPS5151_2(I4是RPS5的顯性負(fù)效應(yīng)形式。在細(xì)胞水平上，RPS5能在基礎(chǔ)水平(組成性)促進(jìn)磷酸化Akt及磷酸化GSK3 β和磷酸化P70S6K脫磷酸，也能促進(jìn)磷酸化ERK MAPK脫磷酸，但促進(jìn)JNK和Ρ38MAPK磷酸化。同樣地，也能調(diào)控生長(zhǎng)因子如TGF β和I3DGF以及脂多糖LPS誘導(dǎo)的上述通路的變化。因此，RPS5是一種新的PP2C樣的蛋白磷酸酶，特別是Akt的磷酸酶。通過(guò)促進(jìn)或抑制RPS5的表達(dá)或活性可以作為治療Akt和MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程的新的有效治療方法；
2、本發(fā)明提供了以RPS5作為藥物篩選靶點(diǎn)治療疾病的方法，即RPS5或其激活劑或抑制劑的用途，用于制備治療Akt或MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程的藥物；
3、本發(fā)明提供了檢測(cè)RPS5活性及篩選RPS5激活劑或抑制劑的方法；
綜上所述，本發(fā)明首次論證了 RPS5是PP2C樣蛋白磷酸酶，特別是Akt的磷酸酶，并調(diào)控Akt和MAPK通路。因此，RPS5本身能夠用作蛋白磷酸酶；并且，可基于RPS5的上述功能，用于制備治療Akt或MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程的組合物，或篩選抑制或激活RPS5的物質(zhì)，用于治療Akt或MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程。


附圖1是RPS5的Akt蛋白磷酸酶活性和檢測(cè)方法。附圖2是RPS5催化活性中心分析結(jié)果。附圖3 是 pAV.EXld-hRPS5/IRES/eGFP 載體圖譜。附圖4 是 shpAd-RPS5_eGFP 載體圖譜。附圖5是RPS5調(diào)節(jié)Akt和MAPK通路的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。附圖6是RPS5激動(dòng)劑的篩選 和活性測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分百和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1 RPS5是Akt的蛋白磷酸酶
取重組純化的磷酸化Akt (Millipore公司)與重組的GST-RPS5 (Abnova Biologicals公司)或自制的純化重組的His-RPS5在50mM Tris-HCl (pH 7.0)，IOmM MgCl2緩沖液中30°C共同孵育30分鐘。Western blot檢測(cè)磷酸化Akt Thr308和Ser473水平。結(jié)果顯示，RPS5濃度依賴(lài)使磷酸化Akt脫磷酸化(圖1A)，表明RPS5是一種Akt蛋白磷酸酶。肝星狀細(xì)胞HSC-T6用TGFbl (2ng/ml)刺激4小時(shí)后，分別用RPS5和Akt抗體免疫沉淀RPS5和Akt，然后將不同量的RPS5免疫沉淀物與Akt沉淀物共育，依上述方法檢測(cè)RPS5蛋白磷酸酶活性。結(jié)果顯示，內(nèi)源性RPS5同樣催化Akt發(fā)生脫磷酸反應(yīng)(圖1B)。實(shí)施例2用憐酸化bisamide rhodamine-110 peptide檢測(cè)RPS5蛋白憐酸酶活性
以 Ser/Thr Phosphatase assay kit (Promega 公司，Madison)中 phosphorylatedbisamide rhodamine-110 peptide作為底物,脫磷酸化反應(yīng)緩沖液中含有2mM MnCl2,根據(jù)試劑盒反應(yīng)條件檢測(cè)RPS5的磷酸酶活性。突光強(qiáng)度用Synergy 2多功能酶標(biāo)儀(Biotek)測(cè)定，酶活性用最大信號(hào)％表示。結(jié)果表明，RPS5濃度依賴(lài)使磷酸化phosphorylatedbisamide rhodamine-110 peptide 脫憐酸化(圖 1C)。實(shí)施例3 RPS5蛋白磷酸酶活性依賴(lài)于錳、鎂離子，對(duì)廣譜蛋白磷酸酶抑制劑okadaic acid 不敏感 取重組純化的磷酸化Akt (Millipore公司)或自制的純化重組的His_RPS5在50mMTris-HCl (pH 7.0)溶液中在4°C與okadaic acid (200 nM)共同孵育10分鐘。依實(shí)施例1條件檢測(cè)RPS5磷酸酶活性。結(jié)果顯示，RPS5活性依賴(lài)于二價(jià)金屬離子Mn和Mg (圖1D)，但okadaic acid對(duì)其活性的抑制作用較弱(圖1E)，RPS5的這些特性與PP2C相同。實(shí)施例4 RPS5具有PP2C催化結(jié)構(gòu)域
用 NCBI Blastp programs 比較人 RPS5 (ΝΡ_001000.2)和人 ΡΡ2(:β (GenBankCAA06704.1)或 PP2C α (ΝΡ_066283.1),結(jié)果表明 RPS5 中 2 個(gè)肽段(aal21_142 和aal48_202)與PP2C0催化結(jié)構(gòu)域同源，肽段(aal54_198)與PP2Ca同源(圖2A)。用Clustal X 2.0和BioEdit軟件分析表明，RPS5含有PP2C高度保守的一些氨基酸序列(星號(hào)*標(biāo)記)(圖2B)。米用RPS5 晶體結(jié)構(gòu)(61 StearothermophiIus, PDB id code IPKP)應(yīng)用 Coot軟件分子模建 RPS5,與 PP2C β (1A6Q, Das AK, et al, Crystal structure of theprotein serine/threonine phosphatase 2C at 2.0 A resolution.Embo J 1996; 15,6798-6809.)晶體結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)兩者具有相似的金屬離子結(jié)合域。RPS5分子中位于兩個(gè)b片層中E123、D124和D140氨基酸殘基的3個(gè)羧基氧原子構(gòu)成了推測(cè)的金屬離子結(jié)合域，而PP2Ci3的金屬離子結(jié)合域則由D60、D239和D282組成(圖2C)。圖中放大的是金屬離子結(jié)合域。金屬原子用紫色表示，氧原子用紅色表示。構(gòu)建RPS5突變體和缺失體:采用PCR方法，用適當(dāng)?shù)囊飻U(kuò)增全長(zhǎng)RPS5和RPS5缺失體 RPS5h5Q 和 RPS5151_2Q4，插入 pcDNA4 載體(Invitrogen)的 Kpn I/ EcoR I 位點(diǎn)。RPS5突變體采用重疊PCR定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建，引物為:S241: GGG AAG TGG ATC ACC GAT GA/TCA TCG GTG ATC CAC TTC CC; S34A: AAT GAC ATT GCC CTG CAG GA/TCC TGC AGG GCAATG TCA TT; T133A: CGC CGG GGC TGT GAG ACG/CGT CTC ACA GCC CCG GCG; E123A: ACAGTG GTC CCC GGG CGG ACT CCA CAC GCA TTG GGC/GCC CAA TGC GTG TGG AGT CCG CCC GGGGAC CAC TGT; D124A: ACA GTG GTC CCC GGG AGG CCT CCA CAC GCA TTG GGC/GCC CAA TGCGTG TGG AGG CCT CCC GGG GAC CAC TGT; E123A-D124A: ACA GTG GTC CCC GGG CGG CCTCCA CAC GCA TTG GGC/GCC CM TGC GTG TGG AGG CCG CCC GGG GAC CAC TGT; D140A: ACGACA GGC TGT GGC TGT GTC CCC CCT G/CAG GGG GGA CAC AGC CAC AGC CTG TCG T。構(gòu)建的所有質(zhì)粒均測(cè)序確證。構(gòu)建的RPS5突變體和缺失體用lipofectin2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72小時(shí)后，western blot檢測(cè)Akt憐酸化水平。結(jié)果顯不，野生型RPS5能使pAkt Thr308和Ser473磷酸化水平降低，Akt靶蛋白GSK3b磷酸化水平也降低。但是，RPS5-E123A-D124A突變體則喪失這種功能，而 RPS5 D140A (GAT — GCT)和 RPS5-E123A-D124A-D140A 突變體(GAGGAC — GCGGCC)及其缺失體RPSS1,和RPS5151_2(I4則刺激Akt及其GSK3b磷酸化水平提高(圖2D，E)，說(shuō)明這些RPS5突變體和缺失體是其顯性負(fù)效應(yīng)形式，提示它們可用作RPS5拮抗劑。這些結(jié)果也說(shuō)明這些結(jié)構(gòu)域?yàn)镽PS5活性所必需。實(shí)施例5 RPS5抑制TGFb誘 導(dǎo)的Akt及其下游分子磷酸化
RPS5腺病毒表達(dá)載體及其對(duì)照載體(AdRPS5和AdGFP )，或RNA干擾AdshRPS5和對(duì)照 AdshNC 由廣州 Cyagen Biosciences 提供。利用 Gateway clone technology(Invitrogen)構(gòu)建pAV.EXld_hRPS5/IRES/eGFP重組腺病毒表達(dá)載體(載體圖譜如圖3所示)。重組腺病毒表達(dá)載體pAV.EXld含有CMV啟動(dòng)子和雙順?lè)醋颖磉_(dá)盒，其中人RPS5基因緊接著IRES和增強(qiáng)型綠熒光蛋白(EGFP)基因。利用Gateway clone technology構(gòu)建shpAd-RPS5-eGFP (載體圖譜如圖4所示)和對(duì)照AdshNC重組腺病毒表達(dá)載體。靶向大鼠RPS5 的 shRNA 序列為 356:GCTCATGACTGTACGAATTCTCGAGAATTCGTACA GTCATGAGC，對(duì)照序列為 GCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGC GAATCCTACAAAGCGCGC。其中 U6 啟動(dòng)子調(diào)控 shRPS5 和shNC表達(dá)，Ubiquitin-C (Ubc)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)。將上述載體分別包裝成腺病毒，感染大鼠HSC-T6細(xì)胞或小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系48小時(shí)。依實(shí)施例4方法檢測(cè)RPS5的作用。結(jié)果顯示，RPS5能在基礎(chǔ)水平(組成性)促進(jìn)磷酸化Akt及其下游信號(hào)通路分子如磷酸化GSK3 β和磷酸化P70S6K脫磷酸(圖5Α，B)，也能促進(jìn)磷酸化ERK脫磷酸，但促進(jìn)JNK和Ρ38 MAPK磷酸化(圖5F左)。同樣地，也能調(diào)控生長(zhǎng)因子如TGF β和脂多糖LPS誘導(dǎo)的上述通路的變化(圖5C、G)。RNA干擾減少RPS5表達(dá)對(duì)Akt和MAPK通路的作用與RPS5過(guò)表達(dá)的作用相反(圖5D、Ε、F)，也能促進(jìn)I3DGF促進(jìn)的Akt磷酸化水平進(jìn)一步升高(圖5Ε)。這些結(jié)果表明，RPS5能調(diào)控Akt和MAPK通路。實(shí)施例6 RPS5的激活劑的篩選
苦參堿衍生物制備依中國(guó)專(zhuān)利號(hào)ZL 200910199252.0和文獻(xiàn)(Hu H, et al.BioorgMed Chem Lett, 2010; 20: 7537-7539.)。參照文獻(xiàn)(Lomenick B, et al.Target identification using drug affinityresponsive target stability (DARTS).PNAS, 2009; 106:21984-21989)方法，取純化的重組His-RPS5 (IOOng)加入化合物苦參堿衍生物(10 μ Μ) 4° C共同孵育I小時(shí)后，加入3%鏈霉蛋白酶(pronase, Sigma公司)室溫消化30分鐘,然后加入SDS-loading buffer, 95°C5min 終止消化，再行 12% SDS-PAGE，最后 Western blot 檢測(cè) RPS5。結(jié)果顯示，RPS5在3%鏈霉蛋白酶作用30分鐘后，幾乎完全降解?；衔?3-甲氨基-18-硫代苦參堿(MASM)作用最強(qiáng)(圖6A lane5)。依實(shí)施例1條件檢測(cè)RPS5磷酸酶活性，結(jié)果顯示該化合物能濃度依賴(lài)促進(jìn)RPS5的活性(圖6B)。提示該化合物是一種RPS5的激動(dòng)劑。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.核糖體蛋白S5在催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的核糖體蛋白S5是作為一種PP2C樣蛋白磷酸酶催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)分子是磷酸化Akt、磷酸化bisamide rhodamine-110 peptide、憐酸化 GSK3 β、憐酸化 P70S6K、憐酸化 ERK。
4.核糖體蛋白S5或其激動(dòng)劑或抑制劑的用途，其特征在于，用于調(diào)控Akt或MAPK信號(hào)通路。
5.核糖體蛋白S5或其激動(dòng)劑或抑制劑的用途，其特征在于，用于制備治療Akt或MAPK信號(hào)通路參與的疾病或病理過(guò)程的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述的核糖體蛋白S5或其激動(dòng)劑或抑制劑選自: a)一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有編碼RPS5或其激動(dòng)劑或抑制劑的基因及與操作性相關(guān)的表達(dá)調(diào)控序列；或 b)一種重組融合蛋白，所述的重組融合蛋白包括含有RPS5蛋白或其激動(dòng)劑或抑制劑及促進(jìn)蛋白穿透或進(jìn)入細(xì)胞的序列；或 c)經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的RPS5蛋白的氨基酸序列；或 d)苦參堿類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽類(lèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的苦參堿類(lèi)化合物是13-甲氨基-18-硫代苦參喊。
8.一種篩選核糖體蛋白S5激活劑或抑制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將核糖體蛋白S5與磷酸化底物接觸，檢測(cè)核糖體蛋白S5對(duì)所述的磷酸化底物的影響，作為對(duì)照組； 2)將候選物質(zhì)與核糖體蛋白S5或其表達(dá)體系接觸，再將所得的核糖體蛋白S5與步驟I)所述的磷酸化底物接觸，檢測(cè)核糖體蛋白S5對(duì)磷酸化底物的影響，作為測(cè)試組； 3)比較對(duì)照組和測(cè)試組的核糖體蛋白S5的活性，判定所述的候選物質(zhì)是核糖體蛋白S5的激活劑或抑制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的磷酸化底物是磷酸化Akt、磷酸化bisamide rhodamine-110 peptide 或 4_ 硝基苯憐酸二鈉。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括對(duì)所述的核糖體蛋白S5的激動(dòng)劑或抑制劑進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于治療Akt或MAPK通路參與的疾病和病理過(guò)程有用的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了核糖體蛋白S5(RPS5)在催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)中的用途，其作為一種PP2C樣蛋白磷酸酶；提供了RPS5或其激動(dòng)劑或抑制劑的用途，用于制備治療Akt和MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程的組合物；還提供了RPS5蛋白磷酸酶活性的檢測(cè)方法以及篩選RPS5激動(dòng)劑或抑制劑的方法。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于首次論證了RPS5是PP2C樣蛋白磷酸酶，并調(diào)控Akt和MAPK通路，因此RPS5本身能夠用作蛋白磷酸酶，并且可用于制備治療Akt和MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程的組合物，或篩選抑制或激活RPS5的物質(zhì)，用于治療Akt和MAPK通路參與的疾病或病理過(guò)程。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103160557SQ20131005709
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月22日
發(fā)明者張俊平, 李婕, 許維恒, 胥靜, 厲建中, 胡宏崗, 田媛, 邱磊, 胡振林 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)