專利名稱：一種具有抗氧化應(yīng)激作用的磷脂復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種由原花青素、類胡蘿卜素或富含原花青素、類胡蘿卜素的提取物與磷脂在脂溶性溶劑中反應(yīng)形成磷脂復(fù)合物。該磷脂復(fù)合物具有顯著的抗氧化應(yīng)激作用。
背景技術(shù)：
原花青素(Proanthocyanidins)是由黃燒-3-醇聚合而成的一類多酹物質(zhì)。根據(jù)分子的聚合程度，原花青素可分為單體、寡聚體和多聚體，目前研究最廣的葡萄籽提取物以寡聚體(OPC)為主，通常由兩類原花青素單體組成，即兒茶素(catechin)和表兒茶素(epicatechin)。此外松樹皮、桑葚、山楂、銀杏、沙棘、越橘、藍(lán)莓、蓮房等也含有豐富的原花青素。原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化作用，可以抵御自由基對(duì)人體的損傷，具有延緩衰老、美容護(hù)膚、抗輻射、抗視力退化及抗動(dòng)脈硬化和血栓形成的作用，也可以預(yù)防諸如關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病和心臟病等多種疾病。類胡蘿卜素(carotenoids)是一類天然色素的總稱，廣泛存在于自然界動(dòng)物、植物、真菌、藻類和細(xì)菌中，是包含在很多植物中的一種有色物質(zhì)。到上世紀(jì)末，已發(fā)現(xiàn)類胡蘿
卜素有700多種，人體血漿中發(fā)現(xiàn)有20多種。類胡蘿卜素是含40個(gè)碳(C)的類異戊烯聚合物，即四萜化合物。在植物界有很多化合物的碳架結(jié)構(gòu)是重復(fù)縮合異戊二烯五碳單位而構(gòu)成的。類胡蘿卜素是含有八個(gè)異戊二烯單位的四萜化合物，由兩個(gè)二萜(C) “頭對(duì)頭”縮合而成。類胡蘿卜素可分3類:①胡蘿卜素，羥類化合物，特點(diǎn)是溶于石油醚。最常見的有蕃茄紅素和α、β、Y-胡蘿卜素葉黃素，亦稱胡蘿卜醇，是胡蘿卜素的非酸性氧衍生物。含氧基團(tuán)有羥基、酮基、醚基、環(huán)氧基和呋喃基。常見的有隱黃質(zhì)、新黃質(zhì)、檸黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、葉黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、蝦青素、蝦紅素、海膽烯酮、蒲公英黃質(zhì)、紫菌紅素丁等；③類胡蘿卜素酸，胡蘿卜素的羧酸衍生物，能溶于堿溶液。例如:西紅花酸、胭脂樹橙和紅酵母紅素等。類胡蘿卜素具有顯著的抗氧化作用，其中番茄紅素具有淬滅單線態(tài)氧、清除體內(nèi)自由基、阻斷亞硝胺形成、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增強(qiáng)免疫力、減少DNA損傷以及增強(qiáng)細(xì)胞間隙連接通訊等方面的作用。在人體健康及疾病防治等方面發(fā)揮了重要的作用。雖然原花青素和類胡蘿卜素具有顯著的抗氧化作用，但是由于生物利用度低，尤其是屬于多酚類范疇的花青素類物質(zhì)，非常容易與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)，影響了吸收，故能吸收進(jìn)入血液而發(fā)揮作用的比例很小，因而降低了抗氧化作用的發(fā)揮。磷脂是含磷酸根的脂類物質(zhì)的總稱，包括有大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰膽堿、多稀磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等，它們廣泛存在于自然界的動(dòng)、植物的種子中，具有來源廣、無毒等優(yōu)點(diǎn)。磷脂是生物膜的基本成分，更是大腦細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)不可缺少的物質(zhì)，是健腦佳品、血管的“清道夫”和肝臟的保護(hù)神。藥物制劑中常用的磷脂主要是屬于天然磷脂類的大豆磷脂和蛋黃磷脂。磷脂分子具有一個(gè)親水性的頭部和兩條疏水長(zhǎng)鏈，由于其兩親性而具有乳化、 分散、助滲、潤(rùn)濕等特性，并與細(xì)胞表面有較強(qiáng)的親和性，在藥劑中用作分散劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、藥物載體等，可作為藥物輔料來增強(qiáng)藥物活性，降低藥物毒性，提高藥物穩(wěn)定性，使藥物靶向釋放到病灶區(qū)，延長(zhǎng)藥效，利于藥物吸收，提高生物利用度的作用。磷脂復(fù)合物即是以磷脂為載體的一種藥物傳遞系統(tǒng)，從固體制劑角度看來，磷脂復(fù)合物是一種較為特殊的固體分散體。許多研究發(fā)現(xiàn)，很多類型的天然活性成分與磷脂之間具有特殊的親和力，主要認(rèn)為是以氫鍵相結(jié)合，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。這類磷脂復(fù)合物被命名為Phytosome,不過國(guó)內(nèi)外仍有很多文獻(xiàn)將其稱為固體分散體或Solid dispersion。近年來許多國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,磷脂復(fù)合物(phytosomes)的理化性質(zhì)和生物特性較原化合物均有不同程度的改變，具有較強(qiáng)的親脂性。通過與磷脂復(fù)合而形成載體系統(tǒng)，能改善一些藥物在胃腸道中或經(jīng)皮吸收，可有效地提高天然活性成分的體內(nèi)吸收，可獲得較高的血藥濃度且體內(nèi)消除較慢，使生物利用度顯著提高。關(guān)于天然活性成分磷脂復(fù)合物生物利用度的研究，有水溶性及脂溶性均不佳的燈盞花素、人參皂苷、水飛薊素、甘草酸、銀杏酮酯、黃芪皂苷磷脂復(fù)合物等。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前尚未見有關(guān)原花青素、類胡蘿卜素與磷脂組成復(fù)合物的報(bào)道，更無原花青素、類胡蘿卜素與磷脂反應(yīng)生成磷脂復(fù)合物的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特征是將原花青素、類胡蘿卜素或富含原花青素、類胡蘿卜素的提取物與磷脂在脂溶性溶劑中反應(yīng)形成磷脂復(fù)合物，其中原花青素與類胡蘿卜素的摩爾比為I: 0.1 10,原花青素和類胡蘿卜素之和與磷脂的摩爾比為1: 0.5 3。磷脂復(fù)合物的制備方法包括下述順序的步驟:(I)取花青素和類胡蘿卜素溶于脂溶性溶劑中，得澄明液體；(2)加入相當(dāng)于花青素和類胡蘿卜素0.5 3倍量的磷脂，接回流裝置，20 70°C攪拌至溶液澄明； (3)40-80°C減壓濃縮，真空干燥至干，粉碎，即得磷脂復(fù)合物。步驟(I)所述原花青素選自葡萄原花青素、松樹皮原花青素、桑葚原花青素、山楂原花青素、銀杏原花青素、沙棘原花青素、越橘原花青素、藍(lán)莓原花青素和蓮房原花青素。所述類胡蘿卜素選自α、β、Y-胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素、番茄紅素、西紅花苷、西紅花酸、桅子黃素、玉米黃素、隱黃質(zhì)、新黃質(zhì)、檸黃質(zhì)、辣椒紅素、辣椒玉紅素、蝦紅素、海膽烯酮、蒲公英黃質(zhì)、紫菌紅素丁、胭脂樹橙和紅酵母紅素。所述脂溶性溶劑是指丙酮、乙醇、氯仿、甲醇，優(yōu)選無水乙醇。步驟⑴所述磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰膽堿、多稀磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸。優(yōu)選大豆卵磷脂、多稀磷脂酰膽堿。取磷脂復(fù)合物適量，溶于乙醇，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑，結(jié)果磷脂復(fù)合物的粒徑分布范圍為6 600nmo此磷脂復(fù)合物可以制成片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、粉劑、顆粒劑和口服液后，通過口服途徑給藥。
圖1為實(shí)施例4各組大鼠第28天血清的MDA含量。NC:正常對(duì)照組；DM:糖尿病組；AO:糖尿病抗氧化組(原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)組)；*與DM組比較，P < 0.05。表明可促使糖尿病鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化MDA水平降低。圖2為實(shí)施例4各組大鼠第28天血清的總抗氧化能力T-AOC。NC:正常對(duì)照組；DM:糖尿病組；A0:糖尿病抗氧化組(原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)組)；*與DM組比較，P < 0.05。表明采用磷脂復(fù)合物干預(yù)可促使糖尿病鼠體內(nèi)總抗氧化T-AOC水平明顯提
高
圖3為實(shí)施例5原花青素葉黃素磷脂復(fù)合物和環(huán)磷酰胺干預(yù)前后小鼠皮下腫瘤重量的變化。NS:空白對(duì)照組；CTX:環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組；磷脂復(fù)合物:原花青素葉黃素磷脂復(fù)合物干預(yù)組(AO) 與NS組比較，P < 0.05圖4為實(shí)施例6脂肪肝細(xì)胞加入原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物前后用油紅染色后鏡下觀察脂變細(xì)胞的比例。*表示與FFA組相比ρ < 0.05。圖5為實(shí)施例6原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于正常細(xì)胞的TG含量變化。*表示磷脂復(fù)合物組與FFA組相比ρ < 0.05。圖6為實(shí)施例6原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于正常細(xì)胞的ROS含量變化。*表示磷脂復(fù)合物組與FFA組相比ρ < 0.05。圖7為實(shí)施例6原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于正常細(xì)胞的MDA含量變化。*表示磷脂復(fù)合物組與FFA組相比ρ < 0.05。即與對(duì)照組FFA比較，脂質(zhì)過氧化MDA指標(biāo)明顯降低。圖8為實(shí)施例6 原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于正常細(xì)胞的GSH含量變化。磷脂復(fù)合物組與FFA脂肪肝細(xì)胞對(duì)照組相比GSH抗氧化水平明顯提1 ο ρ〈 0.05。圖9為實(shí)施例6原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)SOD活性變化。*表示磷脂復(fù)合物組與FFA組相比ρ < 0.05。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1取2kg多稀磷脂酰膽堿溶解在40升乙醇中，加入Ikg葡萄籽花青素和Ikgi1-胡蘿卜素，于40°C攪拌溶解至澄清，60°C真空濃縮、真空干燥，粉碎即得。取產(chǎn)品適量，溶于乙醇，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑，結(jié)果平均粒徑為88nm。實(shí)施例2取2.2kg大豆卵磷脂溶解在44升甲醇中，加入0.6kg松樹皮提取物和6.0kg玉米黃素，于20°C攪拌溶解至澄清，80°C真空濃縮、真空干燥，粉碎即得。取產(chǎn)品適量，溶于乙醇，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑，結(jié)果平均粒徑為6nm。實(shí)施例3取2.2kg磷脂酰乙醇胺溶解在66升乙醇中，加入Ikg藍(lán)莓花青素和0.1kg西紅花提取物，于70°C攪拌溶解至澄清，40°C真空濃縮、真空干燥，粉碎即得。取產(chǎn)品適量，溶于乙醇，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑，結(jié)果平均粒徑為600nm。
實(shí)施例4原花青素β -胡蘿卜素磷脂復(fù)合物抗氧化應(yīng)激改善糖尿病研究(I)材料和儀器健康雄性Wistar大鼠(購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物房)，葡萄籽原花青素β _胡蘿卜素磷脂復(fù)合物(按實(shí)施例1的方法制備得到)。微量血糖儀(穩(wěn)捷II型，Johnson產(chǎn)品)，熒光分光光度計(jì)(HITACHIF-2500)，722s分光光度計(jì)，SN-6930A型液閃儀 與SN-6100型Y計(jì)數(shù)器(上海核所日環(huán)光電公司)(2)方法(a)模型的建立和分組取健康雄性Wistar大鼠40只，體重140_170g之間，隨機(jī)分四4組，每組10只，設(shè)正常對(duì)照組(NC組)、普通糖尿病組(DM組)、和糖尿病抗氧化干預(yù)組(A0組)，普通飼食三天后，DM、AO三組均腹腔注射STZ 50mg/kg, NC組注射劑量相當(dāng)?shù)膒H4.4檸檬酸緩沖液。注射后NC和DM組給予普通飼料及普通飲水，AO抗氧化干預(yù)組給予普通飼料，以及葡萄桿花青素 β_ 胡蘿卜素憐脂復(fù)合物(grape seed proanthocyanidins extract-carotenenanoparticles, GSPE-C) 200mg.kg-1.d_l (使用時(shí)用生理鹽水配成1%的濃度)平均分兩次灌胃治療，其余組每次等量生理鹽水溶液灌胃，在GSPE-C治療期間，全部大鼠都用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。(b)血樣及組織標(biāo)本的采集注射STZ后3d、14d、28d空腹采鼠尾部血，用于檢測(cè)血糖、S0D、胰島素；其中28d大鼠麻醉處死后再心臟采血1ml，用于測(cè)血漿MDA及總抗氧化能力(T-AOC)。(C)生化指標(biāo)觀察血糖測(cè)定:取STZ注射后3d、14d、28d的空腹全血檢測(cè)。胰島素測(cè)定:取注射STZ后3d、14d、28d的血清，嚴(yán)格按胰島素放射免疫分析試劑盒操作說明測(cè)定胰島素。T-AOC的測(cè)定:用Fe3+還原法測(cè)定T-AOC的含量，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行測(cè)定。SOD的測(cè)定:用黃嘌呤氧化酶生物學(xué)化發(fā)光法測(cè)定血液樣品紅細(xì)胞SOD的活性。MDA的測(cè)定:用硫代戊巴比妥酸熒光法測(cè)定MDA。(d)數(shù)據(jù)分析所有計(jì)量資料均用±s表示，用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(3)結(jié)果(a)空腹血糖注射STZ后，各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，空腹血糖都呈升高趨勢(shì)(表I)，AO組的血糖28d較14d明顯下降，并顯著低于同時(shí)間點(diǎn)的DM組，表明采用葡萄籽花青素β-胡蘿卜素磷脂復(fù)合物抗氧化干預(yù)對(duì)DM鼠血糖升高具有一定抑制作用。表I各組大鼠空腹血糖(mmol/L)(又土s)
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化應(yīng)激作用的磷脂復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用一種由原花青素、類胡蘿卜素或富含原花青素、類胡蘿卜素的提取物與磷脂反應(yīng)形成的磷脂復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的磷脂復(fù)合物，其特征是所述原花青素與類胡蘿卜素的重量比為1: 0.1 10，原花青素和類胡蘿卜素之和與磷脂的重量比為1: 0.5 3。
3.如權(quán)利要求3所述的磷脂復(fù)合物，其特征是所述原花青素與類胡蘿卜素的重量比為1: 0.5 5，原花青素和類胡蘿卜素之和與磷脂的重量比為1: 0.8 1.5。
4.如權(quán)利要求1 3所述的磷脂復(fù)合物，其特征是，所述原花青素選自葡萄原花青素、松樹皮原花青素、桑葚原花青素、山楂原花青素、銀杏原花青素、沙棘原花青素、越橘原花青素、藍(lán)莓原花青素、蓮房原花青素。
5.如權(quán)利要求1 3的磷脂復(fù)合物，其特征是所述類胡蘿卜素選自α、β、Υ_胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素、番茄紅素、西紅花苷、西紅花酸、桅子黃素、玉米黃素、隱黃質(zhì)、新黃質(zhì)、檸黃質(zhì)、辣椒紅素、辣椒玉紅素、蝦紅素、海膽烯酮、蒲公英黃質(zhì)、紫菌紅素丁、胭脂樹橙和紅酵母紅素。
6.如權(quán)利要求1 3的磷脂復(fù)合物，其特征是所述磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸。
7.如權(quán)利要求1 3的磷脂復(fù)合物，其特征是所述磷脂復(fù)合物的粒徑在6 600nm。
8.如權(quán)利要求1所述復(fù)合物的制備方法，包括下述順序的步驟: (1)取原花青素和類胡蘿卜素溶于20 70°C的脂溶性溶劑中，得澄明液體； (2)加入相當(dāng)于原花青素和類胡蘿卜素0.5 3倍量的磷脂，接回流裝置，攪拌至溶液澄明； (3)40 80°C減壓濃縮，真空干燥至干，粉碎，即得磷脂復(fù)合物。
9.如權(quán)利要求8所述磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征是，步驟(1)所述脂溶性溶劑是指丙酮、乙醇、氯仿、甲醇。
10.如權(quán)利要求8所述磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征是，步驟(1)所述脂溶性溶劑優(yōu)選無水乙醇。
11.如權(quán)利要求1的磷脂復(fù)合物，其特征是具有顯著的抗氧化應(yīng)激作用，可制備用于預(yù)防或治療氧化應(yīng)激引起的腫瘤、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、脂肪肝和腦梗塞疾病。
12.如權(quán)利要求11的磷脂復(fù)合物，其特征是與醫(yī)藥學(xué)中接受的輔料一起加工成軟膠囊、硬明膠、片劑、顆粒劑、粉劑或口服液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由原花青素、類胡蘿卜素或富含原花青素、類胡蘿卜素的提取物與磷脂在乙醇、丙酮等脂溶性溶劑中反應(yīng)形成的磷脂復(fù)合物。該磷脂復(fù)合物可與醫(yī)藥學(xué)中接受的輔料一起加工成軟膠囊、硬膠囊、片劑、顆粒劑、粉劑或口服液，用于預(yù)防或治療氧化應(yīng)激引起的腫瘤、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、脂肪肝和腦梗塞疾病。
文檔編號(hào)A61K31/353GK103120798SQ20131000953
公開日2013年5月29日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者施冬云, 劉珊林, 謝飛舟 申請(qǐng)人:施冬云, 劉珊林, 謝飛舟