藥物制劑和其用于治療花生過敏的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及可以用于免疫治療的組合物，且特別涉及可用于經(jīng)受花生過敏的哺乳類，例如人類哺乳類的免疫治療的組合物。本發(fā)明還涉及本組合物用于通過免疫治療使經(jīng)受過敏的哺乳類的免疫系統(tǒng)脫敏的治療性治療的用途，和本組合物用于在對(duì)發(fā)展某種過敏有高度傾向的哺乳類中的預(yù)防性治療的用途。特別地，本發(fā)明涉及包括改性的完整全花生提取物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物，其中所述改性的全花生提取物是還原且隨后烷基化的全花生提取物，優(yōu)選包括可溶性花生仁蛋白質(zhì)如Ara?h1、Ara?h2和Ara?h6的脫脂全花生提取物。
【專利說(shuō)明】藥物制劑和其用于治療花生過敏的用途
[0001] 本發(fā)明涉及藥物制劑、或組合物，其可以在免疫治療中使用，并特別涉及可用于對(duì) 經(jīng)受花生過敏的哺乳類，例如人類哺乳類的免疫治療的制劑或組合物。本發(fā)明還涉及本制 劑或組合物用于通過免疫治療使經(jīng)受過敏的哺乳類的免疫系統(tǒng)脫敏的治療性治療的用途， 和本制劑或組合物用于在對(duì)發(fā)展某種過敏有高度傾向的哺乳類的預(yù)防性治療的用途。
[0002] 過敏原免疫治療，也稱為低敏治療、免疫脫敏、低敏（hyposensibilization)、或過 敏原特異性免疫治療，是用于過敏疾患的一種免疫治療形式，其中患者被接種越來(lái)越大劑 量的過敏原，即他們對(duì)其過敏的物質(zhì)或多種物質(zhì)，旨在誘導(dǎo)免疫耐受性。
[0003] 過敏原特異性免疫治療是治療過敏疾患的根本原因的唯一治療策略。這是極具成 本效益的治療策略，并導(dǎo)致改善的生活質(zhì)量。
[0004] 免疫治療已被證明產(chǎn)生過敏癥狀的長(zhǎng)期緩解、減少相關(guān)的過敏應(yīng)答的嚴(yán)重程度、 以及減少對(duì)過敏原的新的致敏的發(fā)展機(jī)會(huì)。免疫治療旨在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對(duì)過敏原的應(yīng)答。
[0005] 免疫治療通常涵蓋經(jīng)由例如舌下或皮下途徑重復(fù)暴露于特定過敏原，從而提供過 敏患者對(duì)過敏原的脫敏，并因此減少過敏癥狀和用于基于癥狀的治療。
[0006] 免疫治療潛在的確切機(jī)制不完全清楚，但被接受的是免疫治療導(dǎo)致對(duì)過敏原的免 疫應(yīng)答的改變。改變至少包括IgE合成的變化，和減少免疫系統(tǒng)對(duì)特定過敏原的過敏應(yīng)答 的IgE阻斷抗體的產(chǎn)生。還觀察到Th2向Thl/T調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的增加。在分子水平上，部分 潛在機(jī)制依賴于過敏原特異性IgG的優(yōu)先誘導(dǎo)以中和過敏原及過敏原特異性IgE的減少。
[0007] 免疫治療通常涉及使過敏患者暴露至低劑量的過敏原。劑量定期例如每周逐漸增 力口，直到達(dá)到"維持"劑量。這相當(dāng)于在約4個(gè)月中每周一次注射以達(dá)到維持劑量。一旦達(dá) 到維持劑量，施用注射較少，例如每月一次持續(xù)幾年。通常，治療越長(zhǎng)和劑量越高，治療收益 越大。
[0008] 成功完成免疫治療后，可以預(yù)期3至5年或更長(zhǎng)時(shí)間段的長(zhǎng)期保護(hù)。如果癥狀開 始復(fù)發(fā)，或如果個(gè)體發(fā)生暴露于未包括在先前治療方案中的新的過敏原，治療可重復(fù)進(jìn)行。
[0009] 花生是造成食物誘導(dǎo)的過敏的最常見的食物之一?；ㄉ^敏的根治性治療尚未獲 得。使用花生水提取物（aqueous peanut extract)的特異性免疫治療（SIT)顯示對(duì)經(jīng)口攝 入的花生的增加的耐受性。然而，如由Nelson等人（J. Allergy Clin. Immunol. 1997June ; 99 (6Ptl) :744-51)報(bào)道的，花生水提取物導(dǎo)致不可接受的全身反應(yīng)，甚至在維持注射期。因 此，Nelson等人得出結(jié)論："對(duì)于這種治療方法的臨床應(yīng)用，需要改性的花生提取物。"
[0010] 花生過敏的主要過敏原是花生種子C藏蛋白Ara hi (豌豆球蛋白）和Ara h2 (羽扇 豆球蛋白）。在最近的研究（Mov6rare 等人，Int Arch Allergy Immunol ;2011 ;第 282-290 頁(yè)）中，患有疑似花生過敏的大部分年輕的成年人具有針對(duì)Ara hi和Ara h2的IgE抗體。 除了這些主要過敏原，還報(bào)道了 IgE針對(duì)其它花生仁蛋白質(zhì)例如Arah6的反應(yīng)性。
[0011] 已經(jīng)描述花生過敏原Ara h2和Ara h6通過還原和烷基化的方法的改性提供這些 致敏蛋白質(zhì)的低致敏形式。低致敏性可通過固相免疫測(cè)定中減少的IgE結(jié)合，或通過激活 效應(yīng)細(xì)胞，如嗜堿性粒細(xì)胞顯示。然而，過敏原Ara h2和Ara h6不包括在花生中發(fā)現(xiàn)的所 有的過敏原，且僅基于Ara h2和Ara h6,因此沒有其它花生過敏原的免疫治療或免疫接種， 很可能不足以（預(yù)防地）治療花生過敏的個(gè)體或使其脫敏。
[0012] 還原和烷基化不可逆地裂解蛋白質(zhì)中的二硫鍵。Ara h2具有4個(gè)二硫鍵且Ara h6 具有6個(gè)二硫鍵。已表明，還原和烷基化引起Ara h2和Ara h6的二級(jí)結(jié)構(gòu)的重大變化，導(dǎo) 致IgE結(jié)合損失和效應(yīng)細(xì)胞的激活。然而，考慮到Ara h2以及在較小程度上的Ara h6僅形 成花生過敏致病因素的一部分，僅有Ara h2和Ara h6可能不足以治療花生過敏的個(gè)體。
[0013] 除了其它目標(biāo)以外，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供藥物組合物或制劑，用于花生過敏 的治療性或預(yù)防性治療。換言之，除了其它目標(biāo)以外，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供藥物組合物 或制劑，用于使患者對(duì)花生，或更具體地花生過敏原的脫敏。
[0014] 除了其它目標(biāo)以外，這些目標(biāo)通過如所附權(quán)利要求中限定的藥物組合物實(shí)現(xiàn)。
[0015] 具體地，根據(jù)第一方面，除了其它目標(biāo)以外，這些目標(biāo)，通過包括改性的全花生提 取物（modified whole peanut extract)和藥學(xué)上可接受的稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合 物實(shí)現(xiàn)，其中所述改性的全花生提取物是還原且隨后烷基化的全花生提取物。
[0016] 在本發(fā)明的上下文中，過敏原被定義為能夠通過免疫球蛋白E(IgE)的應(yīng)答刺激 特應(yīng)性哺乳類中的超敏反應(yīng)的抗原。大多數(shù)哺乳類僅作為針對(duì)寄生蟲感染的防御發(fā)動(dòng)顯著 免疫球蛋白E應(yīng)答。然而，一些哺乳類可以對(duì)許多普通的環(huán)境抗原響應(yīng)。此遺傳傾向也被命 名為特應(yīng)性。在特應(yīng)性哺乳類中，非寄生蟲抗原刺激不希望的IgE產(chǎn)生，導(dǎo)致超敏或過敏。
[0017] 在本發(fā)明的上下文中，全花生提取物是指包括花生中發(fā)現(xiàn)的基本上所有的種仁蛋 白質(zhì)的花生提取物。換句話說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的全花生提取物代表花生中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，并從 而代表花生過敏的致病因素（過敏原）。因此，除了 Ara h2和Ara h6,根據(jù)本發(fā)明的全花生 提取物還包括其它花生過敏原，其中主要的花生過敏原是Ara h 1。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，本全花生提取物通過還原與烷基化來(lái)改性，因此存在于全花生提取 物的蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂，隨后為烷基化，導(dǎo)致包括二硫鍵的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的不 可逆變化，并從而破壞這些蛋白質(zhì)中引起IgE過敏反應(yīng)的表位。
[0019] 還原二硫鍵的合適的劑（agent)是已知的且可以是，例如，2-巰基乙醇（β -ME)、 二硫蘇糖醇（DTT)、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、高半胱氨酸、三丁基膦、亞硫酸鹽、三（2-羧乙 基）膦（TCEP)、（氰基）硼氫化鈉、堿液、谷胱甘肽、E-巰基乙胺、巰基乙酸、甲硫醚或乙硫 醚。
[0020] 烷基化還原的半胱氨酸殘基的合適的劑是已知的且可以是，例如，是N-乙基馬來(lái) 酰亞胺、胱胺、碘乙酰胺、碘乙酸、烷基鹵化物、烷基硫酸鹽（alkylsulfate)、烯烴、或酶。
[0021] 考慮到相比Ara h2和Ara h6，Ara hi不包括二硫鍵，只有單一 Cys殘基，使包括主 要過敏蛋白質(zhì)Ara hi的全花生提取物經(jīng)受還原和甲基化從而減少其致敏性是令人驚訝的。 因此，Ara hi的還原和烷基化預(yù)期不會(huì)導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化和伴隨全花生提取物的IgE結(jié) 合損失和效應(yīng)細(xì)胞的激活。盡管這樣，特別是考慮到Ara hi是主要的花生過敏原，本發(fā)明人 驚奇地發(fā)現(xiàn)，還原和烷基化對(duì)Ara hi有作用，且從而對(duì)改性的花生提取物的致敏性有作用。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明該第一方面的優(yōu)選的實(shí)施方案，本全花生提取物在使花生提取物經(jīng)受 還原和烷基化之前被脫脂。除去脂類和其它脂肪物質(zhì)增加了提取物中的蛋白質(zhì)含量，并從 而增加了免疫原性IgE表位的相對(duì)數(shù)量，且從而增加了提取物的致敏性。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明該第一方面的又另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本全花生提取物包括可溶性 花生仁蛋白質(zhì)，更優(yōu)選包括至少Ara hi、Ara h2和Ara h6。可溶性花生仁蛋白質(zhì)代表花生蛋 白質(zhì)Ara hl、Ara h2和Ara h6的大多數(shù)，即便不是全部過敏原原因表位（allergen causing epitope)〇
[0024] 根據(jù)本發(fā)明該第一方面的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本全花生提取物是通過以下可獲 得的：
[0025] a)研磨花生以提供花生粉；
[0026] b)使用每50ml丙酮5克花生粉在丙酮中孵育所述花生30分鐘，以提供脫脂的花 生粉；
[0027] c)干燥所述脫脂的花生粉；
[0028] d)在具有在7和9之間的pH的緩沖液中懸浮所述干燥的花生粉；及
[0029] e)分離步驟（d)得到的上清液，從而提供全花生提取物。
[0030] 上述方法提供了可溶性花生過敏原蛋白質(zhì)的純化提取物，即富集可溶性花生仁蛋 白質(zhì)的提取物，其可以容易地經(jīng)受隨后的還原和烷基化。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明該第一方面的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本藥物組合物還包括鋁。 出人意料的是，發(fā)現(xiàn)添加鋁至本組合物進(jìn)一步減少本改性的全花生提取物的致敏性。
[0032] 因?yàn)轱@著減少的IgE結(jié)合，或IgE表位，本藥物組合物特別適合被用于對(duì)患者進(jìn)行 花生過敏脫敏的治療性治療中，優(yōu)選地，通過免疫治療或免疫接種。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，免疫治療包括以足夠的量且持續(xù)足夠的時(shí)間向經(jīng)受過敏的哺乳類， 優(yōu)選人類哺乳類施用本組合物，以減少、或消除所述哺乳類對(duì)所述過敏原的過敏應(yīng)答。
[0034] 典型的足夠的量將是以本組合物相對(duì)于其施用的個(gè)體體重計(jì)從約0. lng/kg至 10mg/kg、10ng/kg至約100μ g/kg、或0· 1 μ g/kg至1 μ g/kg。通常，治療將包括以在這些范 圍的下端的劑量的施用起始，并隨著治療的進(jìn)展增加劑量。
[0035] 對(duì)于脫敏治療，它通常需要患者接受頻繁的施用，例如，最初地每一、兩或三天，逐 漸減少到每?jī)苫蛉芤淮?。其它合適的脫敏方案包括皮下注射，每2-4周一次，注射的劑量 可在3-6個(gè)月的時(shí)期逐漸增加，且然后以每2-4周一次繼續(xù)注射，持續(xù)長(zhǎng)達(dá)約5年的時(shí)期。 給予每日施用也是可能的，特別是用于舌下施用。
[0036] 脫敏的方案還可以包括在各種等價(jià)替代形式中常規(guī)地被稱為快速脫敏、快速過敏 原免疫治療、快速過敏原接種、及快速或急速免疫治療的治療形式。從廣義上講，這個(gè)過程 旨在通過以頻繁（例如每小時(shí)）間隔，施用增加劑量的過敏原的一系列注射（或經(jīng)由另一 種合適的載體），以使過敏患者提前達(dá)到提取物（即，過敏原）的免疫或維持劑量。如果成 功的話，患者將會(huì)表現(xiàn)出對(duì)過敏原改善的抵抗，甚至可能呈現(xiàn)出對(duì)任何隨后的過敏原暴露 的完全無(wú)反應(yīng)性。
[0037] 各種脫敏方案是本領(lǐng)域已知的，并且可例如包括治療對(duì)過敏原具有速發(fā)型超敏反 應(yīng)的患者的方法，使用加速的快速免疫治療安排，與在接受加速的免疫治療之前用潑尼松 和組胺拮抗劑預(yù)治療這些患者的方法組合。
[0038] 本發(fā)明將在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的下述實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。在實(shí)施例 中，參考了附圖，其中：
[0039] 圖1 :顯示了個(gè)體花生過敏原和西班牙（Spanish)品種的提取物的rp-HPLC圖譜。 圖A (個(gè)體花生過敏原）：在7. 3ml處的峰：Ara h2 ;在9-9. 5ml處的峰：Ara h6 ;在11ml處 的峰：Ara hi。圖B(西班牙品種的提取物）：空白（MQ水）；在7. 3ml處的峰：Ara h2 ;在 9-9. 5ml 處的峰：Ara h6 ;在 11ml 處的峰：Ara hi ;
[0040] 圖2 :顯示了個(gè)體花生過敏原改性之前和之后的rp-HPLC圖譜。上圖：Ara hl，箭 頭指示改性之前（天然）和之后（RA)。中圖：Ara h2,箭頭指示改性之前（天然）和之后 (RA)。下圖：Arah6,箭頭指示改性之前（天然）和之后（RA);
[0041] 圖3 :顯示了個(gè)體花生過敏原改性之前和之后的遠(yuǎn)UV⑶光譜。上圖：Ara hl，箭 頭指示改性之前（天然）和之后（RA)。中圖：Ara h2,箭頭指示改性之前（天然）和之后 (RA)。下圖：Arah6,箭頭指示改性之前（天然）和之后（RA);
[0042] 圖4 :顯示了花生過敏小鼠激發(fā)后的體溫。上圖：以天然花生提取物（0. 1、0. 6、和 3mg/小鼠）激發(fā)。下圖：以改性的花生提取物（0. 1、0. 6、和3mg/小鼠）激發(fā)；
[0043] 圖5 :顯示了實(shí)施例6(A)中使用的致敏、脫敏和激發(fā)方案的時(shí)間線，和實(shí)施例7(B) 中使用的致敏、脫敏和激發(fā)方案的時(shí)間線；
[0044] 圖6:顯示了在第91天激發(fā)的小鼠的溫度（A)，與在第85天的肥大細(xì)胞激活（B; mMCP-1)；
[0045] 圖7 :顯示了在第112天激發(fā)的小鼠的溫度；
[0046] 圖8 :顯示了在第99天測(cè)試的所有組的血清中mMCP-1的水平；
[0047] 圖9 :顯示了在第99天測(cè)試的所有組的血清中IgE㈧、IgGl (B)
[0048] 和 IgG2a(C)的水平。 實(shí)施例
[0049] 實(shí)施例1.樣品采集和提取物的制備
[0050] I2 種花生樣品由 Maleki 博士（US Department of Agriculture, New Orleans, USA) 慷慨地提供，包括四種不同的品種（蘭納（Runner)、西班牙（Spanish)、巴倫西亞 (Valencia)和弗吉尼亞（Virginia))。這些品種通常在西歐和美國(guó)消費(fèi)。部分花生被烘烤 (在預(yù)熱的循環(huán)熱空氣烘箱中140°C持續(xù)15分鐘）。
[0051] 手工研磨花生并用丙酮脫脂（5克花生使用50mL丙酮脫脂30分鐘），并留在室 溫（RT)干燥過夜。以10mL50mM Tris HC1 pH8. 0(10% w/v)懸浮lg脫脂的花生粉，并在 RT攪拌1小時(shí)。隨后將樣品離心，并將上清液通過0. 2 μ m的纖維素膜過濾器（Whatman FP30/0, 2CA-S, Whatman GmbH, Dassel, Germany)過濾并用于進(jìn)一步的研究。
[0052] 提取物以等分試樣儲(chǔ)存在_20°C用于單次使用。蛋白質(zhì)濃度使用Bradford分 析測(cè)定。以牛血清白蛋白（BSA2mg/mL來(lái)自Pierce,IL,USA)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并稀釋至 50-500 μ g/mL的范圍。將粗花生提取物（CPE)以50mM Tris HC1 pH8. 0稀釋40x。將來(lái)自 Bio-Rad, USA的蛋白測(cè)定試劑以水稀釋5x。將20 μ L標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與lmL5x稀釋的試劑 混合，且將250 μ L的每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品置于有平面的平底平板（F型）（flat bottom plate withflat(F-type))的孔中。50mMTrisHClpH8.0被用作空白。結(jié)果總結(jié)于表1中。
[0053] 表1 :花生樣品和其提取物中的蛋白質(zhì)濃度。
[0054]
【權(quán)利要求】
1. 藥物組合物，所述藥物組合物包括改性的全花生提取物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑和 /或賦形劑，其中所述改性的全花生提取物是還原且隨后烷基化的全花生提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述全花生提取物是脫脂的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述全花生提取物包括可溶 性花生仁蛋白質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述全花生提取物包括Ara h 1、Ara h2 和 Ara h6。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述全花生提取物是通過以 下可獲得的： a) 研磨花生以提供花生粉； b) 使用每50ml丙酮5克花生粉在丙酮中孵育所述花生30分鐘，以提供脫脂的花生粉； c) 干燥所述脫脂的花生粉； d) 在具有在7和9之間的pH的緩沖液中懸浮所述干燥的花生粉；及 e) 分離步驟（d)得到的上清液，從而提供全花生提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包括鋁。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物，用于通過免疫治療來(lái)治療經(jīng)受過敏的 哺乳類。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述哺乳類是人類哺乳類。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物，用于針對(duì)所述過敏原使哺乳類的免疫 系統(tǒng)脫敏的治療性治療，或用于在與所述過敏原接觸后有發(fā)展過敏的高度傾向的哺乳類的 預(yù)防性治療。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述哺乳類是人類哺乳類。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物，用于藥物。
12. 用于免疫治療的方法，所述方法包括以足夠的量且持續(xù)足夠的時(shí)間向經(jīng)受過敏的 哺乳類、或處于發(fā)展過敏的風(fēng)險(xiǎn)的哺乳類施用根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物， 以減少、或消除所述哺乳類對(duì)所述過敏原的過敏應(yīng)答。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述哺乳類是人類哺乳類。
【文檔編號(hào)】A61K36/48GK104066433SQ201280061902
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】斯特凡·約翰·科佩爾曼, 喬安娜·寶琳娜·瑪麗亞·范德克雷杰 申請(qǐng)人:哈爾過敏控股有限公司