缺失d-乳酸產(chǎn)生并且具有改進(jìn)的貯藏期限的約氏乳桿菌菌株cncmi-1225的衍生物的制作方法

缺失d-乳酸產(chǎn)生并且具有改進(jìn)的貯藏期限的約氏乳桿菌菌株cncm i-1225的衍生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一般地涉及益生菌領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及具有改進(jìn)特性的約氏乳桿菌（Lactobacillus?johnsonii）菌株CNCM?I-1225的天然衍生物。例如，本發(fā)明涉及缺失D-乳酸產(chǎn)生并且在產(chǎn)品儲(chǔ)存期間表現(xiàn)出改進(jìn)的存活力的約氏乳桿菌菌株CNCM?I-1225的天然衍生物。
【專利說明】缺失D-乳酸產(chǎn)生并且具有改進(jìn)的貯藏期限的約氏乳桿菌菌株CNCM卜1225的衍生物
[0001]本發(fā)明一般地涉及益生菌領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及具有改進(jìn)特性的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。例如，本發(fā)明涉及缺失D-乳酸產(chǎn)生并且在氧暴露下表現(xiàn)出提高的存活力的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0002]人類分離物約氏乳桿菌CNCM 1-1225，也稱為約氏乳桿菌NCC533或者嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus) La1、或者約氏乳桿菌 Ljl (Bernet-Camard, M.F.，等人，(1997) Appl.Environ.Microbiol.63，2747-2753)是目前以商標(biāo)Lcl非常成功地商業(yè)化的益生菌。
[0003]通常對(duì)于含活的益生菌的產(chǎn)品而言，在生產(chǎn)此類產(chǎn)品時(shí)要確保細(xì)菌在貯藏期限期間仍存活是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@些微生物對(duì)氧暴露是敏感的。因此，期望的是可以得到表現(xiàn)出改進(jìn)的氧抗性的約氏乳桿菌CNCM 1-1225的衍生物。
[0004]約氏乳桿菌CNCM 1-1225具有幾種明確記錄的健康益處，其中例如，免疫調(diào)節(jié)活性(Haller, D.，等人，2000，Infect.1mmun.68:752-759 ；Haller, D.，等人，2000，Gut47:79-87 ；或 Ibnou-Zekri, N.，等人，2003, Infect.Tmmun.71:428-436)或病原體抑制(Bernet, M.F., et al., 1994, Gut, 35:483-489)以及長(zhǎng)期的安全使用歷史。
[0005]限制約氏乳桿菌CNCM 1-1225在一些產(chǎn)品種類，例如在意圖用于幼兒和嬰兒的產(chǎn)品中的應(yīng)用的一個(gè)方面是從糖的發(fā)酵中主要地產(chǎn)生了 D-乳酸同分異構(gòu)體。例如，如果在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，那么約氏`乳桿菌CNCM 1-1225將乳糖發(fā)酵成60:40%比率的D-和L-乳酸。
[0006]由于3歲以下嬰兒有限的D-乳酸清除(這可能導(dǎo)致D-乳酸酸中毒)，所以CODEXInfant Formula Directive建議3歲以下嬰兒避免消費(fèi)D-乳酸和產(chǎn)生D-乳酸的細(xì)菌。
[0007]支持該結(jié)論的證據(jù)是有限的，并且主要是基于食物中D-乳酸的存在，并且并沒有基于產(chǎn)生D-乳酸細(xì)菌(其是胃腸道的天然居民)的施用。
[0008]因此，一些出版物挑戰(zhàn)該立場(chǎng)(Connolly，E.等人，NTRAfoods3(3)，37-49，2004 ;Haschke-Becher, E.，等人，2008, Ann.Nutr.Metab.53:240-244, Mack, D.R., 2004, Can.J.Gastroenterol.18:671-675),但到目前為止，CODEX Infant Formula Directive 的建議仍沒有改變。
[0009]CODEX基本上排除了將產(chǎn)生D-乳酸的益生菌作為嬰兒制劑中的補(bǔ)充劑，但鼓勵(lì)只產(chǎn)生L-乳酸的菌株的遺傳改造。此類研發(fā)的實(shí)例是經(jīng)遺傳修飾的生物(GM0)，特別是經(jīng)遺傳修飾的約氏乳桿菌菌株的產(chǎn)生，其中分離了 d-乳酸脫氫酶(D-LDH)基因(ldhD)，并通過基因替換，將IdhD基因的體外截短的克隆拷貝用于失活基因組拷貝(Lapierre，L.，等人，1999, Appl.Environ.Microbiol.65:4002_4007)。
[0010]這種經(jīng)遺傳改造的菌株僅產(chǎn)生用于實(shí)驗(yàn)室目的，并且從未用于食物產(chǎn)品中，因?yàn)槭褂弥亟MDNA技術(shù)已經(jīng)改變了其遺傳物質(zhì)，并因此認(rèn)為該菌株是GM0。
[0011]然而，期望的是存在這樣的可能，其允許使約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的大量健康益處也可用于個(gè)體，對(duì)于所述個(gè)體，目前并不建議消費(fèi)D-乳酸或者產(chǎn)生D-乳酸的細(xì)菌。[0012]因此，本領(lǐng)域存在對(duì)天然益生菌株，特別是約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的強(qiáng)烈需求，所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物缺失D-乳酸產(chǎn)生，但盡管如此仍是存活的，并且其在產(chǎn)品中表現(xiàn)出提高的成活率。
[0013]本發(fā)明人滿足了這些需求。
[0014]因此，本發(fā)明的目的是為本領(lǐng)域提供約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物，其還可以應(yīng)用于意圖用于嬰兒和幼兒的產(chǎn)品，而且考慮了 CODEX Infant Formula Directive的當(dāng)前規(guī)定，所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物表現(xiàn)出改進(jìn)的貯藏穩(wěn)定性，并且其是天然的，并不會(huì)被認(rèn)為為GM0。
[0015]本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，他們可以通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。從屬權(quán)利要求進(jìn)一步發(fā)展了本發(fā)明的理念。
[0016]本發(fā)明人研究分離約氏乳桿菌Lal的天然的(非GM0)、活的和遺傳穩(wěn)定的變體的可能性，所述約氏乳桿菌Lal的變體只產(chǎn)生L-乳酸，并且其具有改進(jìn)的貯藏穩(wěn)定性。
[0017]基因組序列的改變以相對(duì)低的頻率天然地發(fā)生，例如由于損傷DNA的錯(cuò)誤修復(fù)或者DNA復(fù)制錯(cuò)誤。
[0018]為了尋找約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的此類天然衍生物，本發(fā)明人篩選了大約2 000個(gè)約氏乳桿菌CNCM 1-1225的菌落，并且已經(jīng)鑒定了一株可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的的天然D-乳酸缺失變體。
[0019]本發(fā)明人還測(cè)定了 MRS培養(yǎng)上清液中的D-和L-乳酸濃度，并且顯示與培養(yǎng)上清液中總的乳酸濃度比較，相對(duì)D-乳酸濃度低于1.5% ;即約1.1%。
[0020]DNA序列分析鑒定了乳酸脫氫酶基因中主要的點(diǎn)突變，所述點(diǎn)突變改變酶的氨基酸序列，并因此改變其催化特性。
[0021]天然衍生物顯示出是可存活的并且穩(wěn)定的，并沒有回復(fù)至D-乳酸產(chǎn)生的實(shí)例。
[0022]本發(fā)明人還評(píng)估了在8°C和在15°C的貯存穩(wěn)定性，并且已經(jīng)將鑒定的衍生物與約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225比較。與約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225相比，鑒定的衍生物表現(xiàn)出顯著改進(jìn)的貯藏期限。本發(fā)明人還將該菌株的貯藏穩(wěn)定性與約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的其他衍生物進(jìn)行了比較，并且發(fā)現(xiàn)該天然衍生物表現(xiàn)出最好的貯藏期限。
[0023]因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物缺失D-乳酸產(chǎn)生，并且與約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225比較，表現(xiàn)出增加的貯藏期限。
[0024]據(jù)本發(fā)明人了解，這是第一次提供了與約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225比較，缺失D-乳酸產(chǎn)生并且表現(xiàn)出增加的貯藏期限的約氏乳桿菌菌株CNCM `1-1225的天然衍生物。
[0025]“缺失D-乳酸產(chǎn)生”意為本發(fā)明的目的，與總?cè)樗岙a(chǎn)生比較，菌株產(chǎn)生5%以下，優(yōu)選地2%以下，甚至更優(yōu)選地1.5%以下，和理想地約1.1%的D-乳酸?？梢栽跓o細(xì)胞培養(yǎng)上清液中測(cè)量D-和L-乳酸濃度。
[0026]由約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物產(chǎn)生的乳酸的總量最初與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期和停止分裂時(shí)，它們繼續(xù)代謝糖并產(chǎn)生更多的乳酸。然而，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的D-和L-乳酸的比率是恒定的。
[0027]約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的“天然”衍生物意為不被認(rèn)為是GMO的菌株。例如可以通過篩選經(jīng)歷了天然發(fā)生的基因組序列改變(例如，由于損傷DNA的錯(cuò)誤修復(fù)或者DNA復(fù)制錯(cuò)誤)的菌落，來獲得此種天然衍生物。通過使菌落經(jīng)歷脅迫條件，例如通過應(yīng)用甲磺酸乙酯EMS可以增強(qiáng)錯(cuò)誤的這種天然發(fā)生。
[0028]出于本申請(qǐng)的目的，術(shù)語“GM0”應(yīng)當(dāng)根據(jù)2001年3月12日對(duì)于故意釋放經(jīng)遺傳修飾的生物到環(huán)境中的 DIRECTIVE2001/18/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THECOUNCIL并且廢除Council Directive90/220/EEC進(jìn)行定義。因此，“經(jīng)遺傳修飾的生物(GM0)”意為除人類之外的這樣的生物，其中遺傳物質(zhì)已經(jīng)以不是通過交配和/或自然重組天然發(fā)生的方式改變。
[0029]就該定義而言，遺傳修飾至少通過以下技術(shù)的使用發(fā)生
[0030](I)重組核酸技術(shù)，其涉及將在生物之外的通過任何手段產(chǎn)生的核酸分子插入到任何病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)中，并摻入到宿主生物，它們并非天然存在于所述宿主生物中但是它們能繼續(xù)增殖，來形成的遺傳物質(zhì)的新組合；
[0031](2)涉及將在生物之外制備的可遺傳物質(zhì)直接引入到生物中的技術(shù)，包括顯微注射法、宏觀注射法和微囊法；或
[0032](3)細(xì)胞融合(包括原生質(zhì)體融合)或雜交技術(shù)，其中使用并非天然存在的方法，通過融合兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞形成具有可遺傳的遺傳物質(zhì)的新組合的活細(xì)胞。
[0033]如果菌株具有至少99.95%，例如至少99.99%，優(yōu)選地至少99.995%的核酸同一性，那么認(rèn)為菌株是約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的“衍生物”。例如，如果與約氏乳桿菌CNCM1-1225的核酸序列比較，菌株具有500個(gè)以下，例如100個(gè)以下，優(yōu)選地50個(gè)以下的核酸改變，那么認(rèn)為該菌株是約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物。
[0034]如果細(xì)菌菌株在8°C和/或15°C儲(chǔ)存45天后，在Lcl飲用產(chǎn)品中顯示出增加的存活，那么認(rèn)為該細(xì)菌菌株“與約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225比較，顯示出增加的貯藏期限”。因此，在產(chǎn)品中使用本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物在貯藏期限的最后會(huì)導(dǎo)致增加的活細(xì)菌數(shù)量。
[0035]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物在負(fù)責(zé)D-乳酸缺失表型的d-ldh基因中顯示出突變。
[0036]因此，約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物具有改變的D-乳酸脫氫酶序列。例如，約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以在D-乳酸脫氫酶序列的氨基酸位置77處包含精氨酸至組氨酸的氨基酸改變。
[0037]這種改變明顯顯著改變了 D-乳酸脫氫酶的功能，從而產(chǎn)生了極少的或者不會(huì)產(chǎn)生D-乳酸。
[0038]D-乳酸脫氫酶蛋白質(zhì)序列的這種改變基于D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列的改變。
[0039]失活所得的酶的D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列的任何天然改變都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的主題。此外，野生型序列或者一部分或整個(gè)D-乳酸脫氫酶基因內(nèi)一個(gè)或多個(gè)后續(xù)(subsequent)核苷酸的至少一個(gè)缺失都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的主題。
[0040]本發(fā)明人分析了本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列。
[0041]因此，本發(fā)明還涉及約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中在約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列包含在核酸位置270處G至A的轉(zhuǎn)換。
[0042]盡管導(dǎo)致D-乳酸脫氫酶失活的此種改變?cè)诖笞匀恢锌梢砸缘皖l率自發(fā)地發(fā)生，但其是隨機(jī)的，并且可以以相同的頻率修復(fù)回親本序列(野生型)。
[0043]如果失活的基因賦予了變體生長(zhǎng)缺陷，那么這種修復(fù)頻率可以甚至更高?？紤]到從培養(yǎng)物保藏到最終產(chǎn)品之間的大量傳代，重要的是此種改變是穩(wěn)定的，特別是因?yàn)槠涫菃螇A基對(duì)改變，其在遺傳上比缺失更不穩(wěn)定。
[0044]有利地，還發(fā)現(xiàn)該改變是穩(wěn)定的。
[0045]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的一個(gè)實(shí)例是分離的、純化的，并且詳細(xì)表征的。
[0046]因此，本發(fā)明涉及約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以是約氏乳桿菌CNCM 1-4437。
[0047]約氏乳桿菌CNCM 1-4437根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2011年2月8日保藏于國立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)), InstitutPasteur, 25Rue du Docteur Roux, F_75724Paris Cedexl5,法國。
[0048]菌株是已經(jīng)完全測(cè)序的。
[0049]約氏乳桿菌CNCM 1-1225在布達(dá)佩斯條約下于1992年6月30日保藏于CNCM。
[0050]約氏乳桿菌CNCM 1-4437含有總共23個(gè)改變，包括該菌株中負(fù)責(zé)缺失D-乳酸產(chǎn)生的D-乳酸脫氫酶基因的期望改變。在預(yù)測(cè)對(duì)生長(zhǎng)起重要作用的兩種基因中存在改變，即LJ0874-磷酸丙糖異構(gòu)酶和LJ0515-磷酸甲基嘧啶激酶。在MRS培養(yǎng)基中，與Lal比較，約氏乳桿菌CNCM 1-4437以相似的速率生長(zhǎng)，因此上述改變沒有顯示出不利影響。值得注意的是LJ1658 -雙組分調(diào)節(jié)子的組`氨酸激酶中的第二個(gè)改變。該菌株的初步表達(dá)譜顯示出構(gòu)成可能對(duì)甘露糖特異的PTS操縱子的五種基因，LJ1652至LJ1656的顯著下調(diào)。與Lal比較，這不會(huì)導(dǎo)致糖發(fā)酵模式的任何改變，但這可能歸因于Lal中幾種預(yù)測(cè)的甘露糖PTS系統(tǒng)的存在。
[0051]本發(fā)明還延伸至根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物以在生物學(xué)上純的培養(yǎng)物存在。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以根據(jù)任何合適的方法培養(yǎng)，并可以通過例如冷凍干燥或者噴霧干燥制備用于添加到本發(fā)明的組合物。
[0053]益生菌菌株約氏乳桿菌CNCM 1-1225提供了許多明確記錄的健康益處，其中一些在上文中進(jìn)行了詳述。
[0054]“益生菌”意為對(duì)宿主的健康或保健具有有益作用的微生物細(xì)胞制備物或者微生物細(xì)胞的組分(Salminen S,等人“Probiotics:how should they be defined’’Trends FoodSc1.Technol.1999:10107_10)。
[0055]就提供的健康益處而言，基本上可以把根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物看作生物等同物(bioequivalent)。
[0056]科學(xué)工作顯示，分離自在生物學(xué)上純的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的培養(yǎng)物的無細(xì)胞培養(yǎng)上清液也具有幾種健康益處(參見例如，Bernet-Camard, M._F.，等人，1997，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，第 2747 - 2753 頁)。
[0057]因此，本發(fā)明還延伸至分離自在生物學(xué)上純的根據(jù)本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物的培養(yǎng)物的無細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
[0058]由于本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和無細(xì)胞培養(yǎng)上清液具有大量健康益處，因此可以將它們用于治療或預(yù)防人類或動(dòng)物體的疾病。
[0059]因此，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物，用于制備在通過療法治療人類或動(dòng)物體的方法中的組合物。
[0060]本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物的用途，用于制備藥物組合物或者藥物。
[0061]已經(jīng)詳細(xì)研究了約氏乳桿菌CNCM 1-1225的益生菌相關(guān)活性，包括免疫調(diào)節(jié)(Haller, D.，等人，2000，Infect.1mmun.68，752-759 ；Haller,D.，等人，2000，Gut47，79-87 ；Ibnou-Zekri, N.,等人,2003, Infect.1mmun.71,428-436)、病原體抑制(Bernet, M.F.,等人，1994，Gut35，483-489)和上皮細(xì)胞附著(Neeser，J.R.，等人，2000，GlycobiologylO,1193-1199 ；Granato, D.，等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65，1071-1077)。
[0062]由于生物等同性(bioequivalence),根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或其無細(xì)胞培養(yǎng)上清液提供了相同的健康益處。
[0063]因此，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物，用于治療或預(yù)防與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥。
[0064]本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的用途，用于制備治療或預(yù)防與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥的組合物。
[0065]與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥是本領(lǐng)域熟知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，哪些病癥與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)。
[0066]與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的病`癥的一般實(shí)例可以選自流感、鼻炎、普通感冒及其組
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[0067]還可以將包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物用于治療或預(yù)防與由于腸毒性細(xì)菌或病毒的細(xì)胞附著和細(xì)胞侵入相關(guān)的病癥。
[0068]本發(fā)明還延伸至根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的用途，用于制備治療或預(yù)防與由于腸毒性細(xì)菌或病毒的細(xì)胞附著和細(xì)胞侵入相關(guān)的疾病的組合物。
[0069]腸毒性細(xì)菌或病毒是本領(lǐng)域熟知的。歐洲食品安全局(European Food SafetyAuthority) (EFSA)已經(jīng)在2010年11月公布了病原體的列表。
[0070]例如，腸毒性細(xì)菌或病毒可以選自沙門氏菌屬(Salmonella);彎曲桿菌屬(Campylobacter);利斯特氏菌屬(Listeria);大腸桿菌菌株，例如如ETEC、EHEC> EPEC或EIEC菌株；耶爾森菌屬(Yersinia);志賀氏菌屬(Shigella);產(chǎn)毒素細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)或臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus) ；Vibrio vulnifucus/parahaemoIyticus (副溶血弧菌)；輪狀病毒(rotavirus);類諾瓦克病毒(norovirus);產(chǎn)vero細(xì)胞毒素大腸桿菌(verotoxigenicE.coli )；阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii );產(chǎn)毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌(toxigenicC.perfringens) (A型和B型)；食源性寄生蟲，如棘球?qū)?Echinococcus)、弓形體屬(Toxoplasma)或賈第鞭毛蟲屬(Giardia);幽門螺桿菌(Helicobacter pylori);艱難梭菌(Clostridium difficile);破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)及其組合。
[0071]本領(lǐng)域技術(shù)人員明確，哪種病癥與哪種腸毒性細(xì)菌或病毒物種相關(guān)。
[0072]例如，與由于腸毒性細(xì)菌或病毒物種的細(xì)胞附著和細(xì)胞侵入相關(guān)的病癥可以選自下呼吸道感染、胃腸道感染、中耳炎及其組合。
[0073]本發(fā)明組合物可以是任何類型的組合物，只要其適合于施用給人類或動(dòng)物。
[0074]特別地，本發(fā)明組合物可以口服地、腸內(nèi)地、腸胃外地或者局部地施用?？梢砸酝ǔ?duì)于選定的施用模式可用的任何蓋倫形式提供組合物。
[0075]可以將本發(fā)明組合物施用給任何年齡組。
[0076]優(yōu)選地，可以在冷季，例如從秋天至春天期間，施用本發(fā)明組合物。
[0077]還可以在任何時(shí)間消費(fèi)本發(fā)明組合物。優(yōu)選地，在早晨消費(fèi)本發(fā)明組合物，例如以增強(qiáng)一天的免疫系統(tǒng)。
[0078]組合物可以例如選自食物組合物、寵物食物組合物、飲料、乳制品、營(yíng)養(yǎng)配方、嬰兒配方奶粉、食物添加劑、營(yíng)養(yǎng)治療品、藥物組合物、食物成分和/或美容組合物。
[0079]例如，組合物可以選自酸化的乳產(chǎn)品，例如酸奶或酸奶飲料；或者基于乳的粉末。
[0080]如果以貯藏穩(wěn)定粉 末的形式提供組合物，那么特別優(yōu)選的是粉末狀產(chǎn)品。為了獲得貯藏穩(wěn)定性，并且確保益生菌的存活，可以以0.2以下，例如0.19-0.05，優(yōu)選地0.15以下的水活度提供組合物。水活度或aw是系統(tǒng)中水的能量狀態(tài)的測(cè)量。其定義為來源于粉末/產(chǎn)品的水的蒸汽壓除以在相同溫度下純水的蒸汽壓；因此，純蒸餾水具有恰好為I的水活度。
[0081]本發(fā)明組合物可以是清潔劑、保護(hù)劑、治療或護(hù)理乳膏、護(hù)膚洗劑、凝膠劑或泡沫齊?，如清潔或消毒洗劑、洗浴組合物或除臭組合物。
[0082]更特別地，對(duì)于用于外部局部施用的組合物，它們可以是水溶液、水-醇溶液或油性溶液、洗劑或漿液類型的溶液或分散劑、通過分散水相包脂肪相(0/W)或反過來(W/0)獲得的液體或半液體稠度的乳型乳劑或者軟的、半固體或固體稠度的乳膏型混懸劑或乳劑、水凝膠或無水凝膠劑、微乳劑、微膠囊劑、微粒或者離子和/或非離子型的多孔分散劑。
[0083]根據(jù)本發(fā)明的局部組合物可以有利地以適合于護(hù)發(fā)的任何蓋倫形式，特別地以洗發(fā)液、香波，特別地去屑香波、護(hù)發(fā)素、護(hù)發(fā)素、發(fā)乳或凝膠、styling lacquer、hairsettinglotion、治療洗劑、染色組合物(特別地氧化染色)的形式，任選地以染色香波、頭發(fā)重構(gòu)洗劑、永久波動(dòng)組合物(a permanent-waving composition)、抗脫發(fā)洗劑或凝膠劑、抗寄生蟲香波或藥用香波，特別低抗-皮脂溢香波、頭皮護(hù)理產(chǎn)品(其特別地抗刺激、抗老化或者重建，或者其活化血液循環(huán))的形式配制。
[0084]當(dāng)本發(fā)明組合物是乳劑時(shí)，相對(duì)于組合物的總重量，脂肪相的比率按重量計(jì)可以為5%至80%，以及優(yōu)選地按重量計(jì)10%至50%。在乳劑形式的組合物中使用的油、乳化劑和輔助乳化劑可以選自那些在化妝品和/或皮膚病領(lǐng)域中常規(guī)使用的那些油、乳化劑和輔助乳化劑。相對(duì)于組合物的總重量，在組合物中，乳化劑和輔助乳化劑按重量計(jì)可以以0.3%至30%，以及優(yōu)選地按重量計(jì)0.5%至20%的比率存在。
[0085]當(dāng)本發(fā)明的組合物是油性凝膠劑或溶液劑時(shí)，脂肪相可以占組合物的總重量的90%以上。[0086]用于局部施用的蓋倫形式還可以含有在化妝品、藥物和/或皮膚病領(lǐng)域中常用的佐劑，例如親水性或親脂性膠凝劑、親水性或親脂性活性劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香味劑、填充劑、掩蔽物(screens)、吸味劑和染料。這些多種佐劑的量為那些常規(guī)用于所考慮領(lǐng)域的量，并且例如為組合物的總重量的0.01%至20%。取決于其性質(zhì)，可以將這些佐劑引入到脂肪相中和/或水相中。
[0087]對(duì)于可以用于本發(fā)明的脂肪物質(zhì)，提及的包括礦物油例如如氫化聚異丁烯和液體石油凝膠、植物油例如如牛油樹脂的液體級(jí)分、向日葵油和杏仁油、動(dòng)物油例如如全氫角鯊?fù)?、合成油，特別地Purcellin oil、肉豆蘧酸異丙酯和棕櫚酸乙基己酯、不飽和脂肪酸和氟代油例如如全氟聚醚。還可以使用脂肪醇、脂肪酸例如硬脂酸和例如如蠟，特別地石蠟、臘棕櫚蠟和蜂蠟。還可以使用硅酮化合物例如硅酮油和例如環(huán)甲基硅酮和二甲硅油，以及硅酮蠟、樹脂和樹膠。
[0088]對(duì)于可以用于本發(fā)明的乳化劑，提及的例如包括硬脂酸甘油酯、聚山梨酯60、由Henkel公司以名稱Sinnowax AO⑩銷售的包含33摩爾環(huán)氧乙烷的鯨蠟基硬脂醇/氧乙烯化鯨蠟基硬脂醇的混合物、由Gattefosse公司以名稱TefOSei) 63銷售的PEG-6/PEG-32/甘油硬脂酸酯的混合物、PPG-3肉豆寇基醚、娃酮乳化劑例如cetyl dimethicone copolyol和山梨醇酐單硬脂酸酯或三硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯或者氧乙烯化山梨聚糖單硬脂酸酯(20E0)。
[0089]對(duì)于可以用于本發(fā)明的溶劑，提及的包括低級(jí)醇，特別地乙醇和異丙醇，以及丙二醇。
[0090]本發(fā)明組合物還可以有利地含有泉水和/或礦質(zhì)水，特別地選自Vittel水、來自Vichy盆地的水和la Roche Posay水。
[0091]對(duì)于親水性膠凝劑，提及的可以包括羧基聚合物如卡波姆、丙烯酸共聚物如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酰胺`，以及特別地由SEPPIC公司以名稱Sepigel 305?.銷售的聚丙烯酰胺、C13-14異構(gòu)燒烴和Laureth_7的混合物、多糖例如衍生物如羥基烷基纖維素，和特別地羥基丙基纖維素和羥基乙基纖維素、天然樹膠如瓜爾豆膠、豆角膠、角豆膠和黃原膠，以及粘土。
[0092]對(duì)于親脂性膠凝劑，提及的可以包括經(jīng)修飾的粘土如有機(jī)皂土、脂肪酸的金屬鹽如硬脂酸鋁和疏水性二氧化硅或者乙基纖維素和聚乙烯。
[0093]根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以構(gòu)成清潔皂或條的固體制劑。
[0094]還可以將它們以溶液劑、乳膏、凝膠劑、乳劑或慕斯形式或者備選地以還含有壓力下的推進(jìn)劑的氣霧劑組合物形式用于頭皮。
[0095]在用于口服施用的根據(jù)本發(fā)明的口服用途的情況下，優(yōu)選的是使用可消化的支持體或載體。取決于所考慮的組合物的類型，可消化的支持體或載體可以具有不同的性質(zhì)。
[0096]乳、酸奶、奶酪、發(fā)酵乳、基于乳的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于谷物的產(chǎn)品或者基于發(fā)酵的谷物的產(chǎn)品、早餐谷物、谷物或格蘭諾拉麥片棒、基于乳的粉末、幼兒和嬰兒配方、糖食的食物產(chǎn)品、巧克力或谷物類型、特別地用于家畜的動(dòng)物飼料、片劑、凝膠膠囊或錠劑、液體細(xì)菌混懸劑、干燥形式的口服補(bǔ)充劑或液體形式的口服補(bǔ)充劑都特別適合作為可消化的支持體或載體。[0097]待口服施用的根據(jù)本發(fā)明的組合物可以例如以包衣的片劑、凝膠膠囊、凝膠劑、乳劑、片劑、膠囊劑、水凝膠、食物棒、壓縮的或者松散的粉末、液體混懸劑或溶液劑、甜食產(chǎn)品、發(fā)酵乳、發(fā)酵乳酪、口香糖、牙膏或噴霧溶液或者食物載體的形式配制。
[0098]干燥形式的片劑或錠劑、口服補(bǔ)充劑，以及以液體形式的口服補(bǔ)充劑適合用作為飲食或藥物支持體或者食物載體。
[0099]具體而言，可以通過產(chǎn)生糖-包衣片劑、凝膠膠囊、凝膠劑、乳劑、片劑、膠囊劑和允許控釋的水凝膠的常用方法配制組合物，例如食物補(bǔ)充劑。
[0100]具體而言，可以將根據(jù)本發(fā)明的微生物摻入到所有形式的食物補(bǔ)充劑或強(qiáng)化食物，例如食物棒或者壓縮的或非壓縮的粉末中?？梢詫⒎勰┫♂層谒⑻K打水、乳制品或大豆衍生物中，或者可以摻入到食物棒中。
[0101]此外，可以使用用于此類口服組合物或食物補(bǔ)充劑的常用的賦形劑和組分，具體而言即脂肪和/或含水組分、潤(rùn)濕劑、增稠劑、防腐劑、質(zhì)地改進(jìn)劑、風(fēng)味增強(qiáng)劑和/或包衣劑、抗氧化劑、防腐劑和常規(guī)用于食品工業(yè)的染料，配制本發(fā)明的微生物、其部分和/或其代謝物。
[0102]用于口服組合物，以及具體而言用于食物補(bǔ)充劑的配制劑和賦形劑是本領(lǐng)域已知的，并不是本文中詳細(xì)描述的主題。
[0103]在治療性應(yīng)用中，以足以至少部分治愈或者抑制疾病及其并發(fā)癥的癥狀的量施用組合物。將足夠?qū)崿F(xiàn)該目的的量定義為“治療有效劑量”。對(duì)于該目的有效的量將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多因素，例如疾病的嚴(yán)重程度和患者的體重和一般狀態(tài)。
[0104]在預(yù)防性應(yīng)用中，以足以至少部分降低發(fā)展中的疾病的風(fēng)險(xiǎn)的量將根據(jù)本發(fā)明的組合物施用給對(duì)特定疾病敏感或者另外地處于特定疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者。將該量定義為“預(yù)防有效劑量”。此外，精確的量取決于許多的患者特定因素，例如患者的健康狀態(tài)和體重。
[0105]本發(fā)明組合物以治療或預(yù)防有效劑量包含本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的至少一種天然衍生物和/或無細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
[0106]本領(lǐng)域技術(shù)人員能相應(yīng)地調(diào)整劑量。
[0107]例如，組合物可以以每天劑量106_1012cfu，例如108_1010cfu的量包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0108]以前的工作還顯示，可以將非復(fù)制性約氏乳桿菌CNCM 1-1225用于治療或預(yù)防與免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥包括感染，參見W02010/133475，所述文獻(xiàn)全部并入本文作為參考。發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌CNCM 1-1225強(qiáng)烈地誘導(dǎo)了組成型hBDl表達(dá)，并且經(jīng)熱處理的約氏乳桿菌CNCM 1-1225比其活的對(duì)應(yīng)物更強(qiáng)烈上調(diào)hBDl。
[0109]因此，根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物還可以以非復(fù)制性形式存在。
[0110]約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的“非復(fù)制性”天然衍生物包括已經(jīng)經(jīng)熱處理的衍生物。這包括滅活的、死的、不存活的和/或表現(xiàn)為片段如DNA、代謝物、胞質(zhì)化合物和/或細(xì)胞壁物質(zhì)的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0111]“非復(fù)制性”意為通過經(jīng)典的平板方法沒有檢測(cè)到活細(xì)胞和/或菌落形成單位。此類經(jīng)典的平板方法總結(jié)于微生物教科書:James Monroe Jay, Martin J.Loessner, avidA.Golden。 2005。 Modern food microbiology。第 7 版，Springer Science, New York,N.Y.第790頁中。通常，不存在活細(xì)胞可以表現(xiàn)如下:在瓊脂板上沒有可見的菌落或者在用不同濃度的細(xì)菌制備物(‘非復(fù)制性’樣品)接種，并在合適的條件(有氧和/或厭氧氣氛至少24個(gè)小時(shí))下溫育后，在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中混濁度沒有增加。
[0112]顯而易見，非復(fù)制性微生物不會(huì)形成菌落，因此，應(yīng)將該術(shù)語理解為獲自106-1012cfu/g可復(fù)制細(xì)菌的非復(fù)制性微生物的量。
[0113]組合物還可以以每天劑量0，005mg - 5000mg,例如0.5mg_50mg的量包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0114]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離所公開的本發(fā)明范圍的情況下，他們可以自由地組合本文中所述的本發(fā)明的全部特征。具體而言，可以將用于本發(fā)明的用途所述的特征應(yīng)用于本發(fā)明的食物，并且反之亦然。
[0115]本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特征從以下實(shí)施例和附圖中是顯而易見的。
[0116]圖1顯示了用甲磺酸乙酯處理的約氏乳桿菌CNCM 1-1225的‘存活曲線’。
[0117]圖2顯示了從G堿基的氧化到DNA鏈的分離的天然突變的分子過程，其產(chǎn)生了親本和經(jīng)修飾的DNA類型的混合物，以及混合的親本和經(jīng)修飾的菌落。
[0118]圖3顯示約氏乳桿菌CNCM 1-1225D-乳酸脫氫酶基因的基因序列(SEQ ID N0:1),并圈出了在約氏乳桿菌CNCM 1-4437中的相應(yīng)基因中鑒定的改變。還用約氏乳桿菌CNCM1-4437的相應(yīng)改變顯示了翻譯的D-乳酸脫氫酶(SEQ ID N0:2)。
[0119]圖4A顯示與親本菌株約氏乳桿菌CNCM 1-1225 (G)比較，具有在位置230處加框和改變的堿基的約氏乳桿菌CNCM 1-4437D-乳酸脫氫酶基因的基因序列(SEQ ID N0:6)。
[0120]圖4B顯示與親本菌株約氏乳桿菌CNCM I_1225(R)比較，具有在位置77處加框和改變的氨基酸的約氏乳桿菌CNCM 1-4437D-乳酸脫氫酶基因的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0:7)。
`[0121]實(shí)施例1.甲磺酸乙酯處理約氏乳桿菌CNCM 1-1225培養(yǎng)物。用Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水洗滌100 μ I含大約108個(gè)菌落形成單位的16個(gè)小時(shí)的約氏乳桿菌CNCM 1-1225培養(yǎng)物的樣品3次。最后，將細(xì)胞懸浮在Iml PBS中，并加入O或10 μ I甲磺酸乙酯并在370C，在沒有振蕩的情況下溫育。在PBS中洗滌經(jīng)處理的細(xì)胞2次，測(cè)定經(jīng)處理的和未處理培養(yǎng)物的CFU，并作為存活者作圖，以產(chǎn)生圖1中所述的‘存活曲線’。最初靶向了產(chǎn)生1%存活者的條件，并用之前和之后的時(shí)間點(diǎn)歸類，稀釋細(xì)胞，并在MRS平板上接種為單個(gè)菌落用于計(jì)數(shù)。然后，將剩余的經(jīng)處理的細(xì)胞用于接種IOml MRS肉湯，并在37°C溫育16小時(shí)。然后，稀釋培養(yǎng)物，并鋪展在MRS平板上，以產(chǎn)生用于篩選的單個(gè)菌落。
[0122]如圖2中所示，當(dāng)通過DNA復(fù)制解析時(shí)，在細(xì)菌中主要通過雙鏈DNA中鳥苷(G)殘基的氧化，天然地發(fā)生突變，并通常產(chǎn)生單堿基對(duì)改變。取決于所測(cè)序的DNA鏈，這導(dǎo)致G至腺苷(A)和胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)改變的天然突變譜。甲磺酸乙酯起著化學(xué)氧化G堿基的作用，并導(dǎo)致與天然突變相同的突變譜，即取決于所測(cè)序的DNA鏈，G至A和C至T。這隨后通過D-乳酸脫氫酶基因和基因組序列的DNA測(cè)序進(jìn)行了確證，其中大多數(shù)觀察到的改變都是G至A或C至T。
[0123]實(shí)施例2.篩選缺失D-乳酸產(chǎn)生菌株的各個(gè)菌落。將各個(gè)經(jīng)甲磺酸乙酯處理的菌落挑取到含200 μ I MRS肉湯的96孔板中，并在37°C溫育24小時(shí)，以形成最小的培養(yǎng)物。使用Tecan sunrise微孔板讀取器,通過620nm處的吸光度估計(jì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。用190 μ I含 IOOmM Tris HCl pH9,2.5mM EDTA pH8.0,20U/ml D-乳酸脫氫酶(來自 Leuconostocmesenteroides), lmg/ml NAD ( β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)加上3%水合肼的反應(yīng)混合物混合10 μ I的培養(yǎng)上清液，并在室溫溫育I小時(shí)。然后使用Tecan sunrise微孔板讀取器測(cè)量320nm (形成β -NADH)的吸光度，并將數(shù)據(jù)輸出至excel用于分析。在每一平板上，將含僅MRS和5%、25%、50%或100%濃度的約氏乳桿菌CNCM 1-1225培養(yǎng)上清液包括為用于歸一化數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0124]這是分離的菌落的表型分析，以確定培養(yǎng)后培養(yǎng)基中D-乳酸的存在或者不存在。當(dāng)篩選各個(gè)菌落D-乳酸的存在時(shí)，還顯而易見的是含有50%的D-乳酸產(chǎn)生者和50%的D-乳酸非產(chǎn)生者的‘混合’培養(yǎng)物將導(dǎo)致為D-乳酸存在‘陽性’的培養(yǎng)物。因此，認(rèn)為我們靶向的D-乳酸缺失表型為D-乳酸產(chǎn)生表型‘隱性的’。當(dāng)我們考慮圖2中所示的誘變的示意圖時(shí)這是重要的，因?yàn)閱蝹€(gè)氧化的G堿基會(huì)導(dǎo)致最終的菌落，其為親本和改變的個(gè)體二者的混合物，并因此在表型上為D-乳酸陽性的。在這種情況下，對(duì)于分離缺失D-乳酸產(chǎn)生的菌株，納入甲磺酸乙酯處理后在MRS肉湯中的生長(zhǎng)是重要的。篩選了大約21000個(gè)各個(gè)經(jīng)甲磺酸乙酯處理的菌落后，分離了 15個(gè)缺失D-乳酸產(chǎn)生的菌落，并進(jìn)行了進(jìn)一步分析。
[0125]實(shí)施例3.測(cè)定培養(yǎng)基中D-乳酸水平。在37°C，在MRS肉湯中培養(yǎng)培養(yǎng)物16個(gè)小時(shí)，并通過離心去除細(xì)菌。為了測(cè)定D-乳酸濃度，將無細(xì)胞培養(yǎng)上清液稀釋于水中，如上所述進(jìn)行分析，并與用D-乳酸鈉稀釋液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。通過用兔肌肉L-乳酸脫氫酶交換酶D-乳酸脫氫酶，并使用L-乳酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)，以相同的方式測(cè)定L-乳酸濃度。對(duì)CNCM 1-4437的這種分析的結(jié)果顯示于表1中，并且包括對(duì)照:約氏乳桿菌CNCM1-1225、具有GMO失活的D-乳酸脫氫酶基因的約氏乳桿菌NCC9006，以及均被認(rèn)為是L-乳酸產(chǎn)生菌株的副干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)NCC2461和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)NCC4007。
[0126]副干酪乳桿菌NCC2461 (檢索號(hào)=CNCM 1-2116)于1999年I月12日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于CNCM (地址已經(jīng)提及)。鼠李糖乳桿菌NCC4007 (檢索號(hào):CGMCC1.3724)于2004年10月根據(jù)布達(dá)佩斯條約保`藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center) (CGMCC), Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,北辰西路 I 號(hào),朝陽區(qū)，北京 100101,中國)。如在 Lapierre等人，題為“D-Lactate Dehydrogenase Gene (IdhD) Inactivation and ResultingMetabolic Effects in the Lactobacillus johnsonii Strains Laland N312:(Appl.Environ.Microbiol.1999,65 (9):4002)的文章中所述，約氏乳桿菌NCC9006是來源于約氏乳桿菌Lal的菌株。
[0127]表1.從無細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的CNCM 1-1225,CNCM 1-4437的D-和L-乳酸的值。將菌株NCC9006(具有D-乳酸脫氫酶基因的GMO失活的約氏乳桿菌菌株)、均被認(rèn)為是L-乳酸產(chǎn)生菌株的副干酪乳桿菌NCC2461和鼠李糖乳桿菌NCC4007包括為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行，并表示為平均值加上括號(hào)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)差。
【權(quán)利要求】
1.約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)菌株CNCM 1-1225的天然衍生物,其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物與約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225相比是缺失D-乳酸產(chǎn)生的，并且表現(xiàn)出增加的貯藏期限。
2.權(quán)利要求1的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的D-乳酸脫氫酶序列在氨基酸位置77處包含精氨酸至組氨酸的氨基酸改變。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中所述D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列在核酸位置270處包含G至A的轉(zhuǎn)換。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物是約氏乳桿菌CNCM 1-4437。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物作為在生物學(xué)上純的培養(yǎng)物存在。
6.無細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其分離自權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的在生物學(xué)上純的培養(yǎng)物。
7.包含權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或權(quán)利要求6中要求保護(hù)的無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物，用于制備在通過療法治療人類或動(dòng)物體的方法中使用的組合物。
8.包含權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的所述約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或權(quán)利要`求6中要求保護(hù)的所述無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物，用于治療或預(yù)防與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥。
9.如權(quán)利要求8中要求保護(hù)的組合物，其中所述與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥選自流感、鼻炎、普通感冒及其組合。
10.包含權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的所述約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或權(quán)利要求6中要求保護(hù)的所述無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物，用于治療或預(yù)防與由于腸毒性細(xì)菌或病毒的細(xì)胞附著和細(xì)胞侵入相關(guān)的病癥。
11.權(quán)利要求10中要求保護(hù)的組合物，其中所述與由于腸毒性細(xì)菌或病毒物種的細(xì)胞附著和細(xì)胞侵入相關(guān)的病癥選自下呼吸道感染、胃腸道感染、中耳炎及其組合，并且其中優(yōu)選地所述腸毒性物種選自沙門氏菌屬(Salmonella);彎曲桿菌屬(Campylobacter);利斯特氏菌屬(Listeria);大腸桿菌菌株，例如ETEC、EHEC, EPEC或EIEC菌株；耶爾森菌屬(Yersinia);志賀氏菌屬(Shigella);產(chǎn)毒素細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)或臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)；Vibrio vulnifucus/parahaemoIyticus (副溶血弧菌);輪狀病毒(rotavirus);類諾瓦克病毒(norovirus);產(chǎn)vero細(xì)胞毒素大腸桿菌(verotoxigenic E.coli)；阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii);產(chǎn)毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌(toxigenic C.perfringens) (A 型和B型)；食源性寄生蟲,如棘球?qū)?Echinococcus)、弓形體屬(Toxoplasma)或賈第鞭毛蟲屬(Giardia);幽門螺桿菌(Helicobacter pylori);艱難梭菌(Clostridium difficile);破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)及其組合。
12.權(quán)利要求7-11的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的組合物，其中所述組合物選自食物組合物、寵物食物組合物、飲料、乳制品、營(yíng)養(yǎng)制劑、食物添加劑、營(yíng)養(yǎng)治療品、藥物組合物、食物成分和/或美容組合物。
13.權(quán)利要求7-12的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的組合物，其中所述組合物選自酸化的乳制品，例如酸奶或酸奶飲料；或者基于乳的粉末。
14.權(quán)利要求7-13的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的組合物，其中所述組合物以每天劑量IO6-1O12Cfu的量包含權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的所述約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物。
15.權(quán)利要求7-14的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的組合物，其含有每天劑量約0.005mg -5000mg權(quán)利要求1- 5的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
【文檔編號(hào)】A61K38/44GK103562381SQ201280025795
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月29日
【發(fā)明者】R-D·普里德莫爾, F·法塔, M·戴雷, I·揚(yáng)科維奇 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司