含有經(jīng)修飾腺病毒載體的流感疫苗的制作方法

含有經(jīng)修飾腺病毒載體的流感疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了通用流感疫苗，該疫苗可提供長達(dá)數(shù)年的保護(hù)，提供抵抗循環(huán)流感株的經(jīng)改善保護(hù)，所述毒株無法精確預(yù)測以用于每年的疫苗生產(chǎn)，并提供保護(hù)抵御可能帶來全球性大流行的新出現(xiàn)流感病毒株。
【專利說明】含有經(jīng)修飾腺病毒載體的流感疫苗
[0001]本申請要求2011年5月23日提交的序列號61/488，904的權(quán)益，并通過引用將其納入。
[0002]該申請通過引用納入2012年5月21日創(chuàng)建并命名為“00048600038sequenceIisting, txt的” 8.67kb文本文件的內(nèi)容，其為用于本申請的序列表。
[0003]本發(fā)明引用的每個參考文獻(xiàn)通過引用全文納入本文。
[0004]發(fā)明背景
[0005]甲型流感病毒每年導(dǎo)致全球3~5百萬人患嚴(yán)重疾病并與250，000~500，000例死亡相關(guān)。兩個流感疫苗原型-用于肌內(nèi)注射的三價滅活疫苗(TIV)和用于鼻內(nèi)應(yīng)用的減毒病毒(如FLUM1ST?)可用于兒童和最高至49歲成年人的疫苗接種。只有TIV被批準(zhǔn)用于50歲和更年長的個體。雖然對易感人群例如兒童和老年人強(qiáng)烈推薦流感疫苗，但流感疫苗僅提供有限的保護(hù)，如疫苗試驗的統(tǒng)計分析所示。病毒表面蛋白是中和抗體的靶標(biāo)和疫苗誘導(dǎo)保護(hù)的主要關(guān)聯(lián)物，所述蛋白快速突變并在主要循環(huán)毒株間錯配，且疫苗組分還會降低疫苗功效。不同毒株間的基因重配(re-assortment)可導(dǎo)致新毒株的出現(xiàn)，而且如果它們持續(xù)在人之間傳播， 會進(jìn)而導(dǎo)致全球性大流行。這種大流行在極端情況下可導(dǎo)致上百萬人死亡。對流感病毒的遺傳修飾或重配病毒的選擇在技術(shù)上是可行的，能開發(fā)潛在的高毒力病毒以用作生物武器。一旦分離并鑒定一種新流感病毒，可在約6~8個月內(nèi)開發(fā)出基于所批準(zhǔn)原型的疫苗。由于新流感病毒株在少于3個月的時間內(nèi)就能從局部爆發(fā)傳播到各地，這種新高毒力流感病毒大流行情況中的延遲會使上百萬人喪失生命。
[0006]因此，仍然需要通用流感疫苗來提供基線保護(hù)抵御多種流感病毒，包括新出現(xiàn)毒株。
[0007]附圖簡要說明
[0008]圖1.圖中顯示初次接種兩周后抗M2e的抗體水平。C57BL/6小鼠(n=10，6_8周齡)用IOiciVP (病毒顆粒)的AdC68-3M2eNP (本圖中的名稱，在序列號61/488，904中稱為AdC68M2e (3) NP)初次免疫。與異源加強(qiáng)載體組合，用IOLD5tl的流感A/PR/8刺激后該方案提供80-90%存活率。平行注射相同劑量的具有和不具有轉(zhuǎn)基因的衣殼修飾載體，產(chǎn)生顯著提聞的抗體應(yīng)答。
[0009]圖2.六鄰體修飾的載體的構(gòu)建物。流程圖顯示六鄰體Rl或R4修飾、缺失El的AdC68載體的克隆。圖上方顯示缺失El的AdC68分子克隆的完整序列，其包含用于切除六鄰體編碼基因的Mlu I位點。圖下方從左到右顯示了含有病毒六鄰體的pcDNA3.1克隆，該六鄰體包含用于向Rl或R4插入M2e序列的位點；M2e的插入位點；以及六鄰體修飾的分子克隆。
[0010]圖3.在非還原的條件下從HEK293細(xì)胞中分離蛋白，該細(xì)胞被攜帶天然(AdC68-rab.gp)、Rl-[AdC68_HxM2eS (Rl)]或 R4-[AdC68_HxM2eS (R4)]修飾六鄰體的 AdC68載體感染，并用抗六鄰體的單克隆抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析。抗β肌動蛋白的單克隆抗體用作加樣對照。[0011]圖4A-C.M2e的表達(dá)。用IO2或103vp載體/細(xì)胞感染HeLa細(xì)胞。24小時后，用M2e抗體(灰點)或陰性對照抗體(黑點)對細(xì)胞染色，然后用PE標(biāo)記的二抗染色并用流式細(xì)胞術(shù)分析。直方圖顯示隨著事件數(shù)的M2e表達(dá)水平。圖4A，AdC68-HxM2eS(Rl);圖4B, AdC68-HxM2eS (R4)；圖 4C, AdC68-rab.gp。
[0012]圖4D.用不同量的表達(dá)3M2eNP融合蛋白(作為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的)的載體感染細(xì)胞，并用抗M2e的單克隆抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析融合蛋白的表達(dá)?？功录拥鞍椎目贵w用作加樣對照。
[0013]圖4Ε用純化的AdC68載體包被板，該載體攜帶天然六鄰體或在Rl或R4中含有M2e的六鄰體。封閉平板，用抗M2e的單克隆抗體處理，然后用堿性磷酸酶偶聯(lián)抗體和底物孵育。用ELISA酶標(biāo)儀測定顏色變化。圖顯示孔中底物的平均吸光度(土SD)，該孔中加入了不同稀釋度的抗M2e的單克隆抗體。 [0014]圖5.用在六鄰體Rl或R4中攜帶M2e的載體或具有天然六鄰體的載體(AdC68-rab.gp)免疫小鼠。測試血清中具有原初六鄰體的AdC68載體的中和情況，該六鄰體表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)。圖中通過六鄰體修飾載體誘導(dǎo)的抗體顯示了具有天然六鄰體的AdC68的中和效價倒數(shù)。
[0015]圖6A-B顯示針對M2e的體液應(yīng)答。圖6A，使用M2e肽ELISA以測定ICR小鼠(n=10)血清中M2e特異性抗體效價。初次免疫5周后(黑色柱)或加強(qiáng)免疫5周后(白色柱)收集血清。圖6B，使用細(xì)胞ELISA以測定接種疫苗的C57B1/6小鼠(n=5)中的抗體。初次免疫2周后收集血清。圖顯示就單克隆M2e特異性抗體歸一化的平均效價土SD。*P〈0.05。
[0016]圖7.初次免疫5周后或加強(qiáng)免疫5周后，通過四聚體染色評價血液中NP特異性⑶8+T細(xì)胞頻率。圖中顯示單獨小鼠的NP特異性⑶8+T細(xì)胞平均頻率土SD。*P〈0.05。
[0017]圖8A-D顯示測試抵抗A/PR8/34攻擊的保護(hù)實驗結(jié)果。C57B1/6小鼠(n=5，圖8A和圖B)或ICR小鼠(n=10,圖8C和圖8D)用不同載體免疫兩次。經(jīng)AdC68_3M2eNP初次免疫的小鼠用AdC6-3M2eNP加強(qiáng)免疫。用AdC68_rab.gp免疫的對照小鼠用AdC6_rab.gp加強(qiáng)免疫。其它組的小鼠用與初次免疫相同的載體加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫2個月后用IOLD5tl的A/PR8/34病毒攻擊小鼠。圖8A和圖8C，圖中顯示攻擊后的平均下降體重。圖8B和8D，圖中顯示攻擊后的存活率。
[0018]發(fā)明詳述
[0019]本發(fā)明描述了抵抗流感病毒的強(qiáng)效通用疫苗，其提供了以下優(yōu)點:用提供長達(dá)數(shù)年保護(hù)的疫苗取代每年的流感疫苗。另外，所述疫苗可提供抵抗循環(huán)流感毒株的經(jīng)改善保護(hù)，該毒株無法精確預(yù)測以用于每年的疫苗生產(chǎn)。所述通用流感疫苗還可提供保護(hù)抵御可能會帶來全球性大流行的新出現(xiàn)流感病毒株。
[0020]所述疫苗組合物基于衍生自黑猩猩的腺病毒(Ad)載體，例如AdC68 (也稱為Sad-V25)。人體中僅發(fā)現(xiàn)抗這些病毒的預(yù)存在中和抗體具有低效價。所述AdC載體在載體顆粒主要外殼蛋白即六鄰體(其在AdC病毒表面上以740個拷貝存在)的易接近環(huán)上表達(dá)線性和保守的B細(xì)胞表位，優(yōu)選基質(zhì)蛋白胞外域表位(M2e)。B細(xì)胞最優(yōu)選由在顆粒上重復(fù)表達(dá)并以有序方式表達(dá)的抗原所誘導(dǎo)。以該形式排列的抗原與B細(xì)胞受體交聯(lián)，從而啟動B細(xì)胞活化并能引發(fā)強(qiáng)效的抗體應(yīng)答?？扇苄钥乖苫罨疊細(xì)胞，但認(rèn)為這需要較高濃度的抗原并且所得抗體應(yīng)答在其特異性和結(jié)合強(qiáng)度方面可能質(zhì)量較低。[0021]M2e可衍生自任何甲型流感毒株，包括但不限于:H1N1 (如A/PuertoRico/8/1934;A/Fort Monmouth/1/1947)、 H5N1 (如 A/Hong Kong/483/1997)、 H7N2(如 A/Duck/Tasmania/277/2007)、H1N2 (如 A/Swine/Korea/CY02/02)、H2N2 (如 A/Leningrad/134/17/57)、和 H3N2 (如 A/New York/392/2004) ?
[0022]在一些實施方式中，M2e插入六鄰體蛋白。在一些實施方式中，M2e插入六鄰體蛋白的高變區(qū)1(R1)。在一些實施方式中，示于SEQ ID N0:6的六鄰體蛋白氨基酸142~144被刪除，并在該位置插入M2e。在一些實施方式中，M2e插入六鄰體蛋白的高變區(qū)4 (R4)。在一些實施方式中，M2e插入示于SEQ ID N0:6的六鄰體蛋白氨基酸253和254之間?？捎脴?biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法刪除六鄰體蛋白的編碼序列并在該刪除位置插入M2e的編碼序列。參見下述特定實施例。
[0023]因為AdC衣殼只在相對較短時間內(nèi)可接近直至病毒進(jìn)入細(xì)胞，此時六鄰體被降解，在一些實施方式中，Ad載體還編碼融合蛋白，包括額外的M2e表位，優(yōu)選衍生自多至三種不同的甲型流感病毒株，其由置于AdC載體中已刪除El結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表達(dá)盒以串聯(lián)形式表達(dá)。表達(dá)盒的M2e抗原表達(dá)可有助于延長B細(xì)胞應(yīng)答。抵抗甲型流感感染的保護(hù)水平可隨CD8+T細(xì)胞針對流感病毒保守蛋白(例如腺病毒核蛋白(NP))的伴隨活化而提高。因此，在一些實施方式中，AdC載體還編碼NP，其表達(dá)為與M2e表位相連的融合蛋白?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)重組核酸技術(shù)(例如下文實施例所述)來構(gòu)建編碼融合蛋白的核酸分子(核糖核酸或脫氧核糖核酸)。
[0024]在一些實施方式中，融合蛋白包括(I)來自第一甲型流感病毒株的第一基質(zhì)蛋白胞外域(M2ei);和(2)來自第二甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。在一些實施方式中，融合蛋白還包含來自第二甲型流感病毒株的第二基質(zhì)蛋白胞外域(M2e2)。在包含兩個基質(zhì)蛋白胞外域和一個核蛋白的實施方式中，三個組分中至少兩個來自不同的甲型流感病毒株。在其它實施方式中，所有三個組分來自不同的甲型流感病毒株。兩個(或三個)組分可任意排序。在一些實施方式中，融合蛋白的M2e組分衍生自與插入六鄰體蛋白的M2e相同的甲型流感病毒株。在一些實施方式中，融合蛋白的M2e組分衍生自與插入六鄰體蛋白的M2e不同的甲型流感病毒株。
[0025]在一些實施方式中，融合蛋白包含四個組分，所述組分衍生自至少兩個不同甲型流感病毒株:(I)來自第一甲型流感病毒株的第一基質(zhì)蛋白胞外域(M2ei) ；(2)來自第二甲型流感病毒株的第二基質(zhì)蛋白胞外域(M2e2) ；(3)來自第三甲型流感病毒株的第三基質(zhì)蛋白胞外域(M2e3);以及(4)來自第四甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。
[0026]可獲得融合蛋白組分的合適甲型流感病毒包括:H1N1 (如A/PuertoRico/8/1934;A/Fort Monmouth/1/1947)、 H5N1 (如 A/Hong Kong/483/1997)、 H7N2(如 A/Duck/Tasmania/277/2007)、H1N2 (如 A/Swine/Korea/CY02/02)、H2N2 (如 A/Leningrad/134/17/57)、和 H3N2 (如 A/New York/392/2004) ?
[0027]在一些實施方式中，第一毒株是HlNl毒株。在一些這類實施方式中，HlNl毒株是A/Fort Monmouth/1/1947。在其它實施方式中，HlNl 毒株是 A/Puerto Rico/8/1934。
[0028]在一些實施方式中，第一毒株是H5N1毒株。在一些這類實施方式中,H5N1毒株是A/Hong Kong/483/1997。
[0029]在一些實施方式中,第一毒株是H7N2毒株。在一些這類實施方式中,H7N2毒株是A/Duck/Tasmania/277/2007。
[0030]在一些實施方式中，第四毒株是HlNl毒株。在一些實施方式中，第一和第四毒株是HlNl毒株且可以相同或不同。在一些這類實施方式中，第一 HlNl毒株是A/FortMonmouth/1/1947。在其它實施方式中，第一 HlNl 毒株是 A/Puerto Rico/8/1934。
[0031]在一些實施方式中，四個組分從N至C末端排序為:M2ei—M2e2—M2e3—NP。在一些實施方式中，NP 和 Μ2θι 來自 A/Puerto Rico/8/1934 ；Μ2θι 來自 A/HongKong/483/1997 ；且M2e3來自A/Duck/Tasmania/277/2007。在其它實施方式中，來自三個毒株的M2e組分按HlNl-H5N1—H7N2 排序。
[0032]在任何實施方式中，插入衣殼中的M2e可衍生自與第一毒株(例如H1N1, H7N2, H5N1,或H7N2)、第二毒株或第三毒株相同的毒株，或可從第四毒株獲得。
[0033]在其它實施方式中，Ad載體編碼融合蛋白但不包括修飾的六鄰體蛋白。
[0034]已完善Ad載體的生成、純化和質(zhì)量控制方法(Tatsis和Ertl，MolTherlO:616-29, 2004)。Ad載體誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答，緩解了添加佐劑的需求。它們也誘導(dǎo)極強(qiáng)的B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，該應(yīng)答由于載體低水平的持久性可顯著維持(Tatsiset等，BloodllO: 1916-23 ，2007)。針對Ad病毒的普通人血清型(如血清型5)的預(yù)存在中和抗體會影響疫苗功效，這可通過使用來自其他物種例如黑猩猩的血清型(該血清型通常不在人類中傳播，也不與人血清型交叉反應(yīng))容易地避免(Xiang等，Emerg InfectDisl2:1596-99, 2006)。在需要初免-加強(qiáng)方案來實現(xiàn)足夠效力的免疫應(yīng)答的情況中，可使用基于不同Ad血清型的載體(Tatsis和Ertl, 2004)。Ad病毒和Ad載體已廣泛用于臨床，其中所述病毒和載體良好耐受。它們可經(jīng)多種途徑施予，包括粘膜途徑，如氣道(Xiang等，J Virol77:10780-89，2003)或甚至在包封后口服，如美國軍隊使用的針對Ad病毒4和7的疫苗所示(Lyons 等，Vaccine26:2890-98，2008)。
[0035]可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)配制免疫原性組合物，除上述腺病毒載體以外，所述組合物還可包括藥學(xué)上可接受的載劑例如磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)或其它緩沖液，以及其它組分例如抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑、佐劑等。在一些實施方式中，該組合物是疫苗組合物并可與一種或更多種其它疫苗聯(lián)合給予，所述其它疫苗包括其它流感疫苗(例如季節(jié)性疫苗)。在一些實施方式中，其它流感疫苗是基于肽的通用流感疫苗(例如美國專利7，354，589 和美國專利 7，527，798)。
[0036]可將所述免疫原性組合物和疫苗給予需要的個體，包括人、豬、狗、雪貂和其它哺乳動物，從而誘導(dǎo)針對衍生所述組分的毒株以外的甲型流感病毒株的免疫應(yīng)答。在一些實施方式中，根據(jù)“初免一加強(qiáng)”方案給予，其中至少第二劑量(“加強(qiáng)”)疫苗在第一劑量的一段時間后(例如第一劑量后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周或更久，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更久)提供?？捎孟嗤瑒┝炕虿煌瑒┝考訌?qiáng)免疫。在任何這些實施方式中，可給予相同的免疫原性組合物或不同的免疫原性組合物。例如，融合蛋白或修飾的六鄰體蛋白可用于初次和加強(qiáng)免疫。在其它實施方式中，融合蛋白用于初次免疫，修飾的六鄰體蛋白用于加強(qiáng)免疫。在其它實施方式中，修飾的六鄰體蛋白用于初次免疫，融合蛋白用于加強(qiáng)免疫。在一些實施方式中，用修飾的六鄰體蛋白和融合蛋白實施初次免疫，用修飾的六鄰體蛋白或融合蛋白或兩者實施加強(qiáng)免疫。
[0037]在一些實施方式中，給予包含經(jīng)修飾六鄰體蛋白和/或融合蛋白的Ad載體。所給予的一般病毒劑量范圍為IO7~IO11病毒顆粒(如107、5xl07、108、5xl08、109、5xl09、101Q、δχΙΟ'ΙΟ11)。在一些實施方式中，給予融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸分子。
[0038]給予方法包括但不限于:粘膜(例如鼻內(nèi))、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和口服給予。免疫應(yīng)答可用本領(lǐng)域已知的合適方法評估，包括下述具體實施例中教導(dǎo)的那些。
[0039]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對上述實施方式的許多變化和變換在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
[0040]實施例1
[0041]載體的構(gòu)建和體外篩選
[0042]1.1.載體的構(gòu)建和質(zhì)量控制
[0043]可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備在病毒六鄰體中攜帶M2e序列的AdC6和AdC68載體。用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法和序列鑒定完成Ad六鄰體的修飾，隨后在El中插入表達(dá)盒并用Southern印跡方法或測序確認(rèn)。通過該分子可用的晶體結(jié)構(gòu)引導(dǎo)將M2e表位置于AdC68六鄰體中。AdC6屬于相同血清型，但對于可變區(qū)，與AdC68具有較高程度的序列同源性，這能鑒定下文所示的Rl (序列號 61/488，904 中稱為“VR1”)，比較了 AdC6 和 AdC68 的 Rl (序列號 61/488，904 稱為“VR1”)六鄰體序列和其側(cè)翼區(qū)域。Rl (序列號61/488，904中稱為“Vrl”)用粗體表示，AdC68六鄰體中的插入位點用下劃線表示。
[0044]AdC68 (SEQ ID NO:1)
[0045]YNSLAPKGAPNTCQWTYKADGETATEKTYTYGNAPVQGINITKDGIQLG TD
[0046]AdC6 (SEQ ID NO:2)
[0047]YNSLAPKGAPNSSQWEQAKTGNGGTMETHTYGVAPMGGENITKDGLQI GTD
[0048]該分子病毒克隆可在HEK293細(xì)胞上拯救。一旦可觀察到病毒空斑(一般5~14天后)，收集細(xì)胞并通過凍融釋放病毒。然后病毒可在HEK293細(xì)胞中增殖數(shù)代。產(chǎn)生大規(guī)模母液后(40~50個T75燒瓶)，病毒可純化、滴定并進(jìn)行質(zhì)量控制。
[0049]1.1.2.純化
[0050]Ad載體可通過兩輪CsCl梯度的浮力密度超離心進(jìn)行純化，隨后進(jìn)行柱純化(Bio-Gel P-6DG)，之后用補(bǔ)充有10%甘油的PBS稀釋并在_80oC下保存。
[0051]1.1.3.滴定
[0052]病毒顆粒(vp)含量可通過分光光度計在260nm和280nm檢測，后者檢測制品的純度。病毒滴度(vp/ml)可用以下公式測定=OD26tlX稀釋度xl.1xlO120 FDA要求根據(jù)測定載體毒性的vp給予腺病毒載體。另一方面載體免疫原性取決于能感染細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的病毒顆粒數(shù)。通常，通過采用瓊脂糖涂覆的空斑試驗或終點稀釋試驗(測定細(xì)胞病變效應(yīng))測定感染性病毒顆粒數(shù)。兩種實驗都能在反式提供El的細(xì)胞系中實施?？瞻咝纬扇Q于病毒因子數(shù)而不能可靠地反映細(xì)胞系和缺失El的AdC載體間的相互關(guān)系。
[0053]可采用兩個替代性實驗來測定腺病毒批次的感染性。用標(biāo)準(zhǔn)空斑實驗檢測實驗有效性，兩個實驗都顯示出相同的敏感性。該實驗的一種形式中，通過以下方式測定感染性病毒顆粒含量:用轉(zhuǎn)基因或Ad (六鄰體)特異性引物對分離自HEK293細(xì)胞的RNA進(jìn)行嵌套式RT-PCR，該細(xì)胞用連續(xù)稀釋的載體感染5~7天。納入控制實驗的標(biāo)準(zhǔn)。該實驗針對所有AdC載體。
[0054]在第二個實驗中，用不同濃度的載體對HEK293細(xì)胞感染7天，然后用抗六鄰體保守區(qū)域的抗體染色，并用經(jīng)堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗復(fù)染。該實驗用于檢測具有未修飾六鄰體的Ad載體。不適于檢測具有Rl (序列號61/488，904中稱為“VR1”)修飾六鄰體的Ad載體。
[0055]在其它實施方式中，用抗M2e的單克隆抗體染色以檢測M2e修飾載體的六鄰體。用不同濃度的M2e六鄰體修飾載體感染HEK293細(xì)胞。根據(jù)上文所示完成實驗，但用抗M2e的單克隆抗體取代抗六鄰體的抗體。
[0056]1.1.4.常規(guī)質(zhì)量控制(QC)
[0057]載體可在就動物試驗進(jìn)行釋放前接受一系列質(zhì)量控制?？稍贏549細(xì)胞上檢測載體批次的復(fù)制型Ad (RCA)0由于HEK293細(xì)胞和載體間的重疊病毒序列發(fā)生重組，復(fù)制型腺病毒(RCA)會在HEK293細(xì)胞中El缺失復(fù)制缺陷型Ad載體的創(chuàng)建及增殖期間出現(xiàn)。根據(jù)載體制備中的RCA水平，其會顯著影響體內(nèi)實驗的載體性能、宿主免疫應(yīng)答和毒性概況。因此，對于Ad載體的基因轉(zhuǎn)移和基于病毒的疫苗應(yīng)用而言，鑒定載體制備是否存在高水平RCA污染尤其重要。
[0058]簡而言之，用2xl09、2xl01Q和2χ10ηνρ的載體處理6孔板中的細(xì)胞。對照孔用10或50空斑形成單位(pfu)的相應(yīng)野生型Ad病毒感染。第三組孔中，加入具有感染病毒(1，10，和IOOpfu)的復(fù)制缺陷型載體(2X10nvp)以確保形成不受到所用載體空斑劑量的抑制。細(xì)胞可用瓊脂糖覆蓋。4天和8天后讀板。RCA通常污染在ΗΕΚ293細(xì)胞中生長的缺失El的人血清型5Ad(AdHu5)載體， 但由于El側(cè)翼區(qū)域的序列差異，用AdHu5的El反式補(bǔ)充的El缺失AdC載體沒有檢測到。
[0059]可測試批次以檢測和定量測定測試物中的革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素水平。例如，可使用鱟變形細(xì)胞裂解物(LAL)凝膠法和市售試劑盒進(jìn)行。可設(shè)置用于大型動物實驗的載體批次釋放標(biāo)準(zhǔn)，例如〈5內(nèi)毒素單元(EU)/kg動物體重,其為FDA的人設(shè)置參數(shù)。
[0060]也可評價載體無菌性。該實驗?zāi)康氖峭ㄟ^接種/擴(kuò)增和平板接種方法測試Ad載體制品的無菌性。簡而言之，先接種對照和測試制品，并在LB培養(yǎng)基中過夜攪拌培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)物接種于LV瓊脂平板上孵育48小時以檢測細(xì)菌克隆的形成和真菌生長。對照可以是連續(xù)稀釋并在相同條件下培養(yǎng)的菌株DH5ci。
[0061]大規(guī)模載體批次的遺傳完整性和和特性可通過病毒DNA分離評估。用一組限制性酶(與分子克隆平行)消化重組DNA并用凝膠電泳分析。因為所述載體通過構(gòu)建分子克隆并在HEK293細(xì)胞中拯救/擴(kuò)增而產(chǎn)生，用于產(chǎn)生分子克隆的原始分子克隆和穿梭質(zhì)粒可在有提取自載體制劑的病毒DNA的并行限制性消化中使用從而通過溴化乙啶染色瓊脂糖凝膠電泳來比較標(biāo)簽帶型。另外，分析可包括不含轉(zhuǎn)基因盒的載體骨架的分子克隆。通常選擇至少兩組限制性酶用于分析。一組聚焦于檢測轉(zhuǎn)基因盒的存在和完整性；另一組重點在載體骨架。載體遺傳穩(wěn)定性可在HEK293細(xì)胞中連續(xù)傳代12~15代后通過Southern印跡測試。
[0062]可在用1，000和10，OOOvp/細(xì)胞的新載體感染CHO細(xì)胞后通過蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀測試轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達(dá)，所述CHO細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染從而表達(dá)柯薩奇腺病毒受體(CH0-CAR)。用相同劑量的表達(dá)不相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的Ad載體感染對照細(xì)胞。用抗M2e的單克隆抗體通過純化病毒的蛋白質(zhì)印跡測定修飾的六鄰體表達(dá)?？山⒃缙趥鞔鞑《編?40瓶各0.5ml+10瓶0.1ml)，并從該庫獲得載體。該主病毒庫耗盡后，可從分子克隆中重新獲得感染性Ad載體來建立新的主病毒庫。遺傳穩(wěn)定性可通過連續(xù)擴(kuò)增(15)載體然后Southern印跡測試以確保載體未經(jīng)重組。
[0063]1.1.5.釋放標(biāo)準(zhǔn)
[0064]大規(guī)模載體制備的產(chǎn)率通常 > 每批次IO13Vp (約IO8個HEK細(xì)胞)。AdC載體的Vp與感染單位之比通常高于人血清型Ad載體，通常范圍為1:20~1:200，但最高>1:400。
[0065]實施例2
[0066]載體在幼鼠中的免疫原性和效力
[0067]在年幼(6~8周齡)的C57B1/6小鼠組(組規(guī)模:每組8只小鼠)中評價免疫原性。不具有六鄰體修飾的原型AdC68-3M2eNP和AdC6_3M2eNP載體(序列號61/488，904中分別稱為“AdC68M2e (3) NP和AdC6M2e (3) NP載體”)已被廣泛測試并用于比較。 [0068]2.1.原初小鼠中的免疫原性
[0069]在劑量遞增實驗中測試4種載體，即有和沒有六鄰體修飾的AdC68_3M2eNP和AdC6-3M2eNP (序列號 61/488，904 中分別稱為 “AdC68M2e (3) NP 和 AdC6M2e(3)NP 載體)，其中對8只幼鼠經(jīng)肌內(nèi)注射IO8UO9或IOltVp的載體。表達(dá)不相關(guān)抗原(即狂犬病病毒糖蛋白)的載體用作陰性對照。小鼠在免疫后2、4、8周取血。
[0070]分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)并采用對NP免疫優(yōu)勢表位特異的I類MHC四聚體染色來測試NP-特異性CD8+T細(xì)胞的頻率。免疫接種三個月后對小鼠實施安樂死。通過以下方法就NP特異性T細(xì)胞頻率測試從血液、脾臟和肺中分離的淋巴細(xì)胞群:在布雷菲德菌素存在下用攜帶免疫優(yōu)勢I類MHC結(jié)合表位的NP肽刺激細(xì)胞，然后進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。具體地，測試細(xì)胞中IFN-Y、IL-2、TNF-a、MIP-1a和穿孔蛋白的產(chǎn)生。胞內(nèi)染色前，對細(xì)胞表面染色0)3、0)8、0)4、0)44和0)62匕染色細(xì)胞用BD穩(wěn)定固定劑(BD StabilizingFixative) (BD生物科技公司(BD Biosciences),加利福尼亞州圣何塞)固定，并通過FACS用LSRII臺式流式細(xì)胞儀(BD生物科技公司，加利福尼亞州圣何塞)和FACSDIVA?軟件分析。在至少100，000事件中進(jìn)行樣品的流式細(xì)胞術(shù)采集和分析。用FlowJo (樹星公司(TreeStar),俄勒R州艾士蘭)做采集后分析。有BD?CompBeads抗小鼠Ig κ (BD生物科技公司，加利福尼亞州圣何塞)的單色控制用做補(bǔ)償。
[0071]通過在包被有M2e肽的平板和包被有經(jīng)全長M2轉(zhuǎn)染細(xì)胞或假轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平板上進(jìn)行ELISA來測試血漿中抗M2e的抗體。為進(jìn)一步定量分析B細(xì)胞應(yīng)答，測試分離自脾臟和骨髓的細(xì)胞中的抗體分泌細(xì)胞(ASC)。96孔板(丨MMOB丨1^^1膜；MAIPN4510;密理博(Millipore),馬塞諸塞州比爾瑞卡)用溶于磷酸鹽緩沖鹽水的10 μ g/ml濃度M2e肽在4°C包被過夜，以檢測M2e特異性ASC，或用溶于PBS的4 μ g/ml濃度的親和純化羊抗人免疫球蛋白A (IgA)加gG和IgM (H+L;KP公司(Kirkegaard&Perry),馬里蘭州蓋瑟斯堡)包被以測定ASC的總頻率。用PBS包被的平板作為陰性對照。平板在4°C下孵育過夜，并用補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基37°C封閉2小時。在補(bǔ)充有10%FBS和0.5 μ g/ml磷酸鹽偶聯(lián)羊抗人IgG (H+L)抗體的RPMI培養(yǎng)基中重懸PBMC。以2xl05細(xì)胞/孔向平板加入細(xì)胞。在37°C下孵育過夜。次日清洗平板并用堿性磷酸酶底物處理。通過自動ELISpot讀板儀計數(shù)斑點來測定每孔的ASC數(shù)。數(shù)據(jù)按每IO6個細(xì)胞的斑點記錄。M2e特異性ASC記錄為分泌抗任一甲型流感病毒株的抗體的細(xì)胞相對分泌Ig的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
[0072]根據(jù)Crotty等(17)所述進(jìn)行ELISpot實驗來測試記憶B細(xì)胞。將PBMC以5X IO5細(xì)胞/孔接種在補(bǔ)充有伴刀豆球蛋白提取物、6 μ g/ml CpG寡核苷酸0DN-2006 (英維杰公司(Invivogen),加利福尼亞州圣地亞哥)和1/10，000稀釋的固定金黃色葡萄球菌Cowan(西格瑪公司(Sigma))的培養(yǎng)基內(nèi)。對照孔不加入促分裂原。細(xì)胞培養(yǎng)5天，然后根據(jù)上文所述用ELISpot實驗測試分泌IgG的B細(xì)胞和M2e特異性、分泌IgG的B細(xì)胞。從促分裂原刺激的孔的斑點中減去含對照細(xì)胞的孔的斑點。根據(jù)上文所述記錄其它數(shù)據(jù)并做質(zhì)量控制。在實施安樂死時收集血漿，再用肽ELISA測試抗M2e的抗體。測定抗體的同種型。通過BIACOREli親和測試分析抗體質(zhì)量。測試血漿中針對野生型Ad載體和六鄰體修飾Ad載體的中和抗體。
[0073]2.2初免加強(qiáng)方案的免疫原性
[0074]為選擇兩組載體(即具有或不具有六鄰體修飾)中更強(qiáng)的免疫原性，通過以下方式進(jìn)行初免加強(qiáng)方案:用AdC68初次免疫然后AdC6加強(qiáng)免疫以及AdC6初次免疫然后AdC68加強(qiáng)免疫的相反方案。表達(dá)狂犬病糖蛋白的AdC載體作用陰性對照。用IO8~IOltVp的載體經(jīng)肌內(nèi)對小鼠初次免疫；兩個月后用異源載體對它們進(jìn)行加強(qiáng)免疫。根據(jù)2.1所述評價免疫應(yīng)答。
[0075]2.3經(jīng)歷過流感病毒的小鼠的免疫原性
[0076]在多數(shù)成人中，流感疫苗接種引發(fā)大量針對更保守抗原的B細(xì)胞和T細(xì)胞回憶應(yīng)答，其由之前的感染或疫苗接種所誘導(dǎo)。由于次級應(yīng)答相比初始應(yīng)答遵循不同規(guī)則且一般能由較低劑量抗原引發(fā)，根據(jù)上述方法(只使用其中一個方案，即先用AdC68再用AdC6或其相反方案)在小鼠中進(jìn)行初免加強(qiáng)，該小鼠在6周齡時接受105TCID50的流感病毒A/X31(—種小鼠減毒H3N2株，只引起上呼吸道感染因此不會導(dǎo)致疾病)免疫接種。兩個月后用AdC疫苗對它們進(jìn)行初次免疫，隨后用異源AdC載體進(jìn)行加強(qiáng)免疫。根據(jù)2.2的結(jié)果選擇載體劑量以及初次和加強(qiáng)免疫的間隔。根據(jù)2.1所述監(jiān)控免疫應(yīng)答。
[0077]2.4幼鼠中的疫苗效力
[0078]單一劑量疫苗的保護(hù)。在以下兩個鼠品系中進(jìn)行這些測試:C57Bl/6小鼠，能測試T和B細(xì)胞應(yīng)答；和ICR小鼠，經(jīng)雜交后不能測試CD8+T細(xì)胞應(yīng)答但提供更實際的人用模型。小鼠經(jīng)肌內(nèi)免疫接種。在原初小鼠和用A/X31預(yù)感染的小鼠中測試單次免疫方案，并測定保護(hù)持續(xù)時間。攻擊使用異源HlNl病毒-甲型流感病毒Mammoth Fort Worth，(A/FM)，其已在小鼠中滴定測定了平均致死劑量。攻擊病毒的量可變。在初始實驗中以IOLD5tl使用病毒。若得到針對該劑量的保護(hù)，可將攻擊劑量提高至1000LD5tl以測定保護(hù)的穩(wěn)健性。通過測量體重下降和倫理性(一旦減少其原始體重的30%就對幼仔實施安樂死)以及氧飽和度在攻擊后3、5和7天評價保護(hù)。攻擊后4天和7天測定肺病毒滴度。同時評價肺葉組織學(xué)情況以測定病理程度。
[0079]初免一加強(qiáng)的保護(hù)。用不同濃度的所選AdC載體以2個月間隔對小鼠經(jīng)肌內(nèi)免疫接種。后續(xù)實驗中該間隔變?yōu)?~6個月。一組在接種疫苗2個月后用IOLD5tl流感病毒A/FM攻擊；另一組在接種疫苗8個月后攻擊。接種疫苗后，測定抗M2e的抗體效價和NP特異性⑶8+T細(xì)胞的頻率。檢測重量下降和倫理性。若保護(hù)到達(dá)兩個時間點(即至少80%接種過疫苗的小鼠存活，同時至`少80%對照小鼠死亡)，以接種疫苗8個月后進(jìn)行攻擊的方式重復(fù)測試。
[0080]攻擊后第4和7天對小鼠實施安樂死，并通過以下方式測定肺病毒滴度:在MDCK細(xì)胞中滴定肺勻漿上清液，然后根據(jù)Rowe等，J Clin Microbiol.37:937-43，1999所述進(jìn)行血凝實驗。一個肺切片用于組化分析。用PBS灌注肺并用200μ L的10%福爾馬林溶液通過30g針頭使其溫和膨脹。將一個膨脹的肺葉在10%福爾馬林中4°C浸沒24小時以用于固定組織。經(jīng)福爾馬林固定的肺樣品用石蠟包埋并以4 μ m切片以安裝在顯微鏡載玻片上。用H&E對切片染色，檢測每個肺的兩個切片。由對樣品來源不知情的研究人員檢測組織病理學(xué)變化。按照下述方法對肺病理學(xué)情況打分:1 -無病變；2 -血管周圍浸潤；3 -影響< 20%肺葉的血管周圍和間質(zhì)浸潤；4 -影響< 20-50%肺葉的血管周圍和間質(zhì)浸潤；5 -影響> 50%肺葉的血管周圍和間質(zhì)浸潤。在年幼ICR小鼠中測試誘導(dǎo)C57B1/6小鼠內(nèi)保護(hù)的方案(與陽性和陰性對照載體一起)以確保能在雜交小鼠中實現(xiàn)保護(hù)。
[0081 ] A/X31預(yù)接觸小鼠的保護(hù)
[0082]由于先前的感染/疫苗接種，多數(shù)人有用流感病毒的免疫經(jīng)歷。為評價預(yù)接觸A/X31對疫苗功效的影響，用1000TCID50的該病毒鼻內(nèi)感染ICR小鼠；然后用包括對照載體的單次劑量方案對其免疫接種，并用高劑量A/FM病毒攻擊小鼠。通過測量體重下降、存活率和氧飽和度評價保護(hù)。
[0083]年老 小鼠中的免疫原性和功效。流感在年長者中的致死性不均一，這緣于其免疫系統(tǒng)的總體損傷不能產(chǎn)生足夠的應(yīng)答。不幸的是，可用的流感疫苗也在年長者中顯示功效有限。在19~21月齡的年老C57B1/6小鼠中測試疫苗方案。為模擬人體中活流感病毒的預(yù)接觸，用低劑量(1000TCID50)的A/X31(H3N2)病毒感染8~9月齡的C57B1/6小鼠。在一些實施方式中，在19月齡時對小鼠初次免疫，在21月齡時加強(qiáng)免疫，在23或25月齡時攻擊小鼠。如上所述對每組10只小鼠進(jìn)行免疫原性研究，刺激實驗用每組20只小鼠。用低劑量A/FM攻擊病毒(3LD5CI)進(jìn)行初始測試。在一些實施方式中逐漸遞增攻擊病毒劑量(10，100，1000LD50)。
[0084]實施例3
[0085]大型動物中的疫苗效力
[0086]雪貂對人流感毒株高度易感，并被視為合適的流感病毒感染預(yù)臨床模型。其它模型是非人的靈長類攻擊模型。使用當(dāng)代HlNl病毒的雪貂實驗以生物安全水平2使用；用于攻擊非人類靈長類的病毒是高度致病性H5N1病毒，以生物安全水平3+進(jìn)行，所述生物安全水平經(jīng)⑶C和USDA批準(zhǔn)。
[0087]3.1.雪貂模型
[0088]根據(jù)上述方式對年幼雪貂(n=6)接種疫苗。對另外6只對照動物接種表達(dá)狂犬病毒糖蛋白的AdC載體。以IOicVp1.m給予疫苗。初免一加強(qiáng)方案的情況中，對動物進(jìn)行初次和加強(qiáng)免疫。根據(jù)小鼠實驗的結(jié)果確定初次和加強(qiáng)免疫之間的時間。以2周的間隔監(jiān)控血清中抗M2e的抗體。作為陽性對照，在初次免疫其它動物同時，對額外6只雪貂接種1/10人劑量的季節(jié)性流感疫苗(TIV)。給予最終AdC疫苗劑量2個月后，用2009H1N1病毒攻擊雪貂，這會在該種類中引起疾病但不致死。攻擊后，監(jiān)控雪貂疾病情況(發(fā)熱，體重下降)。在攻擊后第5和7天從支氣管灌洗液中測定病毒滴度，用血清測定對M2e和攻擊病毒的抗體應(yīng)答。
[0089]3.2非人類靈長類模型
[0090]先對印度來源的獼猴(每組6只)測試抗疫苗載體的中和抗體。只有缺乏該抗體的動物可納入實驗。用IO1Vp的AdC疫苗(表達(dá)流感病毒抗原或狂犬病毒糖蛋白)對動物接種。如果小鼠實驗顯示用異源載體可提高疫苗效力，則對它們進(jìn)行加強(qiáng)免疫。根據(jù)小鼠實驗的結(jié)果確定初次和加強(qiáng)免疫之間的時間。將另外6只動物納入實驗并在實驗動物初次免疫同時接種人劑量的當(dāng)代流感疫苗(TIV)。用A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)株攻擊所有動物，以濃度為1x10650%的蛋感染劑量氣管內(nèi)給予鎮(zhèn)靜動物。一天兩次監(jiān)控體重、溫度和食物攝入，在第2、4、6和8天從氣管灌洗液中測定病毒滴度。在動物發(fā)展出必需實施安樂死的癥狀時，從HE染色肺切片中評價組織病理學(xué)情況。
[0091]接種疫苗并在攻擊后第5天和第10天如下評價免疫應(yīng)答。在各疫苗劑量后第O、
7、21、42和84天采集血液。就抗M2e的抗體測試血清。通過微中和實驗監(jiān)控來自陽性對照動物的血清中抗相應(yīng)毒株的抗體。通過ELISpot測試第O天和第7天收集的PBMC中的M2e特異性抗體分泌細(xì)胞。根據(jù)下文用ICS測試在其它時間點(接種疫苗前)所采集PBMC中針對NP的T細(xì)胞應(yīng)答。用NP肽庫刺激PBMC(以每毫升各2 μ g肽的濃度使用重疊10個氨基酸的15聚體肽)。對細(xì)胞初始冷凍，從而可平行進(jìn)行各單獨動物的實驗。解凍冷凍細(xì)胞并立即用補(bǔ)充有2單位/ml DNase I的HBSS清洗，重懸于RPMI培養(yǎng)基并用抗⑶28 (克?、?8.2)、抗⑶49d(克隆9F10)和Brefeldin A.14刺激6小時。用紫色熒光活性染料太平洋藍(lán)(英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)、抗⑶14太平洋藍(lán)(克隆M5E2)，、抗⑶16太平洋藍(lán)(克隆 3G8)，、抗 CD8-APC-H7 (克隆 SKl)、抗 CD4_Alexa700 (克隆 0KT4)、抗 CD95_PE_Cy5 (克隆DX2)、和抗CD28-德克薩斯紅(克隆CD28.2，貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter)，加州富勒敦)在4°C下染色細(xì) 胞30分鐘。另外，用抗CCR7-PE (克隆150503)對細(xì)胞染色(冷凍細(xì)胞)。
[0092]用CYTOFIX/CYTOPERM(BD生物科技公司，加州圣何塞)在4 °C固定并透化30分鐘后，細(xì)胞用抗正^^-六卩(:(克隆827)、抗11^2411'(:(克隆1?1-17!112)、抗 TNF-a-PE_Cy7(克隆 MAbll,安迪生物(R&D System))和抗 CD3_PerCp-Cy5.5 (克隆SP34-2)在4°C染色30分鐘。對細(xì)胞清洗兩次，用BD穩(wěn)定固定劑(BD生物科技公司，加州圣何塞)固定然后用LSR II臺式流式細(xì)胞儀(BD生物科技公司，加州圣何塞)和FACSDIVA?軟件通過FACS分析。在至少400，000事件中進(jìn)行樣品的流式細(xì)胞術(shù)采集和分析。用FlowJo (樹星公司(TreeStar),俄勒岡州艾士蘭)做采集后分析。病毒感染后第10天測試攻擊后的血清中抗攻擊病毒的中和抗體。
[0093]實施例4
[0094]實施例5~9的材料和方法
[0095]1.構(gòu)建六鄰體修飾的AdC6載體
[0096]如下生成表達(dá)六鄰體中M2e肽的AdC68載體:從AdC68的El缺失病毒分子克隆中釋放編碼大部分六鄰體序列并側(cè)接有MluI的片段，克隆到pcDNA3.1載體(英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)中。刪除六鄰體殘基142~144(ETA)后，將編碼LTEVETPIRNEWG(SEQID NO: 3)的A/PR8/34病毒的M2e序列部分克隆到六鄰體的Rl中。為了產(chǎn)生R4修飾載體，在六鄰體殘基253和254之間插入相同的M2e序列。
[0097]通過測序鑒定編碼堿基對的M2e的正確插入后，從pcDNA3.1載體切除六鄰體序列并克隆回病毒分子克隆。對于相同載體，將含有上述3M2eNP序列(42)的表達(dá)盒在CMV早期啟動子的控制下置入El中。使用重組病毒分子克隆在HEK293細(xì)胞中拯救病毒。病毒在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，通過氯化銫密度梯度離心純化并用分光光度法在260nm測定病毒顆粒(vp)含量。用基于PCR的方法滴定載體從而測定感染單位(IU)。
[0098]表1列出了本說明書全文所用的新載體和名稱以及相關(guān)生長特性例如每108HEK293細(xì)胞的產(chǎn)率及vp與IU之比。其它Ad載體例如C68_rab.gp載體，表達(dá)GFP的Ad載體或表達(dá)3M2eNP融合蛋白的AdC載體已在上文中描述(37，38)
[0099]或用上文所述克隆技術(shù)產(chǎn)生(43 )。
[0100]表1
[0101]
【權(quán)利要求】
1.一種經(jīng)修飾的腺病毒六鄰體蛋白，所述蛋白包含來自第一甲型流感病毒株的第一基質(zhì)蛋白胞外域(M2ei)，所述M2ei插入所述六鄰體蛋白的高變區(qū)中。
2.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白，其特征在于，所述M2ei插入高變區(qū)I中。
3.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白，其特征在于，所述M2ei取代高變區(qū)I中的三個連續(xù)氨基酸。
4.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白，其特征在于，所述M2ei取代SEQIDNO:6所示六鄰體蛋白中的氨基酸142~144。
5.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白，其特征在于，所述M2ei插入高變區(qū)4中。
6.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白，其特征在于，所述M2e插入SEQIDNO:6所示六鄰體蛋白的氨基酸253和254之間。
7.如權(quán)利要求1~6中任一項所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白，其特征在于，所述第一流感病毒株選自HlNl株、H5N1株、H7N2株、H1N2株、H2N2株和H3N2株。
8.一種融合蛋白，所述蛋白包含: 來自第二甲型流感病毒株的第二基質(zhì)蛋白胞外域(M2e2);和 來自第三甲型流感病毒株的第三基質(zhì)蛋白胞外域(M2e3);和 來自第四甲型流感病毒株的第四基質(zhì)蛋白胞外域(M2e4)； 其中所述第二、第三和第四毒株中至`少兩個是不同的毒株。
9.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白還包含來自第五甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。
10.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述述融合蛋白的組分從N至C末端排序為:M2e2—Μ2θ3—Μ2θ4—NP。
11.如權(quán)利要求8~10中任一項所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二流感病毒株選自 HlNl 株、Η5Ν1 株、Η7Ν2 株、Η1Ν2 株、Η2Ν2 株和 Η3Ν2 株。
12.—種編碼權(quán)利要求1~7中任一項所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白或權(quán)利要求8~11中任一項所述融合蛋白的核酸分子。
13.—種包含如權(quán)利要求1~7中任一項所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白的腺病毒。
14.一種包含如權(quán)利要求12所述核酸分子的腺病毒。
15.如權(quán)利要求14所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒還包含如權(quán)利要求1~7中任一項所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白。
16.一種免疫原性組合物,所述組合物包含: 免疫原性組分；和 藥學(xué)上可接受的載劑， 其中所述免疫原性組分選自權(quán)利要求1~7中任一項所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白；權(quán)利要求8~11中任一項所述的融合蛋白；權(quán)利要求12所述的核酸分子；和權(quán)利要求13~15中任一項所述的腺病毒。
17.一種誘導(dǎo)針對甲型流感病毒的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向需要所述組合物的個體首次給予權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法還包括再次給予所述組合物。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述首次給予或再次給予選自下組:粘膜、口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給予。
20.如權(quán)利要求17~19中任一項所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括抗體形成。
21.如權(quán)利要求17~19中任一項所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括⑶8+T細(xì)胞活化。
22.權(quán)利要求16所述免疫原性組合物在針對甲型流感病毒的免疫接種中的應(yīng)用。
23.權(quán)利要求16所述免疫原性組合物在治療或預(yù)防疾病中的應(yīng)用。
24.權(quán)利要求1~7中任一項所述的經(jīng)修飾腺病毒六鄰體蛋白；權(quán)利要求8~11中任一項所述的融合蛋白；權(quán)利要求12所述的核酸分子；或權(quán)利要求13~15中任一項所述的腺病毒在制造用于誘導(dǎo) 針對甲型流感病毒的免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/16GK103732249SQ201280024949
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月23日
【發(fā)明者】H·C·埃特爾, 周東明 申請人:威斯特解剖及生物研究所