藥物組合物及其局部用途

藥物組合物及其局部用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及含有來源于脂肪組織的分泌物的組合物的制備方法，例如來源于牛脂肪組織的那些分泌物，以及該組合物在制備用于局部使用的藥物組合物中的用途。本發(fā)明還涉及脂肪組織來源的分泌物及其藥物組合物在用于通過局部敷用來局部治療非炎癥病況，例如治療皮膚病況，和刺激個體中毛發(fā)的生長中的用途。本發(fā)明還涉及脂肪組織來源的分泌物及其藥物組合物在痤瘡的局部治療中的用途。
【專利說明】藥物組合物及其局部用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及含有來源于脂肪組織的分泌物的組合物的制備方法，例如來源于牛脂肪組織的那些分泌物，以及該組合物在制備用于局部使用的藥物組合物中的用途。本發(fā)明還涉及脂肪組織來源的分泌物及其藥物組合物在用于通過局部敷用來局部治療非炎癥病況，例如治療皮膚病況，和刺激個體中毛發(fā)的生長中的用途。本發(fā)明還涉及脂肪組織來源的分泌物及其藥物組合物在痤瘡的局部治療中的用途。
[0002]發(fā)明背景
[0003]脂肪組織含有大體積的，充滿脂質(zhì)的脂肪細(xì)胞的細(xì)胞群和非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞群，其包括與各種結(jié)締組織纖維相關(guān)的細(xì)胞以及與毛細(xì)血管和大血管相關(guān)的細(xì)胞。非脂肪細(xì)胞群還包括各種浸潤的免疫細(xì)胞以及與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的細(xì)胞和細(xì)胞過程(cell processes) 0非脂肪細(xì)胞群也被認(rèn)為含有脂肪細(xì)胞來源的成體干細(xì)胞的細(xì)胞群，并因此使用脂肪組織作為分離成體干細(xì)胞的來源在多種治療應(yīng)用中備受關(guān)注。
[0004]在通常情況下，用于獲得推測的脂肪組織來源的成體干細(xì)胞方法涉及從脂肪來源的非脂肪細(xì)胞中清除脂肪細(xì)胞，這需要用如膠原酶的酶消化脂肪組織，然后通過離心被消化的樣品分離游離的細(xì)胞。在離心過程中，脂肪來源的非脂肪細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分離，形成沉淀，而含有脂質(zhì)的脂肪細(xì)胞上浮。然后含非脂肪細(xì)胞的餾分作為組織干細(xì)胞的來源被使用。
[0005]本發(fā)明人之前已經(jīng)描述了包含脂肪細(xì)胞的脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液在制備用于治療個體的炎癥或減輕與炎癥 疾病相關(guān)的疼痛，以及用于治療和緩解如軟骨或骨病癥的病況的疼痛的藥物中的用途。這在澳大利亞專利申請第2009201915號，并在國際公開第W02010/020005號已有描述，其內(nèi)容在此作為交叉引用并入本文。仍然存在對于治療非炎癥病況的改進(jìn)方法和其中使用的組合物的需求。
[0006]痤瘡是常見的皮膚病，包括尋常痤瘡、囊腫性痤瘡。常見的受痤瘡影響的皮膚部位包括面部，胸部的上半部分，以及背部。痤瘡最常發(fā)生于青春期，通常持續(xù)到成年期。多種治療可用于痤瘡，但是具有造成痤瘡疤痕的可以性以及對多數(shù)為青少年的患者具有潛在心理影響，因此替代的或改進(jìn)的治療方法是值得期待的。
[0007]發(fā)明簡述
[0008]本發(fā)明人已令人驚奇地鑒定了來自脂肪組織來源的細(xì)胞的分泌物，包括來自脂肪細(xì)胞的分泌物，對于改善各種非炎癥性病況，用于刺激毛發(fā)、軟毛和毛皮的生長，以及用于治療或預(yù)防痤瘡是有效的。用于制備分泌物的脂肪組織來源的細(xì)胞可以或不會包括脂肪細(xì)胞。
[0009]在本發(fā)明的第一方面，提供了含有脂肪組織來源的分泌物的組合物在制備用于局部治療個體中非炎癥性病癥的藥物中的用途。
[0010]在第二個方面，提供了一種治療個體中非炎癥性病癥的方法，該方法包括向個體局部給予藥物組合物，該組合物包括脂肪組織來源的分泌物，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
[0011]在一個實(shí)施例中，非炎癥性病癥涉及所述個體中一種或多種以下病況:(i)皮膚干燥，(ii)皮膚瘙癢，(iii)昆蟲盯咬，(iv)曬傷，(v)皮膚皺紋，(vi)皮膚過薄，(vii)皮膚開裂，(viii)昆蟲蜇傷，(ix)癥痕，(X)萎縮紋，(xi)曬斑，(xii)老年斑，(xiii)黃褐斑，(XiV)眼睛周圍的浮腫和/或黑眼圈，(XV)足癬，(xvi)疣，并且所述治療緩解一種或多種所述病況。
[0012]在第三方面，提供了脂肪組織來源的分泌物在制備用于局部使用以刺激個體中毛發(fā)，毛皮或軟毛生長的藥物中的用途。
[0013]在第四方面，提供了刺激個體中毛發(fā)，軟毛或毛皮生長的方法，該方法包括向個體局部給予藥物組合物，該組合物包括脂肪組織來源的分泌物，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
[0014]在實(shí)施方案中，個體具有一種或多種:(i)手術(shù)引起的脫發(fā)，(ii)與化療相關(guān)的脫發(fā)，(iii)輻射暴露相關(guān)的脫發(fā)，(iv)脫發(fā)癥，(V)男性型禿頂，(Vi)女性型禿頂。
[0015]在第五方面，提供包含脂肪組織來源分泌物的組合物在制備用于局部治療或預(yù)防個體中痤瘡的藥物中的用途。在實(shí)施方案中，該藥物用于治療或預(yù)防青少年痤瘡。
[0016]在第六個方面，提供了在個體中治療或預(yù)防痤瘡的方法，該方法包括向個體局部給予藥物組合物，該組合物包括脂肪組織來源的分泌物，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
[0017]在實(shí)施方案中個體是青少年。在實(shí)施方案中，個體具有臨床相關(guān)性痤瘡。在實(shí)施方案中痤瘡為囊腫性痤瘡。在實(shí)施方案中，個體患有重度痤瘡。在實(shí)施方案中，具有臨床相關(guān)性痤瘡的個體是青少年。
[0018]本文所描述的本發(fā)明的實(shí)施方案適用于本發(fā)明的各個方面，以及有關(guān)方面。
[0019]在實(shí)施方案中，用于局部給藥的藥物或藥物組合物為乳膏、洗劑、液體或軟膏。在實(shí)施方案中，藥物或藥物組合物是人用藥物或藥物組合物。在實(shí)施方案中，藥物或藥物組合物為獸藥或藥物組合物。
[0020]在實(shí)施方案中，包括脂肪組織來源的分泌物的組合物是來源于牛的。在實(shí)施方案中，包括脂肪組織來源的分泌物的組合物是來源于豬的。
[0021]在實(shí)施方案中，包括脂肪組織來源的分泌物組合物還包括脂肪細(xì)胞。在實(shí)施方案中，包括脂肪組織來源的分泌物的組合物基本上不含脂肪細(xì)胞。
[0022]在實(shí)施方案中，包括脂肪組織來源的分泌物的組合物是從含有脂肪細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液制備的。在實(shí)施方案中，包括脂肪組織來源的分泌物的該組合物是從基本不含脂肪細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液制備的。
[0023]在實(shí)施方案中，個體是人類。在實(shí)施方案中，個體為青春期的人類。在實(shí)施方案中， 個體為非人類哺乳動物。在實(shí)施方案中，非人類哺乳動物是犬科動物。在實(shí)施方案中，非人類哺乳動物是貓科動物。在實(shí)施方案中，非人類哺乳動物為馬。在實(shí)施方案中，非人類哺乳動物是羊。
[0024]在實(shí)施方案中，脂肪組織來源的分泌物是個體自體的。在實(shí)施方案中，脂肪組織來源的分泌物是與個體同種異體的。在實(shí)施方案中，脂肪組織來源的分泌物是與個體異種的。 在實(shí)施方案中，脂肪組織來源的分泌物是來源于牛的。在實(shí)施方案中，脂肪組織來源的分泌物是來源于豬的。
[0025]在實(shí)施方案中，脂肪組織來源的分泌物或包含所述分泌物的細(xì)胞培養(yǎng)物是濃縮的，例如通過冷凍干燥和在合適的液體和體積下再水化。在實(shí)施方案中，再水化后的體積比凍結(jié)干燥前的原體積小約5至20倍。
[0026]在實(shí)施方案中，脂肪細(xì)胞被添加到脂肪組織來源的分泌物中。
[0027]在第七方面，提供了制備牛脂肪組織來源的分泌物的方法，該方法包括:
[0028](i)將牛脂肪組織暴露于蛋白水解酶溶液，以產(chǎn)生細(xì)胞懸浮液；
[0029](ii)離心細(xì)胞懸浮液，以形成細(xì)胞沉淀、位于含有脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層上方的游離脂質(zhì)層、以及位于細(xì)胞沉淀與漂浮細(xì)胞層之間的中間層，與所述細(xì)胞沉淀和所述漂浮細(xì)胞層相比，所述中間層的細(xì)胞較少；并且
[0030](iii)除去游離脂質(zhì)層和中間層，
[0031](iv)選擇地去除部分或基本所有的含有脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層，
[0032](V)混懸細(xì)胞沉淀與，如果存在的話，包含脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層，以形成脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，其可以或可以不含有脂肪細(xì)胞；
[0033](vi)在合適條件下培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液；
[0034](vii)收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液以形成含有牛脂肪組織來源分泌物的組合物。
[0035]在實(shí)施方案中，蛋白水解酶溶液含有終濃度為約0.25%w/v的膠原蛋白酶。在實(shí)施方案中，牛脂肪組織的消化是不完全的。
[0036]在實(shí)施方案中，含有脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層被保留。在實(shí)施方案中，含有脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層被部分地去除。在實(shí)施方案中，含有脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層被去除。
[0037]在實(shí)施方案中，在合適條件下培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液的步驟包含培養(yǎng)以形成貼壁培養(yǎng)物。在實(shí)施方案中，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物為融合細(xì)胞培養(yǎng)物。在實(shí)施方案中，在合適條件下培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液包含旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器中培養(yǎng)細(xì)胞。在實(shí)施方案中，收集的上清液也包含了脂肪細(xì)胞。 在實(shí)施方案中，收集的上清液基本不含脂肪細(xì)胞。在實(shí)施方案中，方法還包含從所述上清中去除細(xì)胞的步驟。
[0038]在實(shí)施方案中，方法還包含冷凍干燥細(xì)胞培養(yǎng)物。在實(shí)施方案中，方法還包含冷凍干燥牛脂肪組織來源的分泌物。在實(shí)施方案中，冷凍干燥的材料在合適體積的合適的液體中被再水化。在實(shí)施方案中，再水化后的體積比凍結(jié)干燥前的原體積小約5至約20倍。
[0039]在第八方面，提供了含有牛脂肪組織來源的分泌物的組合物在制備用于局部使用以Q)治療個體中非炎癥狀態(tài)，或者(ii)刺激個體中毛發(fā)、軟毛或毛皮生長，或者(iii)治療或預(yù)防個體中痤瘡的藥物中的用途。
[0040]在實(shí)施方案中，含有牛脂肪組織來源的分泌物的組合物根據(jù)第七方面描述的方法制備。
[0041]在第九方面，提供了含有牛脂肪組織來源的分泌物以及藥學(xué)上可以接受的載體或者溶劑的藥物組合物。
[0042]在實(shí)施方案中，藥物組合物或者藥物針對局部給藥來配制，例如以洗劑，乳膏，液體或者軟膏的形式。在實(shí)施方案中，藥物組合物或者藥物適用于人類個體。在實(shí)施方案中， 藥物組合物或者藥物適用于非人類個體。
[0043]在實(shí)施方案中，含有牛脂肪組織來源的分泌物的藥物組合物還包含了脂肪細(xì)胞。 在實(shí)施方案中，含有牛脂肪組織來源的分泌物的藥物組合物基本不包含脂肪細(xì)胞。
[0044]上述發(fā)明簡述并非限制性，并且本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在下文的優(yōu)選的實(shí)施方案的詳細(xì)描述和權(quán)利要求中列出。
[0045]附圖簡述
[0046]本發(fā)明優(yōu)選的形式現(xiàn)將參照附圖詳細(xì)說明:
[0047]圖1:單個犬中的剃除區(qū)域的毛發(fā)重生長，在剃除后7天，12天，22天照相記錄。左圖(“處理組”)顯示牛脂肪組織來源分泌物局部給藥一天兩次的剃除區(qū)域的毛發(fā)重生長以及右圖(“對照組”)顯示未受任何處理的剃除區(qū)域的毛發(fā)重生長。
[0048]圖2:七個人個體進(jìn)行含有牛脂肪組織來源分泌物的組合物局部給藥以治療痤瘡的試驗(yàn)結(jié)果。(A)顯示單獨(dú)的試驗(yàn)個體結(jié)果以及(B)顯示7個個體平均每天的結(jié)果。
[0049]縮寫
[0050]為了方便，以下列出本說明書中使用的縮寫。
[0051]DMEM Dulbecco 氏改良 Eagle 培養(yǎng)基
[0052]RPMI皇家公園紀(jì)念研究所培養(yǎng)基
[0053]SVC基底血管細(xì)胞
[0054]定義
[0055]在本發(fā)明的上下文中提及的包含“脂肪組織來源的分泌物”將被理解為指包括一種或多種從脂肪組織的細(xì)胞釋放的因子的組合物。制備含有分泌物的組合物所使用的材料可以包含脂肪細(xì)胞或者基本不包含脂肪細(xì)胞。
[0056]本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體或佐劑”包含的不僅僅是適用于對人進(jìn)行局部給藥的載體或溶劑，也包括適用于對非人類的個體進(jìn)行局部給藥的載體或溶劑。在特定實(shí)施方案中，載體或溶劑適用于對非人類哺乳動物個體進(jìn)行給藥。在特定實(shí)施方案中載體或溶劑適用于對人類個體進(jìn)行給藥。
[0057]本發(fā)明說明書上下文中的術(shù)語“治療(treating) ”、“治療(treatment) ”、“療法 (therapy) ”等是指非炎癥疾病或皮膚病況或痤瘡的癥狀和/或形成原因的緩解。簡短地說，這些可在此被多樣地總結(jié)為“病況”或“病癥”。在某些實(shí)施方案中，治療會減緩，推遲或阻止疾病或者疾病癥狀進(jìn)程，或者逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程，至少是暫時性的。因此，在本發(fā)明上下文中術(shù)語“治療(treatment) ”或其衍生詞例如“治療(treating) ”當(dāng)與治療性應(yīng)用相關(guān)時包括療法的所有方面時，例如緩解與待治療疾病相關(guān)的疼痛，緩解待治療疾病的嚴(yán)重性，改善待治療疾病的一種或多種癥狀，改善接受治療的個體的總體健康狀況等，例如治療痤瘡中改善了皮膚的外觀。術(shù)語“治療”或其衍生詞的使用被理解成意為“被治療的”個體會獲得一種或更多上述的益處。
[0058]本說明的全文中，提及的“一種(a)”或“一個(one)”元件不排除復(fù)數(shù)，除非上下文另有說明。
[0059]本文使用的術(shù)語“治療有效量”包括限于其含義的用于本發(fā)明以提供所需的治療效果的無毒但是足夠劑量的化合物或組合物。確切所需的量將因個體之間而異，取決于一些因素例如被治療的物種，個體的年齡和一般情況，合并癥，待治療病況的嚴(yán)重程度，給予的具體試劑以及給藥模式等。因此，在任一給定的案例中，合適的“有效劑量”可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)方法來確定。
[0060]在本說明書的上下文中，術(shù)語“包含”意為包括，但并非僅限必要地包括。另外，術(shù)語“包含”的變體，例如“comprise”和“comprises”，具有相對應(yīng)的變化的含義。因此，術(shù)語“包含”及其變體在包容的而不是排他的意義上使用，使得組合物、方法等中任選地出現(xiàn)其他整數(shù)或者特征等，被描述為包含整數(shù)A，或包含整數(shù)A和B，等等。
[0061]在本說明書的上下文中，術(shù)語“約”將被理解為表示一個熟練的接收者 (addressee)給定值相關(guān)聯(lián)的通?？山邮艿姆秶?br> [0062]在本說明書中的上下文中，一個給定了范圍的參數(shù)可被理解為，該參數(shù)包括了規(guī)定的范圍之內(nèi)所有的值，包括所述范圍的端點(diǎn)。例如，范圍“ 5至10 ”將被理解為值5，6，7， 8，9和10，以及給定范圍內(nèi)的任何子范圍，例如的6至10，7至10，6至9，7至9等，并包括整數(shù)之間的，在所述范圍的上下文中合理的任何值與范圍，如5.5，6.5，7.5，5.5至8.5和6.5
至9等。
[0063]在本說明書的上下文中，術(shù)語“多個”是指任何大于I的數(shù)。
[0064]但是應(yīng)當(dāng)指出的是，在治療或療法中作為參考使用本發(fā)明的方法和組合物將被理解為適用于人類和非人類，如獸醫(yī)方面的應(yīng)用。因此，應(yīng)理解的是，除另有說明外，提及患者，個體或個人意為人類或非人類，例如社會、經(jīng)濟(jì)或研究上重要的任何物種的個體，包括但不限于羊，牛，馬，豬，貓，犬，靈長類動物，嚙齒類動物分類學(xué)成員，尤其是家養(yǎng)的這種分類學(xué)成員如羊，牛，馬，犬。
[0065]在一定允許的程度上，本文中引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用將其整體并入本文。
[0066]優(yōu)選實(shí)施方案詳細(xì)說明
[0067]本發(fā)明將被更詳細(xì)地描述，包括僅作為說明的方式參照以下實(shí)施例。
[0068]令人驚訝的是，本發(fā)明人已經(jīng)鑒別了多種從脂肪組織來源的細(xì)胞(可以包括或者不包括脂肪細(xì)胞)的分泌物可有效地改善各種非炎癥病況，用于刺激毛發(fā)、軟毛和毛皮的生長，以及用于減輕痤瘡。本發(fā)明所描述的是含有脂肪組織來源的分泌物的局部組合物以及組合物在用于治療非炎癥性病癥，刺激毛發(fā)、毛皮和軟毛生長，以及治療或預(yù)防痤瘡中的用途。
[0069]因此，本發(fā)明一方面提供了在個體中治療非炎癥性病癥的方法，該方法包括向個體局部給予藥物組合物，該藥物組合物包括脂肪組織來源的分泌物，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
[0070]當(dāng)術(shù)語“炎癥”用來表示病癥時，指由炎癥產(chǎn)生，由炎癥導(dǎo)致或者導(dǎo)致炎癥的，不正常的或以正常方式不能解除的病理過程。炎癥性病癥可以是全身性的或局限于特定的組織或器官中。本發(fā)明期望治療的非炎癥性病況并不作為以下情況的結(jié)果出現(xiàn):不正常的炎癥或以正常方式不能解除的炎癥。
[0071]非炎癥性病癥的治療包括減輕這類病癥的一種或多種癥狀或表現(xiàn)。例如，本發(fā)明的方法包括皮膚病況的治療。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療皮膚病況的方法，其中所述的皮膚病況并不是炎癥性病癥的表現(xiàn)。雖然本發(fā)明期望治療的特定狀態(tài)可以出現(xiàn)一定程度的炎癥，例如在曬傷的病況下，這種病況一般不歸類為炎癥性病癥因此根據(jù)本發(fā)明的目的是非炎癥性病況或者非炎癥性病況的表現(xiàn)。
[0072]本發(fā)明期望治療的具體狀態(tài)包括:(i)皮膚干燥，(ii)皮膚瘙癢，(iii)昆蟲叮咬， (iv)曬傷，(V)皮膚皺紋，(vi)皮膚過薄，(vii)皮膚開裂，(viii)昆蟲蜇傷，(ix)癥痕， (x)萎縮紋，(xi)曬斑，(xii)老年斑(xiii)黃褐斑，(xiv)眼睛周圍的浮腫和/或黑眼圈， (xv)足癬，(xvi)疣，并且所述治療減輕一種或多種所述治療。[0073]脂肪組織來源的分泌物及其藥物組合物的另一個令人驚訝的效果是，當(dāng)對個體給藥時其刺激毛發(fā)生長。因此，本發(fā)明在另一方面提供了刺激個體中毛發(fā)、軟毛或毛皮生長的方法，該方法包括對個體局部給予包括脂肪組織來源的分泌物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的組合物。
[0074]該組合物針對個人的局部給藥來配制。在某些實(shí)施方案中，個體是人類。當(dāng)個體出現(xiàn)(i)手術(shù)引起的脫發(fā)，(ii)與化療相關(guān)的脫發(fā)，(iii)輻射暴露相關(guān)的脫發(fā)，(iv)脫發(fā)癥，(v)男性型禿頂，(Vi)女性型禿頂中的一種或多種時，組合物提供在個體中對毛發(fā)生長刺激的能力是有益的。
[0075]在某些實(shí)施方案中，被給予該組合物的個體是以生產(chǎn)軟毛或毛皮為目的飼養(yǎng)的非人類動物。例如，個體可以是飼養(yǎng)用于生產(chǎn)軟毛的羊，特別是綿羊。在某些實(shí)施方案中，非人類哺乳動物是伴侶動物或用于演藝的動物或種畜動物，如犬，貓，牛或馬。
[0076]痤瘡
[0077]本發(fā)明人已經(jīng)鑒定脂肪組織來源的分泌物和其藥物組合物對治療痤瘡是有效的。痤瘡?fù)ǔＷ鳛槠つw毛囊、毛孔或皮脂腺阻塞的結(jié)果而發(fā)生，其可通過堆積的死皮細(xì)胞和/或皮脂發(fā)生。這可以通過阻塞的毛囊，毛孔或腺體的菌落形成而加劇，例如通過天然存在的共生細(xì)菌痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes),或者通過金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)。[0078]通常受痤瘡影響的皮膚區(qū)域的毛囊皮脂腺或腺體較為密集，如面部，胸部和背部的上半部分。在痤瘡更嚴(yán)重的情況下，在汗水聚集在毛囊和排汗管道的皮膚區(qū)域可以發(fā)生痤瘡囊腫，如臀部，腹股溝和腋下部位。痤瘡可以體現(xiàn)為非炎癥性的形式，雖然重度痤瘡也可以有炎癥的組成。但應(yīng)理解在本發(fā)明中預(yù)期治療或預(yù)防的痤瘡可以有炎癥的組成部分。 還應(yīng)理解的是，在本發(fā)明中預(yù)期治療或預(yù)防的痤瘡可以是非炎癥性的。
[0079]痤瘡最常發(fā)生在青春期并且通常會延續(xù)到成年期。青春期的痤瘡的發(fā)生可以與雄激素的增加有關(guān)，例如睪酮，其水平在男性和女性的青春期上升。
[0080]痤瘡的物理表現(xiàn)可以是可變的并且根據(jù)對外觀和長期作用的嚴(yán)重程度變化。輕度痤瘡，例如，可以包括鱗片狀的紅色皮膚，黑頭和白頭(也可稱為粉刺)，丘疹(也可稱為針頭(pinhead))，以及在更嚴(yán)重的情況下的膿皰或疙瘩，結(jié)節(jié)和囊腫。較大的結(jié)節(jié)被稱為結(jié)節(jié)囊性痤瘡或囊腫性痤瘡。囊腫性痤瘡與通常的痤瘡相比通常會影響較深的皮膚組織?；加叙畀彸藢€體有身體上的不適和潛在的心理影響，痤瘡可對個體有較長期的影響，如對皮膚產(chǎn)生身體上的疤痕。
[0081]本發(fā)明預(yù)期治療或預(yù)防所有形式的痤瘡。在特定實(shí)施方案中，方法針對臨床相關(guān)性痤瘡。如本文所述，臨床相關(guān)性痤瘡為潛在地對個人產(chǎn)生不利影響的痤瘡，無論是身體上的，例如通過疤痕，或者情緒上的，就這種程度來說臨床干預(yù)是可取的。臨床干預(yù)有可以或可以不是由一個受過訓(xùn)練的醫(yī)生進(jìn)行的。通常情況下，干預(yù)在患有中度至重度痤瘡的個體， 或具有一種或多種大型結(jié)節(jié)或囊腫的個體，或患有大面積分布的痤瘡的個體，或具有中度至重度痤瘡的個人或家族病史的個體中是可取的。
[0082]通過使用本文所描述的脂肪組織來源的分泌物及其藥物組合物，患有痤瘡的個體可以經(jīng)歷病況的改善，包括減少患處皮膚的炎癥，加速愈合和減少瘢痕形成。正如本文表明的，繼續(xù)使用本發(fā)明的組合物，可以預(yù)防個體中痤瘡的復(fù)發(fā)，或可以降低復(fù)發(fā)痤瘡的嚴(yán)重程度。
[0083]脂肪組織
[0084]脂肪組織可以是人體脂肪組織或哺乳動物的脂肪組織。人類或動物可以是存活的或者是死亡的，但優(yōu)選脂肪組織內(nèi)具有可用的脂肪細(xì)胞。脂肪組織可以來源于成年的動物， 或源于未成年的動物。在特定的實(shí)施方案中，動物為伴侶動物，如犬或貓等家畜，或工作用動物。在其他具體的實(shí)施方案中，哺乳動物是農(nóng)場用動物，種畜動物，或比賽用動物，如馬 (包括馬，驢(donkeys)，驢(asses))，牛(包括黃牛和水牛)，羊，山羊，豬，駱駝(包括駱駝，美洲駝，羊駝等)。在其它實(shí)施方案中，動物是研究用動物，如嚙齒動物。在其它實(shí)施方案中，動物是動物園動物，例如貓科成員，犬科成員，嚙齒目成員，或鯨目，奇蹄目，偶蹄目， 管齒目，蹄兔目，海牛目，長鼻目中的一個的成員。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪組織是牛的或豬的。
[0085]脂肪組織可來源于將被給予含有脂肪組織來源的分泌物的藥物組合物的同一個體，其中脂肪組織以及因此脂肪組織來源的分泌物是自體的。脂肪組織可以來源于與將被給予含有脂肪組織來源的分泌物的藥物組合物的個體同一物種的不同的個體，其中脂肪組織以及因此脂肪組織來源的分泌物是同種異體的。在某些實(shí)施方案中的脂肪組織可以來源于與將被給予含有脂肪組織來源的分泌物的藥物組合物的個體不同物種的個體，其中脂肪組織以及因此脂肪組織來源的分泌物是異種的。脂肪組織可以源于單一來源或可以源于多于一個的來源，如單一物種的多于一個的個體或者或源于多個物種。
[0086]脂肪組織可以源于體內(nèi)任意的可獲得的來源。皮下脂肪，例如，易于只通過表面創(chuàng)傷獲得，如從尾基切除，或者使用鎖孔手術(shù)技術(shù)。皮下脂肪組織可利用吸脂技術(shù)收集。例如， 在絕育雄性或雌性哺乳動物時脂肪組織可與生殖組織一起去除?？蓮膭傇讱⒌膭游锶コ窘M織。脂肪組織可以包括“白色”脂肪組織和/或“棕色”脂肪組織。在具體的實(shí)施方案中，脂肪組織只包含白色脂肪組織。
[0087]脂肪組織可以用組織培養(yǎng)基或緩沖的等滲溶液沖洗，以除去粘附的紅血細(xì)胞。月旨肪組織也可用消毒液如聚乙烯吡咯烷酮碘進(jìn)行沖洗，并可以在制備脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液之前被修剪或初步處理，以除去大血管或結(jié)締組織的成分。
[0088]脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液
[0089]脂肪組織來源的細(xì)胞的分泌物以及因此含有這種分泌物的組合物，優(yōu)選通過首先獲取或制備脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液來制備。細(xì)胞懸浮液可以含有脂肪細(xì)胞，或者可以基本上不含脂肪細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞懸浮液與起始物質(zhì)相比脂肪細(xì)胞已大量去除時，如離心后去除脂肪細(xì)胞組分，為了制備脂肪組織來源的分泌物目的的細(xì)胞懸浮液在本文中應(yīng)當(dāng)理解為基本上不含脂肪細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解的是在有關(guān)細(xì)胞懸浮液時使用基本不含有脂肪細(xì)胞時，既包括完全不存在脂肪細(xì)胞，還包括在原料中出現(xiàn)極微量的脂肪細(xì)胞保留的情況。
[0090]本文所用的術(shù)語“脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液”包括來自脂肪組織分離的細(xì)胞或脂肪組織小凝聚體或塊，或者兩種或更多種分離的細(xì)胞、脂肪組織小凝聚體或塊的混合物。
[0091]細(xì)胞懸浮液可以使用在本【技術(shù)領(lǐng)域】中的可用的機(jī)械解離脂肪組織的技術(shù)獲得。任何機(jī)械分離脂肪組織的合適的方法都可以 被使用，例如可以使用具有刀片切碎脂肪組織， 或通過剪刀，或迫使脂肪組織通過篩子或通過網(wǎng)眼大小足以破壞組織分離出單獨(dú)的細(xì)胞和 /或脂肪組織小塊的濾網(wǎng)。也可使用合適技術(shù)的組合。當(dāng)離解的脂肪來源的細(xì)胞重聚集成較大的聚集體時可以形成脂肪組織的小聚集體，例如，在培養(yǎng)基中靜置時。脂肪組織的小塊或聚集體的最大直徑可以小于10毫米,最大直徑小于5毫米,最大直徑小于1毫米,最大直徑小于500 μm或最大直徑小于250 u m。在某些實(shí)施方案中，使用機(jī)械分離技術(shù)而不是一種或多種蛋白水解酶。在這些實(shí)施方案中采用的技術(shù)，可用于迅速產(chǎn)生脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液。
[0092]用濾網(wǎng)或篩子過濾脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，以除去大于網(wǎng)眼或篩孔孔徑的細(xì)胞的聚集體或組織塊。
[0093]在某些實(shí)施方案中，使用蛋白水解酶促進(jìn)脂肪組織離解成脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液。適合用于此類用途的酶是本【技術(shù)領(lǐng)域】中已知的，包括但不限于胰蛋白酶和膠原酶。蛋白水解酶可在使用脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液前被去除或失活，特別是其中的這些酶可以與細(xì)胞懸浮液所需的用途不相容。在某些實(shí)施方案中，蛋白水解酶與機(jī)械分離脂肪組織的技術(shù)相結(jié)合用來產(chǎn)生脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液。
[0094]在特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞懸浮液可以被懸浮在介質(zhì)中。介質(zhì)可以在脂肪組織離解的過程之前，之中或之后被添加脂肪組織中。介質(zhì)可以是能夠在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，如組織培養(yǎng)基中，維持脂肪組織細(xì)胞至少存活24小時的介質(zhì)。該介質(zhì)可以是等滲的緩沖溶液， 如磷酸鹽或HEPES緩沖鹽水，其能夠保持脂肪組織細(xì)胞至少存活一小時。該介質(zhì)可以是無血清培養(yǎng)基。該介質(zhì)可以包括支持或延長細(xì)胞懸浮液中的脂肪組織細(xì)胞存活的血清或血清成分。血清或血清成分可以是自體的血清或血清中的成分。血清或血清的成分可以是來源于單一的個人或來源自多個個人并集中的同種異體的血清或血清成分。
[0095]在另外的實(shí)施方案中，細(xì)胞懸浮液不是懸浮在介質(zhì)中，而是將細(xì)胞懸浮在組織的離解的過程中形成的液體中。
[0096]在某些實(shí)施方案中，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的制備包括離心步驟。懸浮在液體(例如培養(yǎng)基)中的分離的細(xì)胞或者脂肪組織小聚集體或塊的離心約為500g下10分鐘， 或足夠的時間和足夠的離心力來產(chǎn)生含有脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀之上為介質(zhì)層，依次漂浮在其上的為包含脂肪細(xì)胞的層，漂浮在頂部的為來源于破裂的脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)層。
[0097]離心后，在某些實(shí)施方案中，包含脂肪細(xì)胞的分泌物的介質(zhì)層，可以被收集，從而代表脂肪組織來源的分泌物的一種組合物或來源。在本實(shí)施方案中，收集到的含有分泌物的介質(zhì)或組合物可以包含或不包含脂肪細(xì)胞。
[0098]在某些其它實(shí)施方案中，離心后，脂質(zhì)層和介質(zhì)層被丟棄，保留的細(xì)胞被混合，保留脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，其包括脂肪細(xì)胞和脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞。
[0099]在某些其它實(shí)施方案中，離心后，脂質(zhì)層，介質(zhì)層，含有脂肪細(xì)胞的漂浮層都被丟棄，從而保留主要脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞。
[0100]在某些實(shí)施方案中，可以使用多個離心步驟，例如提供額外的細(xì)胞分離步驟。
[0101]在其它實(shí)施方案中，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的制備不包括離心步驟。
[0102]脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液可以是新鮮分離的，即它可以被用于制備脂肪組織來源的分泌物，在從供體去除脂肪組織的約6個小時內(nèi)對受體進(jìn)行給藥。在這些實(shí)施方案中， 脂肪組織來源的分泌物的制備通常不包括本文所述的培養(yǎng)細(xì)胞步驟?；蛘?，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液可以在被用于制備脂肪組織來源的分泌物之前被存儲6小時以上，通常當(dāng)懸浮在介質(zhì)中時。
[0103]用于制備脂肪組織來源的分泌物的脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液可包含或不包含脂肪細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，脂肪細(xì)胞包括活的脂肪細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，脂肪細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中保留著可檢測量的脂質(zhì)，并且可以根據(jù)脂質(zhì)所提供的不同密度分離脂肪來源的非脂肪細(xì)胞。脂質(zhì)可使用光顯微技術(shù)被檢測到，包括相差顯微鏡，或者通過用親脂性染料，如油紅0對細(xì)胞樣品染色。在其細(xì)胞質(zhì)中保留脂質(zhì)的脂肪細(xì)胞比起其他脂肪來源的細(xì)胞是相對脆弱的，并且因此當(dāng)需要活脂肪細(xì)胞的，應(yīng)避免損害相當(dāng)大的比例的脂肪細(xì)胞或致使其非活性的解離組織技術(shù)。例如，脂肪組織的超聲波離解或使脂肪組織劇烈搖動的技術(shù)不可以提供其中包含大量活的脂肪細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。使用目前可獲得技術(shù)，如LIVE/ DEAD細(xì)胞活力檢測(Life Technologies),可以容易地確定脂肪細(xì)胞的活力。
[0104]在某些實(shí)施方案中，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液不包含大量的脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，通過本文所述的包含離心步驟的方法可方便地制備脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，通過該方法排除了沉淀的脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞。
[0105]在某些實(shí)施方案中，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液包括脂肪細(xì)胞和脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，通過本文所述的包含離心步驟的方法可方便地制備脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，其中脂肪細(xì)胞層和沉淀的脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞被收集?？蛇x地，在這些實(shí)施方案中的脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液可通過如本文所述的解離脂肪組織來制備而無需離心步驟。
[0106]牛脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液
[0107]本發(fā)明人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，從牛來源的脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的制備，特別是從牛尾基部組織，與適應(yīng)于多種其他脂肪組織來源，如人，犬，馬，小鼠和大鼠，的標(biāo)準(zhǔn)方法相比較難操作。因此，本發(fā)明的應(yīng)用，如果其利用牛脂肪來源細(xì)胞的分泌物，優(yōu)選地采用制備牛脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的方法，此方法包括:
[0108]-將牛脂肪組織的樣品暴露于蛋白水解酶的溶液來產(chǎn)生細(xì)胞懸浮液；
[0109]-離心細(xì)胞懸浮液，以形成細(xì)胞沉淀、位于含有脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層上方的游離脂質(zhì)層，和位于細(xì)胞沉淀與漂浮細(xì)胞層之間的中間層，所述中間層缺乏與細(xì)胞沉淀和漂浮細(xì)胞層相關(guān)的細(xì)胞；并且
[0110]-除去游離脂質(zhì)層和中間層，
[0111]-任選地部分或基本完全除去含有脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層，
[0112]-混合細(xì)胞沉淀以及，假如存在，所述漂浮細(xì)胞層來形成脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，其可以或可以不包括脂肪細(xì)胞。
[0113]如本文所述，脂肪細(xì)胞層，也被稱為漂浮細(xì)胞層，在制備過程中可以或可以不被去除。因此，本發(fā)明的方法和組合物，在不同的實(shí)施方案中，包括任選地去除脂肪細(xì)胞層獲得基本不含脂肪細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液；任選地保留脂肪細(xì)胞層獲得含有脂肪細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液；任選地部分去除脂肪細(xì)胞層。
[0114]在某些實(shí)施方案中，該方法可包括位于本說明書中的其他地方的制備脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的額外步驟，尤其是上述的“脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液”部分。這些額外的步驟包括，例如，機(jī)械解離組織，用培養(yǎng)基或緩沖液等懸浮。
[0115]去除的中間層可以被保留因?yàn)樗ǔ０ㄖ窘M織來源的分泌物。[0116]在某些實(shí)施方案中蛋白水解酶溶液包括膠原酶。
[0117]在某些實(shí)施方案中使用的膠原酶的終濃度為約0.25%w/v或更高。在某些實(shí)施方案中，牛脂肪組織暴露于蛋白水解酶是在導(dǎo)致脂肪組織不完全消化的條件下進(jìn)行的，例如導(dǎo)致顯著量的完好的脂肪組織存在的條件。通常情況下，例如，可以存在與開始消化之前具有相同的尺寸的脂肪組織塊。在此方法的實(shí)施方案中，約20%至約80%的脂肪組織可以不被消化。
[0118]在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以受到多個離心步驟或洗滌步驟，例如為了除去過多的游離脂質(zhì)。
[0119]如以下部分進(jìn)一步的描述，可以是任何物種的來源，如本文提及的，例如牛，豬， 犬，貓，人等，的脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液或其等分試樣，可以被用于制備含有脂肪組織來源的細(xì)胞的分泌物的組合物。
[0120]含有脂肪組織來源的分泌物的組合物
[0121]含有從脂肪組織來源的細(xì)胞的分泌物的組合物可由脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液通過任何適當(dāng)?shù)姆绞街苽?，其可以或可以不包括脂肪?xì)胞。如本文中提到的在脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的制備中形成的液體組分通常包括脂肪組織來源的分泌物，從而表示含有這種分泌物的組合物的一個實(shí)施方案。以這種形式，含有脂肪組織來源的分泌物的組合物可以在制備細(xì)胞懸浮液的任何適當(dāng)?shù)碾A段被收集，例如通過在離心脂肪組織來源的原料后收集位于細(xì)胞沉淀和漂浮細(xì)胞層之間的中間液體層。在本實(shí)施方案中所收集的含有分泌物的原料可以或可以不包括脂肪細(xì)胞。
[0122]通常情況下，該組合物通過將介質(zhì)暴露于脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液產(chǎn)生。將介質(zhì)暴露于脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液并不需要使細(xì)胞附著到基質(zhì)上的條件。在這些實(shí)施方案中，所述含有脂肪組織來源的分泌物的組合物可通過以下產(chǎn)生:將介質(zhì)暴露于脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液任意一段適當(dāng)?shù)臅r間，例如至少6小時,至少8小時,至少10小時,或至少12小時，然后從介質(zhì)中除去細(xì)胞懸浮液，或反之亦然，例如通過離心或過濾。細(xì)胞懸浮液與介質(zhì)的互相分離可以導(dǎo)致完全的或不完全的細(xì)胞去除。因此，含有脂肪組織來源分泌物的介質(zhì)，從細(xì)胞懸浮液中取出后可以或可以不包括脂肪細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該組合物通過以下產(chǎn)生:將介質(zhì)暴露于脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液不超過12小時，不超過18小時或超過24小時。該組合物可包含脂肪組織細(xì)胞的細(xì)胞死亡或解體后，從細(xì)胞中釋放的細(xì)胞來源的分子。該組合物含有脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞的分泌物。介質(zhì)對脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的接觸，可以在4°C至50°C的溫度下，更典型的溫度為10°C至40°C，最典型的溫度為20°C至37°C。
[0123]對于典型的脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，5克脂肪組織被分離并被懸浮于含10% 自體血清的50ml的DMEM中。對于每克脂肪組織來源的原料，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液通常包括從100，000個到1，000，000個非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞。每克脂肪組織來源的原料中脂肪細(xì)胞數(shù)目通常是100，000至5，000，000之間。
[0124]本文所用的術(shù)語“介質(zhì)”意在包括支持脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液中的至少部分細(xì)胞中的至少存活一個小時的組合物。該介質(zhì)可以是組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，如DMEM，RPMI，或基本必需的培養(yǎng)基，任選地補(bǔ)充了血清。該介質(zhì)可以是緩沖的等滲溶液，如磷酸鹽緩沖鹽水或Hank’ s緩沖鹽水溶液，使介質(zhì)適合于對個體給藥。該介質(zhì)可以是在脂肪組織的離解過程中形成的液體。該介質(zhì)可任選地補(bǔ)充促進(jìn)細(xì)胞存活或附著和細(xì)胞分裂的因子，如胰島素， 孕激素和硒，或血清或血清成分。在某些實(shí)施方案中的介質(zhì)必須適合藥物組合物，其在體內(nèi)使用是可以接受的。這樣的介質(zhì)，將基本上不含熱原或其它可以對人類或動物有害的雜質(zhì)。 藥學(xué)上可接受的介質(zhì)是可商購的。短語“藥學(xué)上可接受的”指當(dāng)給動物或人給藥時不產(chǎn)生有害的，致敏的或其它不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。
[0125]制備含有脂肪組織來源的分泌物的組合物可以包括裂解脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的步驟。含有細(xì)胞的分泌物的裂解產(chǎn)物可以通過合適的方法制備。在示例性實(shí)施方案中，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液可以暴露于介質(zhì)，例如如上所述的介質(zhì)。懸浮液中的細(xì)胞可通過任何合適的裝置，例如由機(jī)械破壞(例如，劇烈振蕩或攪拌)，超聲波破壞，凍融，冷凍干燥或添加一種或多種可以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，例如脂肪細(xì)胞的裂解，的試劑。這種裂解試劑在本【技術(shù)領(lǐng)域】中是已知的，包括尿素，十二烷基硫酸鈉和Triton XlOO0裂解步驟之后產(chǎn)物被離心或過濾以協(xié)助除去細(xì)胞碎片，或者它可以不經(jīng)這種凈化步驟就被使用，在這種情況下， 含有脂肪組織來源的分泌物的該組合物可以也包括細(xì)胞碎片。在某些情況下細(xì)胞裂解產(chǎn)物可以被從裂解試劑中去除，通過細(xì)胞裂解產(chǎn)物的沉淀。當(dāng)裂解步驟導(dǎo)致不完全的細(xì)胞裂解時，含有脂肪組織來源的分泌物的該組合物也可以包括脂肪來源的細(xì)胞，例如脂肪細(xì)胞。
[0126]在某些實(shí)施方案中脂肪組織來源的分泌物的制備包括在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液。用于培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液的方法在本【技術(shù)領(lǐng)域】是已知的并且包括，例如，培養(yǎng)細(xì)胞來形成貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物，如匯合貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，以及在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器中培養(yǎng)細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)的期間或之后的任何適當(dāng)時間收集上清液，比如從貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物，可以是匯合貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物，以及任選地，從所述上清液去除細(xì)胞以形成含有脂肪組織來源的分泌物的組合物。如此培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮液可以包括脂肪細(xì)胞或者可以基本上不含脂肪細(xì)胞。為留下含有脂肪組織來源的分泌物的組合物而從上清液中去除細(xì)胞，可以是完全去除，或者可以是部分除去。在后者的情況下，包含脂肪組織來源的分泌物的該組合物也可以因此而包括脂肪細(xì)胞。
[0127]在細(xì)胞培養(yǎng)開始前，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液可以被重新懸浮在所需的體積的合適的緩沖液中，如DMEM，RPMI或基本必須的培養(yǎng)基。細(xì)胞懸浮液或其等分試樣，可以加入到無菌的組織培養(yǎng)瓶中，并在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，通常至貼壁細(xì)胞達(dá)到匯合。細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選在無菌的血清中進(jìn)行。培養(yǎng)中血清的濃度可以是協(xié)助脂肪組織來源的細(xì)胞的培養(yǎng)的任何合適的濃度，例如在約l%v/v至約30%v/v的范圍內(nèi)變化，例如約10%v/v，或約15%v/v或約 20%v/v。培養(yǎng)脂肪組織來源的細(xì)胞所用的血清可以是任何合適的血清，如商購的胎兒腓腸血清，或通過本【技術(shù)領(lǐng)域】中已知的方法內(nèi)部制備的血清。優(yōu)選為從與獲取脂肪組織的同一個體來制備的自體血清，或同種異體血清。通常情況下，在37°C下在5%C02下培養(yǎng)細(xì)胞。
[0128]在培養(yǎng)過程中，脂·肪組織來源的細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌細(xì)胞因子，包括抗炎因子，促炎癥因子，生長因子和其它細(xì)胞信號分子。培養(yǎng)物的上清液因而含有脂肪組織來源的分泌物。
[0129]在某些實(shí)施方案中的培養(yǎng)物可以被冷凍并且冷凍干燥，獲得含有細(xì)胞和分泌物的冷凍干燥制劑。冷凍干燥制劑的再水化將裂解大多數(shù)細(xì)胞，導(dǎo)致額外的細(xì)胞因子被釋放。再水化通常使用體積小于脂肪組織來源的細(xì)胞原來的體積的液體，例如比原來的體積小約5 和約20倍之間，更典型地為比脂肪組織來源細(xì)胞原來的體積小約為10倍，導(dǎo)致了 10倍濃縮的組合物。然后，該組合物可以進(jìn)行過濾，以除去細(xì)胞碎片，產(chǎn)生含有濃縮的細(xì)胞因子的組合物。這提供了用于生產(chǎn)大體積濃縮分泌物的優(yōu)選方法。
[0130]在其他某些實(shí)施方案中，上清液可以在任何合適的時間從培養(yǎng)物中收集，雖然通常在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中在細(xì)胞達(dá)到匯合時收集，例如在約3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14 天之后。細(xì)胞，細(xì)胞碎片和其它任何殘留脂肪組織可以被從上清液中去除，例如通過過濾。 在實(shí)施方案中，可以是通過20微米的篩網(wǎng)過濾。如果需要的話，多個過濾步驟可以通過例如兩個或更多個網(wǎng)眼尺寸逐漸減小的濾器進(jìn)行。脂肪組織來源的分泌物制備產(chǎn)物通常是通過過濾滅菌，如0.22微米的過濾器。滅菌后的組合物可以被立即使用，或者可以被等分使用，或用于貯存。通常情況下，如果存儲，該組合物被冷凍保存在_20°C中。該組合物含有脂肪組織來源的細(xì)胞的分泌物。
[0131]包含脂肪組織來源的分泌物的該組合物也可以包括脂肪細(xì)胞。當(dāng)存在時，脂肪細(xì)胞可以從制備分泌物中使用的原來的脂肪組織殘留下來，或者它們可以被添加到含有分泌物的組合物中。
[0132]本發(fā)明的藥物組合物和其他組合物
[0133]根據(jù)本發(fā)明的多個方面，含有脂肪組織來源的分泌物的脂肪組織來源的組合物， 用于制備用于局部給藥的藥物組合物。根據(jù)一方面本發(fā)明提供了含有脂肪組織來源的分泌物的組合物，用于制備在治療個體的非炎癥疾病中局部使用的藥物組合物。在另一方面本發(fā)明提供了含有脂肪組織來源的分泌物的組合物，用來制備在刺激個體中毛發(fā)、軟毛或毛皮生長中局部使用的藥物組合物。在另一方面本發(fā)明提供了含有脂肪組織來源的分泌物的組合物，用來制備用于治療或預(yù)防痤瘡，或其一種或多種的癥狀的局部使用的藥物組合物。 通常情況下藥物組合物也包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體稀釋劑、賦形劑或佐劑。根據(jù)本發(fā)明的再一個方面提供了藥物組合物，其含有脂肪組織來源的分泌物以及藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑，賦形劑或佐劑。在某些實(shí)施方案中，該組合物包括脂肪組織來源的分泌物,還包括脂肪細(xì)胞。
[0134]在某些實(shí)施方案中，脂肪組 織取自于單個個體，并且將藥物組合物向同一個體局部給藥，因此脂肪組織來源的分泌物為純粹的自體的制劑。
[0135]在某些實(shí)施方案中，脂肪組織是從一種或多種個體個體中獲取并且藥物組合物向同一物種的不同個體局部給藥，因此，脂肪組織來源的分泌物是同種異體的細(xì)胞懸浮液。在某些實(shí)施方案中，脂肪組織從與將成為脂肪組織來源的分泌物的受體的不同物種的個體獲取。例如，從?；蜇i的組織中制備的含有分泌物的組合物，可用于對不同的物種局部給藥， 諸如人。在實(shí)施方案中，含有脂肪組織來源分泌物的組合物用于作為原料來源用于同一物種的不同個體，或者作為原料來源用于不同物種，該組合物通常沒有免疫系統(tǒng)細(xì)胞，以盡量減少宿主(受體)對組合物的免疫反應(yīng)或移植物抗宿主病的可以性。
[0136]在某些實(shí)施方案中藥物組合物是從一個以上的脂肪組織來源制備的，如從來自同一個體的不同制劑或取自不同個體的不同制劑。細(xì)胞庫可以包括多種脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的組合，如在培養(yǎng)皿的培養(yǎng)步驟或可以包含的多個脂肪組織來源的分泌物的組合物的組合，例如可從單獨(dú)培養(yǎng)或接觸步驟獲得。
[0137]藥物組合物對個體的局部給藥，通常通過直接或間接與皮膚接觸。還應(yīng)理解本文所述的局部給藥包括經(jīng)皮給藥。通常情況下，經(jīng)皮給藥系統(tǒng)包含被配制為含有一種或多種增加皮膚對此組合物的滲透性的試劑的藥物組合物。[0138] 用于局部給藥的藥物組合物，例如用于治療皮膚病況或刺激毛發(fā)生長，或用于治療或預(yù)防痤瘡，可以配制成水基乳膏或乳液，如聚西托醇霜或索柏林(sorbolene)霜，以增加在皮膚表面的停留。如本文所述，本發(fā)明人已經(jīng)確定本發(fā)明的組合物能有效地刺激毛發(fā)、 毛皮或軟毛生長。因此，本發(fā)明用于局部使用的組合物包括常規(guī)使用的護(hù)發(fā)產(chǎn)品，如香波， 護(hù)發(fā)素，發(fā)膠，等類似物。
[0139]當(dāng)藥物組合物對角膜給藥時，它可以被配制成對角膜給藥可接受的油基的軟膏， 或者它可以與角膜可接受的人工淚液相混合，以增加在角膜表面的停留時間。
[0140]現(xiàn)在參照以下的實(shí)施例僅以說明的方式更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例旨在用于說明本發(fā)明，不應(yīng)該被解釋為限制整個說明書中描述的公布的一般性。
[0141]實(shí)施例1脂肪細(xì)胞和脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的混合物的制備。
[0142]從成年犬腹股溝通過切除收集IOg脂肪組織樣品。用生理鹽水沖洗脂肪組織然后用剪刀完全切成碎末并且與20ml的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)混合。 加入膠原酶(Sigma)，使終濃度為0.05%w/v并將樣品在37°C下孵育90分鐘。孵育時每15 分鐘用手將樣品輕輕上下顛倒。
[0143]膠原酶處理后，將樣品在無菌條件下通過不銹鋼篩網(wǎng)(300 Pm孔徑)過濾，轉(zhuǎn)移到 50ml的離心管中，以500g離心15分鐘。
[0144]離心樣品內(nèi)可見四個不同的分層:表面上小的(2mm厚)游離脂質(zhì)層，下面是白色 IOmm厚的脂肪細(xì)胞層，然后是大而澄清的主要包括DMEM的液體層，然后是脂肪來源的非脂肪細(xì)胞沉淀。用滴管小心地除去小的脂質(zhì)層。然后用新的滴管小心地穿過脂肪細(xì)胞取出澄清的DMEM而不干擾漂浮的脂肪細(xì)胞或細(xì)胞沉淀。這樣獲得了只包含漂浮的脂肪細(xì)胞和細(xì)胞沉淀的樣品。漂浮的脂肪細(xì)胞和細(xì)胞沉淀用滴管輕輕混合并轉(zhuǎn)移到一個15ml的離心管中。
[0145]然后將細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中洗滌以除去膠原酶。加入DMEM培養(yǎng)基至最終體積為 14ml并在500g離心樣品10分鐘。這導(dǎo)致了三個不同的分層:漂浮的脂肪細(xì)胞，DMEM和脂肪來源的非脂肪細(xì)胞沉淀。通過插入滴管穿過脂肪細(xì)胞小心地除去DMEM注意不要干擾脂肪細(xì)胞或細(xì)胞沉淀。
[0146]漂浮的和沉淀的細(xì)胞被重新輕輕懸浮在4ml的DMEM培養(yǎng)基中并用滴管混合。
[0147]實(shí)施例2來自脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的無細(xì)胞提取物的制備。
[0148]1Og犬脂肪組織樣品用剪刀完全剪碎，然后用5ml的DMEM混合。將自體犬血清過濾滅菌并將Iml的量加入到剪碎組織的混合物中。
[0149]在37°C將組織混合物不攪拌培養(yǎng)過夜。然后將樣品在1500g離心15分鐘，并將漂浮的脂肪細(xì)胞和組織層和脂肪組織來源的非脂肪細(xì)胞沉淀之間的液體小心地收集起來。無細(xì)胞提取物含有來自脂肪組織的分泌物。
[0150]實(shí)施例3來自脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的另一種無細(xì)胞提取物的制備。
[0151]從馬的尾基通過切除收集IOg脂肪組織樣品。用生理鹽水沖洗脂肪組織，然后用剪刀粗略地剪成直徑約5mm的小塊并且與20ml的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM， Sigma)混合。加入膠原酶(Sigma)，使終濃度為0.05%w/v并將樣品在37°C下孵育30分鐘，在30分鐘結(jié)束時脂肪組織被部分消化并由部分消化的脂肪顆粒，游離的基質(zhì)血管細(xì)胞 (SVC)和游離的脂肪細(xì)胞的混合物組成。[0152]然后樣品通過500g離心15分鐘被洗滌以除去膠原酶。離心樣品內(nèi)可見四個不同的分層:表面上小的(2mm厚)游離脂質(zhì)層，下面是白色I(xiàn)Omm厚的脂肪細(xì)胞層，然后是大而澄清的DMEM/膠原酶層，然后是脂肪來源的非脂肪細(xì)胞沉淀。用滴管小心地除去小的脂質(zhì)層。然后用新的吸管小心地穿過脂肪細(xì)胞取出澄清的DMEM而不干擾漂浮的脂肪細(xì)胞或細(xì)胞沉淀。這樣獲得了只包含漂浮的脂肪細(xì)胞和細(xì)胞沉淀的樣品。漂浮的脂肪細(xì)胞和細(xì)胞沉淀用滴管輕輕混合并轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中。
[0153]然后如下所述在DMEM中洗滌脂肪組織塊和細(xì)胞以除去膠原酶。加入DMEM培養(yǎng)基至最終體積為14ml并在500g離心樣品10分鐘。這導(dǎo)致了三個不同的分層:漂浮的脂肪組織塊和脂肪細(xì)胞，DMEM和脂肪來源的非脂肪細(xì)胞沉淀。通過將滴管插入穿過脂肪細(xì)胞小心地除去DMEM注意不要干擾脂肪組織，脂肪細(xì)胞或細(xì)胞沉淀。
[0154]組織i音養(yǎng)
[0155]將漂浮和沉淀的細(xì)胞重新輕輕懸浮于IOml的DMEM培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到300ml的組織培養(yǎng)瓶中。加入30ml體積的DMEM和IOml無菌的自體血清，然后于37°C，5%C02下孵育。 每天用顯微鏡檢查燒瓶。在第3和6天之間細(xì)胞變得貼壁并在且外觀為成纖維狀。
[0156]收獲無細(xì)胞的分泌物
[0157]6天之后收集上清液并通過20微米篩網(wǎng)過濾除去懸浮的脂肪組織和細(xì)胞。該溶液通過0.22微米的過濾器過濾滅菌然后在無菌條件下分裝到IOml的小瓶中并于_20°C下冷凍保存。
[0158]實(shí)施例4不含貼壁細(xì)胞的脂肪細(xì)胞和脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的混合物的制備。
[0159]如實(shí)施例1中所描述的制備4ml體積的脂肪細(xì)胞和脂肪來源的非脂肪細(xì)胞。加入 Iml體積的過濾滅菌的自體犬血清至細(xì)胞混合物中。
[0160]在組織培養(yǎng)瓶中將細(xì)胞混合物在37°C不攪拌培養(yǎng)過夜。使用倒置顯微鏡檢測樣品，觀察到細(xì)胞層貼附在該燒瓶的表面。也觀察到了未貼壁的細(xì)胞和漂浮的脂肪細(xì)胞。非貼壁細(xì)胞，包括脂肪細(xì)胞和脂肪來源的非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞被小心地傾倒并收集。這些細(xì)胞適于制備含有脂肪組織來源的分泌物的組合物。
[0161]實(shí)施例5脂肪細(xì)胞的懸浮液的制備。
[0162]從犬腹股溝通過切除收集IOg脂肪組織樣品。用生理鹽水沖洗脂肪組織，然后用剪刀完全剪碎并且與20ml的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)混合。加入膠原酶(Sigma)，使終濃度為0.05%v/v并將樣品在37°C下孵育90分鐘。每15分鐘用手將樣品輕輕上下顛倒。
[0163]然后將樣品通過不銹鋼篩網(wǎng)(300i!m孔徑大小)的無菌過濾，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，以500g離心15分鐘。
[0164]離心樣品內(nèi)可見四個不同的分層:表面上小的(2mm厚)游離脂質(zhì)層，下面是白色 IOmm厚的脂肪細(xì)胞層，然后是大而澄清的DMEM層，然后是脂肪來源的非脂肪細(xì)胞沉淀。用滴管小心地除去小的脂質(zhì)層。然后用新的吸管小心地穿過脂肪細(xì)胞取出澄清的DMEM而不干擾漂浮的脂肪細(xì)胞或細(xì)胞沉淀。這樣獲得了只包含漂浮的脂肪細(xì)胞和細(xì)胞沉淀的樣品。 漂浮的脂肪細(xì)胞和細(xì)胞沉淀用滴管輕輕混合并轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中。
[0165]然后將細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中洗滌以除去膠原酶。加入DMEM培養(yǎng)基至最終體積為 14ml并在500g離心樣品10分鐘。通過插入滴管穿過脂肪細(xì)胞小心地除去DMEM。[0166]含有脂肪細(xì)胞的漂浮的細(xì)胞被重新輕輕懸浮在4ml的DMEM培養(yǎng)基中。每一步驟暴露于脂肪組織或脂肪細(xì)胞的DMEM含有脂肪組織來源的細(xì)胞分泌物。
[0167]實(shí)施例6牛脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的制備
[0168]人，犬，家貓，雪豹，馬，大鼠和小鼠的脂肪組織均已被正常濃度(0.02%或0.05%) 的膠原酶消化。制備脂肪組織來源的細(xì)胞(剪碎和膠原酶消化法)的標(biāo)準(zhǔn)方法的使用，例如上述，當(dāng)應(yīng)用于牛組織時是不成功的。本發(fā)明人最初試圖用0.02%v/v膠原酶消化，此是可以成功地用于人，犬，馬脂肪組織的濃度。這沒有成功。引入了增加消化時間和搖晃消化混合物。這導(dǎo)致剪碎的組織形成了一個圓形的實(shí)心塊。膠原酶濃度增加至0.1%組織仍然沒有消化。令人驚訝的是，直到用濃度為0.25%v/v膠原酶消化該混合物兩小時該組織才會消化。
[0169]由于牛脂肪組織的隨時可得性，缺乏人畜共患疾病(特別是澳大利亞)，以及公眾對使用牛制品的接受，其是有吸引力的分泌物來源。出于類似的原因，本發(fā)明人認(rèn)為，豬脂肪組織也是本發(fā)明方法使用的一個有吸引力的來源。
[0170]實(shí)施例7牛脂肪組織的分泌物的制備
[0171]脂肪組織的制備
[0172]從兩歲公牛的尾基通過切除收集IOg脂肪組織樣品。用生理鹽水沖洗脂肪組織， 然后用剪刀完全剪碎并且與20ml的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)混合。 加入膠原酶(Sigma)使終濃度為0.25%[w/v]并將樣品在37°C下孵育120分鐘。
[0173]然后，將樣品在500g下離心15分鐘。離心樣品內(nèi)可見四個不同的分層:表面上小的(2_厚)游離脂質(zhì)層，下面是白色20_厚的脂肪細(xì)胞層，然后是大而澄清的DMEM層，然后是脂肪來源的非脂肪細(xì)胞沉淀。用滴管小心地除去小的脂質(zhì)層。然后用新的滴管小心地穿過脂肪細(xì)胞取出澄清的DMEM而不干擾漂浮的脂肪組織，脂肪細(xì)胞或細(xì)胞沉淀。這樣獲得了只包含懸浮在少量DMEM中的漂浮的脂肪組織塊和脂肪細(xì)胞和細(xì)胞沉淀的樣品。脂肪組織塊和脂肪細(xì)胞和細(xì)胞沉淀用滴管輕輕混合并轉(zhuǎn)移到一個15ml的離心管中。`
[0174]然后將脂肪組織和細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中洗滌以除去膠原酶。加入DMEM培養(yǎng)基至最終體積為14ml并在500g離心樣品10分鐘。這導(dǎo)致了三個不同的分層:漂浮的脂肪組織塊和脂肪細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基和脂肪組織來源的非脂肪細(xì)胞沉淀。DMEM用滴管小心地穿過脂肪細(xì)胞取出而不干擾脂肪組織塊，脂肪細(xì)胞或細(xì)胞沉淀。
[0175]組織培養(yǎng)
[0176]將漂浮和沉淀的細(xì)胞重新輕輕懸浮于IOml的DMEM培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到300ml的組織培養(yǎng)瓶中。加入30ml體積的DMEM和IOml無菌的自體血清，然后將培養(yǎng)瓶置于37°C， 5%0)2下培養(yǎng)。每天用顯微鏡檢查燒瓶。在第3和6天之間細(xì)胞變得貼壁并且外觀為成纖維狀。在第5和10天之間細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)。
[0177]收集含有細(xì)胞的分泌物的組合物
[0178]一旦細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部匯合即收集上清液并通過20微米篩網(wǎng)過濾除去懸浮脂肪組織和細(xì)胞。該溶液通過0.22微米的過濾器過濾滅菌，然后在無菌條件下分裝到IOml的小瓶中并于_20°C下冷凍保存。
[0179]實(shí)施例8:牛脂肪組織來源的濃縮分泌物的制備
[0180]牛脂肪組織被收集，處理，并置于如實(shí)施例7所述的組織培養(yǎng)瓶中。[0181]一旦貼壁細(xì)胞匯合組織培養(yǎng)瓶即被冷凍，然后在Telstar Lyobeta冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥2天。將所得的凍干餅用2.5ml的蒸餾水再水化。然后將濃縮的樣品通過HHO 柱(GE Lifesciences)來脫鹽從柱中洗脫。3.5ml體積。此小體積包含了濃縮的細(xì)胞因子混合物。
[0182]實(shí)施例9:來源于不含脂肪細(xì)胞的牛脂肪來源細(xì)胞的分泌物的制備
[0183]脂肪組織的制備
[0184]從兩歲公牛的尾基通過切除收集IOg脂肪組織樣品。用生理鹽水沖洗脂肪組織， 然后用剪刀完全剪碎并且與20ml的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)混合。 加入膠原酶(Sigma)使終濃度為0.25%[w/v]并將樣品在37°C下孵育120分鐘。
[0185]然后，將樣品在500g下離心15分鐘。離心樣品內(nèi)可見四個不同的分層:表面上小的(2_厚)游離脂質(zhì)層，下面是白色20_厚的脂肪細(xì)胞層，然后是大而澄清的DMEM層，然后是脂肪來源的非脂肪細(xì)胞沉淀。所有的液體和漂浮層被除去。
[0186]然后將脂肪組織和細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中洗滌以除去膠原酶。加入DMEM培養(yǎng)基至最終體積為14ml并在500g離心樣品10分鐘。然后傾倒出DMEM培養(yǎng)基。
[0187]組織培養(yǎng)
[0188]將沉淀的細(xì)胞輕輕重新懸浮于IOml的DMEM培養(yǎng)液中，并轉(zhuǎn)移到300ml的組織培養(yǎng)瓶中。加入30ml體積的DMEM和IOml無菌的自體血清，然后將培養(yǎng)瓶置于37°C，5%C02下培養(yǎng)。每天用顯微鏡檢查燒瓶。在第3和6天之間細(xì)胞變得貼壁并在且外觀為成纖維狀。 在第5和10天之間細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)。
[0189]收獲包括細(xì)胞分泌物的組合物
[0190]一旦細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部匯合即收集上清液并通過20微米篩網(wǎng)過濾除去細(xì)胞。該溶液通過0.22微米的過濾器過濾滅菌，然后在無菌條件下分裝到IOml的小瓶中 并于_20°C 下冷凍保存。
[0191]實(shí)施例10
[0192]除其他外，實(shí)施例1-9描述了脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液的制備，其中所述懸浮液可以或可以不包括脂肪細(xì)胞，以及包含脂肪組織來源的分泌物的無細(xì)胞提取物(例如， 實(shí)施例2)。在這些細(xì)胞懸浮液的制備過程中，方法可包括脂肪組織，其可以或可以不被部分地或完全地消化，暴露于液體，通常是實(shí)施例中的DMEM培養(yǎng)液。在暴露期間，包括脂肪細(xì)胞的脂肪組織來源的細(xì)胞向液體中分泌細(xì)胞因子。在制備脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液過程中，液相例如DMEM培養(yǎng)基可以被描述為含有脂肪組織來源的分泌物的組合物。
[0193]實(shí)施例1-9中所述的脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，可進(jìn)一步在含有脂肪組織來源的分泌物的組合物的制備中應(yīng)用，如本文所描述的方法。例如，脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液可以暴露于合適的培養(yǎng)基并且收集培養(yǎng)基，或細(xì)胞懸浮液被裂解并且收集培養(yǎng)基，或者細(xì)胞懸浮液可以在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)并收集培養(yǎng)基，或者細(xì)胞懸浮液可以在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)并進(jìn)行冷凍干燥然后在所要求的量的合適的液體中再水化。在包含脂肪組織來源的分泌物的組合物的制備中利用脂肪組織來源的細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液的這些方法的多種實(shí)施例在本文中有描述。
[0194]實(shí)施例10:加速犬的毛發(fā)生長
[0195]脂肪組織來源的分泌物對犬類的給藥導(dǎo)致在動物中毛發(fā)再生的加速。兩只相關(guān)的羅德西亞背脊犬在其肩膀上具有剃除的區(qū)域。一只狗具有如實(shí)施例7中描述制備的牛來源的分泌物對左側(cè)的區(qū)域局部使用，每天兩次，而右側(cè)區(qū)域沒有接受處理。另一只狗具有剃除區(qū)域而沒有接受處理。定期對區(qū)域攝像。兩個星期后，處理的區(qū)域已經(jīng)再生為原毛發(fā)的 75%(圖1左圖)。同一只狗的未經(jīng)處理的區(qū)域再生為約20%(圖1右圖)。未經(jīng)處理的狗的區(qū)域再生5% (圖中未顯示)。
[0196]實(shí)施例11:人的皮膚病況的處理
[0197]根據(jù)實(shí)施例7中所述方法制備牛脂肪組織的分泌物。分泌物與等量的水基乳膏BP 混合并分裝到塑料小瓶中在4°C下保存直至使用。向人群提供小瓶乳膏用于局部應(yīng)用范圍的試驗(yàn)。以下的說明舉例說明了各種患者使用組合物的方式，所治療的病癥和結(jié)果，由患者所描述。
[0198](i)患者 I
[0199]感謝試用乳膏的機(jī)會。我在兩個區(qū)域涂敷了乳膏。
[0200]1.面部疤痕_(兩年疤痕)
[0201]2?跖疣_(至少5年)
[0202]1.面部疤痕
[0203]試驗(yàn)開始:2010年11月
[0204]我每天直接將乳膏涂在疤痕上。
[0205]第一周-沒有明顯的改善。
[0206]第二周-疤痕看起來更平滑。
[0207]第三周-繼續(xù)看上去更平滑/輕微變淡。
[0208]第四周-至2011年I月-沒有進(jìn)一步改善。
[0209]2.跖疣
[0210]試驗(yàn)開始:2010年11月
[0211]我晚間直接將乳膏涂在跖疣上。
[0212]第一至四周-沒有明顯的改善。
[0213]第四周-疣的外觀有明顯的變化。
[0214]第四周至11年I月-每日改善-導(dǎo)致疣體完全消失。
[0215](ii)患者 2
[0216]我在我的胳膊上的手術(shù)疤痕上試用乳膏。將它涂敷在一半的疤痕上每天兩次約3 周，在疤痕的愈合上可觀察到與未經(jīng)治療的一半相比的差異。
[0217]被處理的一半疤痕顯示出比未經(jīng)處理的部分的深紅色更淺更一致的顏色。在處理幾天后觀察到了變化。
[0218](iii)患者 3
[0219]牛分泌物乳膏對曬傷有快速而積極的效果。
[0220]曬傷為中度(顯著的皮膚發(fā)紅和疼痛)，位于面部，前臂和小腿。在陽光下暴露后晚上將乳膏涂于面部和前臂兩次(陽光照射后約1.5小時和5小時)。在即將睡覺之前第二次涂敷乳膏。用水洗滌皮膚，但沒有使用任何肥皂或非皂類清潔劑。
[0221]沒有任何形式的乳膏涂敷于曬傷的小腿皮膚。
[0222]燒傷的手臂和面部在首次涂敷2小時后明顯痛苦減輕。在下一個早晨(涂敷兩次后)面部和胳膊幾乎無疼痛。在40oC淋浴時手臂和面部有一點(diǎn)疼痛，然而，未處理的小腿相當(dāng)疼痛。
[0223]早晨在面部和手臂第三次應(yīng)用乳膏(日曬后約16小時)。疼痛消失并且發(fā)紅顯著降低。未經(jīng)處理的小腿皮膚還是紅/粉紅色并疼痛。
[0224](iv)患者 4
[0225]這里是我的乳膏體驗(yàn):
[0226]主要觀察結(jié)果:我的妻子和我將乳膏涂于蚊蟲叮咬處，約10分鐘內(nèi)瘙癢消失。同一天涂敷乳膏兩次以上則在一天之內(nèi)叮咬消失。我已經(jīng)試了三次而我的妻子試了一次。其他未經(jīng)處理的蚊蟲叮咬處瘙癢若干天。
[0227](V)患者 5
[0228]我將乳膏涂于蚊蟲叮咬處約10分鐘內(nèi)瘙癢消失。第二次涂敷乳膏后叮咬處痊愈沒有進(jìn)一步瘙癢。在同一時間，我用l%Dermaid霜處理其他蚊蟲叮咬處并觀察到Dermaid 霜效果并不像牛的分泌物乳膏那么明顯。
[0229](vi)患者 6
[0230]我是一名50歲的婦女并且每天我將乳膏涂在面部。4周后我的皺紋變得不太明顯。6周后人們開始評論我的外表。
[0231](vii)患者 7
[0232]牛細(xì)胞的分泌物乳膏被給予一位具有足癬的患者自我涂敷一段時間。治療的患者的報告如下:
[0233]我使用了牛細(xì)胞的分泌物乳膏來治療我的左腳小腳趾之間的足癬。足癬是鱗片狀的皮膚并且一直超過12個月無法愈合。最近我還沒有治療這種狀態(tài)。我每天晚上用乳膏涂擦患處約一星期。經(jīng)過約一個星期我停止使用該乳膏后，我注意到鱗片狀皮膚似乎不太明顯和發(fā)癢。再經(jīng)過一·周(沒有進(jìn)一步應(yīng)用乳膏)，瘙癢和脫皮的皮膚已經(jīng)消失并且6個月以上沒有復(fù)發(fā)。
[0234](viii)患者 8
[0235]對于我13歲女兒的曬傷，她被曬傷尤其是她的胸部和肩部周圍發(fā)紅。我認(rèn)為這相當(dāng)嚴(yán)重并且皮膚會十分迅速剝離。那天晚上，我涂了牛細(xì)胞分泌物乳膏。在早晨發(fā)紅減少， 那個早晨我再次涂敷了乳膏。在24小時內(nèi)發(fā)紅已經(jīng)明顯減少，皮膚沒有任何明顯的起泡或剝離。我認(rèn)為我們再次使用了乳膏。沒有負(fù)面作用。
[0236]實(shí)施例12:治療痤瘡
[0237]這個例子演示了牛脂肪組織來源的分泌物在治療痤瘡中的療效。
[0238]方法:
[0239]如實(shí)施例7中詳細(xì)描述，制備了牛脂肪組織來源的分泌物(以下簡稱“CellFree”) 生產(chǎn)的一個批次(批號# CFB-3A)。此CellFree過濾滅菌然后在BTF在T175組織培養(yǎng)瓶內(nèi)冷凍干燥。將100ml的CFB-3A放置在2個T175中，然后每個培養(yǎng)瓶再用IOml無菌水重建。然后10倍濃縮液通過roio柱子過濾，如下所示:
[0240]1.從roio頂部傾倒疊氮化鈉
[0241]2.切斷F1DlO底部的滴落(tip off)
[0242]3.向roiO頂部加入20ml的PBS允許其排水[0243]4.向 PDlO 頂部添加 2.5ml 濃縮 CellFree
[0244]5.允許所有的液體通過在roiO頂部的玻璃珠
[0245]6.添加3.5ml的PBS并在TOlO底端放置收集管來收集脫鹽濃縮的CellFree。
[0246]總共收集27ml的脫鹽濃縮CellFree并加至54克水基乳膏BP (Kenkay Batch29A01exp05/13)。
[0247]進(jìn)行批次測試。6名人類志愿者在他們的胳膊上施加200 U I乳膏并在上面放置了創(chuàng)可貼。將其保持在適當(dāng)位置約8小時。目前還沒有乳膏的不利影響的報告。
[0248]乳膏在從藥店購買的透明塑料小瓶里被分為7X 10克。
[0249]收到參與試驗(yàn)的個人(此處簡稱為人類志愿者(HV) # 1- # 7)的知情同意書后， 每人完成了 TF-002痤瘡試驗(yàn)表格，生產(chǎn)的7瓶乳膏每瓶被提供給試驗(yàn)中的每個個體。
[0250]根據(jù)TF-002痤瘡試驗(yàn)協(xié)議個人分別被給予以下說明:
[0251]這是一個21天的試用期，您需要每日填寫提供的試驗(yàn)記錄表。[0252]第1-7天不涂敷乳膏。
[0253]第8-21天您需要涂敷乳膏，每天兩次。
[0254]-在整個21天中請繼續(xù)與您當(dāng)前的日常皮膚治療。
[0255]-每天一次給你的皮膚打分，使用以下的1-6分級。
[0256]-記錄使用痤瘡乳膏時與你的皮膚有關(guān)的任何其他觀察，以下包括潛在因素列表。
[0257]-請使用反面表格給你的皮膚打分。
[0258]-請每天在大致相同的時間記錄你的分?jǐn)?shù)。
[0259]-使用此表格結(jié)束時提供的線，請注意您的當(dāng)前皮膚的日常護(hù)理。例如清潔，處方藥或者來自藥房或超市治療。
[0260]1-6痤瘡等級
[0261]1.清潔，顯示無炎性病變(紅疙瘡，白色或黃色的‘?dāng)D壓’的點(diǎn))或非炎癥性病變 (黑頭或白頭)。
[0262]2.一些零星的黑頭和白頭以及你的皮膚油膩。
[0263]3.在四分之一的面部具有30-40個紅色的小突起，黑頭和白頭。
[0264]4.在一半面部具有紅色的小突起，黑頭和淺表的白色或黃色的“擠壓”點(diǎn)。
[0265]5.四分之三的面部有許多黑頭和白色或黃色的“擠壓”點(diǎn)。
[0266]6.大部分面部受到大的紅色發(fā)炎腫塊或黑頭，白頭或白色或黃色的“擠壓”點(diǎn)影響。
[0267]觀察注意事項(xiàng)
[0268]1.發(fā)紅
[0269]2.瘙癢
[0270]3.皮膚變得堅(jiān)硬
[0271]4.皮膚變得光滑
[0272]5.皮膚變得柔軟
[0273]6.涂敷時有刺痛感
[0274]7.褪色
[0275]8.沒有變化[0276]結(jié)果:
[0277]
【權(quán)利要求】
1.含有脂肪組織來源的分泌物的組合物在制備用于局部治療個體中非炎癥性病癥的藥物中的用途。
2.脂肪組織來源的分泌物在制備用于局部使用以刺激個體中毛發(fā)，毛皮或軟毛生長的藥物中的用途。
3.含有脂肪組織來源的分泌物的組合物在制備用于局部治療或預(yù)防個體中痤瘡的藥物中的用途。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述脂肪組織來源的分泌物來源于牛或豬。
5.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述含有脂肪組織來源的分泌物的組合物還包含脂肪細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述非炎性病癥與所述個體中一種或多種下述病況有關(guān):(i)皮膚干燥，(?)皮膚瘙癢，(iii)昆蟲叮咬，(iv)曬傷，(v)皮膚皺紋，(vi)皮膚過薄，(vii)皮膚開裂，(viii)昆蟲蜇傷，(ix)癥痕，(x)萎縮紋，(xi)曬斑，(xii)老年斑(Xiii)黃褐斑，(XiV)眼睛周圍的浮腫和/或黑眼圈，(XV)足癬，(xvi)疣，并且所述治療緩解一種或多種所述病況。
7.如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述個體具有一種或多種:(i)手術(shù)引起的脫發(fā)，(?)化療相關(guān)的脫發(fā)，(iii)輻射暴露相關(guān)的脫發(fā)，(iv)脫發(fā)癥，(V )男性型禿頂，(Vi)女性型禿頂。
8.如權(quán)利要求3所述的用途，其中所述個體是青少年。
9.治療個體中非炎癥性病癥的方法，所述方法包括向所述個體局部給予藥物組合物，所述藥物組合物包含脂肪組織來源的分泌物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
10.刺激個體中毛發(fā)、軟毛或毛皮生長的方法，所述方法包括向所述個體局部給予藥物組合物，所述藥物組合物包含脂肪組織來源的分泌物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
11.治療或預(yù)防個體中痤瘡的方法，所述方法包括向所述個體局部給予藥物組合物，所述藥物組合物包含脂肪組織來源的分泌物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述個體是青少年。
13.如根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述個體具有臨床相關(guān)性痤瘡。
14.如權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂肪組織來源的分泌物來源于?；蜇i。
15.如權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述包含脂肪組織來源分泌物的組合物還包含脂肪細(xì)胞。
16.制備牛脂肪組織來源的分泌物的方法，所述方法包括: (i)將牛脂肪組織樣品暴露于蛋白水解酶的溶液，以產(chǎn)生細(xì)胞懸浮液； (?)離心所述細(xì)胞懸浮液，以形成細(xì)胞沉淀、位于包括脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層上方的游離脂質(zhì)層、和位于細(xì)胞沉淀與漂浮細(xì)胞層之間的中間層，與所述細(xì)胞沉淀和所述漂浮細(xì)胞層相比，所述中間層的細(xì)胞較少；并且 (iii)除去游離脂質(zhì)層和中間層； (iv)任選地除去部分或基本所有的包含脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層； (v)混合細(xì)胞沉淀與，如果存在的話，包含脂肪細(xì)胞的漂浮細(xì)胞層，以形成脂肪組織來源的細(xì)胞懸浮液，所述細(xì)胞懸浮液可以包括或不包括脂肪細(xì)胞； (Vi)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)所述細(xì)胞懸浮液； (Vii)收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液以形成含有牛脂肪組織來源的分泌物的組合物。
17.如權(quán)利要求16的方法，其中所述蛋白水解酶溶液含有最終濃度為約0.25%w/v的膠原酶。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液包含培養(yǎng)(i)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物，或(?)培養(yǎng)旋動培養(yǎng)物。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中收集的上清液包含脂肪細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物為融合細(xì)胞培養(yǎng)物。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其還包括冷凍干燥所述牛脂肪組織來源的分泌物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其還包括再水化所述冷凍干燥的材料。
【文檔編號】A61P17/12GK103596577SQ201280022199
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月15日
【發(fā)明者】格雷厄姆·維賽, 麗貝卡·安妮·韋伯斯特 申請人:賽爾愛迪爾私人有限公司