應(yīng)用于胃腸疾病的兩歧雙歧桿菌菌株的制作方法

應(yīng)用于胃腸疾病的兩歧雙歧桿菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，其顯示每mm2上皮細(xì)胞單層至少約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附，或具有至少1.5的粘附指數(shù)，以及一種兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，其為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體，其作為益生菌用于食品中和／或用作藥物。進(jìn)一步提供一種包含任何上述菌株、突變體或變異體的益生菌制劑，所述益生菌制劑、菌株、突變體和變異體的用途，及所述益生菌制劑的生產(chǎn)方法。
【專利說明】應(yīng)用于胃腸疾病的兩歧雙歧桿菌菌株
[0001]說明書
[0002]迄今為止，與胃腸道功能紊亂相關(guān)和/或與不希望的胃腸炎性活性相關(guān)的疾病是廣泛流行的常見疾病。兩組疾病的特征在于腹痛、不適、腹脹、氣脹、腹瀉、便秘、消化障礙、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感和/或其組合，從而導(dǎo)致患病者的整體健康顯著下降。特別是，對于腸易激綜合征(IBS)，仍然缺乏有效的治療(Brenner和Chey，2009)。幾種用于IBS的藥物由于對健康的不利影響已被撤回或受到限制。此外，目前的療法主要是針對單一癥狀而不是在整體上緩解IBS和改善生活質(zhì)量(QoL)。
[0003]普遍認(rèn)為，與胃腸道功能紊亂相關(guān)的疾病，如IBS或炎性腸病，伴隨有(i)腸道菌群失衡(Kassinen等人,2007)和/或(ii)胃腸道的腸屏障功能障礙(Marshall等,2004)。據(jù)認(rèn)為這導(dǎo)致胃腸道中益生菌如雙歧桿菌(Bifidobacteria)的減少。另外，據(jù)信功能障礙的腸屏障導(dǎo)致不希望的兼性病原性細(xì)菌進(jìn)入粘膜，這隨后可導(dǎo)致胃腸炎性活性。最近的研究提出，這種炎癥引發(fā)典型的IBS癥狀，如腸的疼痛、運(yùn)動及功能紊亂。
[0004]腸道菌群失衡的特征主要在于人類來源的非致病微生物如雙歧桿菌的數(shù)目減少，而兼性致病微生物如腸桿菌(Enterobacteria)的數(shù)目增加(Jian-Min等人,2004)。據(jù)認(rèn)為這種失衡導(dǎo)致受影響者的氣態(tài)化合物和短鏈脂肪酸的產(chǎn)生增加、運(yùn)動性障礙、胃腸脹氣及疼痛。因此，為使腸道菌群恢復(fù)平衡，益生菌成為焦點(diǎn)。據(jù)推測，益生菌借助于競爭性抑制對免疫功能具有有益的影響，并且可能通過改善腸微生物平衡而有利地影響宿主。包含非致病性人類來源的益生菌的“益生菌劑”已被定義為在以一定的數(shù)目攝取時(shí)發(fā)揮超出固有的基本營養(yǎng)的健康效應(yīng)的活微生物食品和藥物。各種微生物的混合物，特別是乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)的種，在傳統(tǒng)上用于發(fā)酵的乳制品或藥物以促進(jìn)健康。
[0005]已經(jīng)對該問題進(jìn)行了許多研究，但是，由于腸道菌群失衡只是事情的一個(gè)方面，大多數(shù)只是致力于向胃腸道遞送益生菌劑的療法未成功地用于緩解患有胃腸道功能障礙的患者的所有癥狀是毫不奇怪的。例如，IBS根據(jù)Rome III標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，該標(biāo)準(zhǔn)基本上是:在具有至少開始于6個(gè)月前的癥狀的最后三個(gè)月期間，每個(gè)月至少3天腹痛或不適，并結(jié)合至少兩個(gè)以下標(biāo)準(zhǔn):(a)通過排便緩解，(b)開始時(shí)伴有大便頻率改變，或(c)大便稠度改變，并常伴有氣脹或腹脹及排便困難，即便秘和/或腹瀉。伴隨著這些癥狀，患者可能遭受社會功能和個(gè)人功能的損害和生活質(zhì)量下降。然而，即使諸如疼痛/不適、腹脹/氣脹、急迫等癥狀大部分消除，患者與整體健康相關(guān)的生活質(zhì)量(QoL)的改善也是非常希望的。迄今為止，所提供的治療，包括益生菌劑等等，均不能同時(shí)改善疼痛/不適、腹脹/氣脹和消化失調(diào)等癥狀以及改善生活質(zhì)量。
[0006]在這方面，必須考慮胃腸道功能紊亂發(fā)展的第二個(gè)重要方面，這涉及到胃腸道的腸屏障功能障礙，其特征在于其通透性的增加。在這方面的一個(gè)非常流行的理論是，腸和全身免疫系統(tǒng)兩者的擾動使得致病微生物-在腸道菌群失衡的情況下其可能占主導(dǎo)地位-通過屏障并穿透粘膜，從而引起炎癥反應(yīng)。基于這一假設(shè)，已經(jīng)進(jìn)行了幾項(xiàng)研究，它們集中于治療和減輕炎癥反應(yīng)及其對胃腸道的影響。例如，EP1141235描述了應(yīng)用于營養(yǎng)補(bǔ)充劑和藥物中的嬰兒長雙歧桿菌(B.1nfantis)菌株UCC35624，其通過降低IL-8水平(Whorwell等人，2006)和使IL-1O / IL-12比率標(biāo)準(zhǔn)化(O' Mahony等人，2005)而顯示出在宿主中刺激抗炎性反應(yīng)的強(qiáng)烈能力。據(jù)稱這種能力可能是嬰兒長雙歧桿菌菌株UCC35624具有對IBS和炎性腸病的癥狀的效果的主要原因。然而，不同的來源對嬰兒長雙歧桿菌的效果是否能歸因于直接的抗炎性質(zhì)提出了質(zhì)疑。此外，雖然唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)在體外和在小鼠模型中也顯示出強(qiáng)抗炎效應(yīng)-與嬰兒長雙歧桿菌相當(dāng)，但是它并沒有在減輕IBS及其癥狀方面顯示出顯著的效果。
[0007]最重要的是，益生菌劑的功效是強(qiáng)菌株特異性的，且只有特定的菌株才可能會改善IBS及其癥狀。迄今為止，幾項(xiàng)研究已經(jīng)檢驗(yàn)了益生菌劑對與胃腸道功能紊亂相關(guān)的疾病如 IBS 的癥狀的效果(O' Mahony 等人，2005，Kajander 等人，2005, Williams 等人，2008，Guyonnet等人，2007)。然而，只有少數(shù)可以顯示出顯著的益處。此外，沒有益生菌菌株顯示出對腸易激綜合征的癥狀具有顯著減輕的效果且同時(shí)改善生活質(zhì)量。這些發(fā)現(xiàn)可歸因于以下事實(shí):益生菌劑的功效是強(qiáng)菌株特異性的。廣泛接受的是，一種益生菌菌株的性質(zhì)不能被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)菌株(Brenner和Chey, 2009)。因此,重要的是認(rèn)識到單一益生菌菌株的功效和效應(yīng)是無法預(yù)測的，這強(qiáng)調(diào)了測試和證實(shí)單一菌株的功效的重要性。為此目的，在實(shí)驗(yàn)部分描述了其方法。
[0008]以前從未有益生菌研究對于諸如IBS的疾病顯示出上述癥狀(疼痛/腹脹/氣脹/急迫/消化障礙)的減輕及患者生活質(zhì)量的同時(shí)改善。因此，非常需要能改善患有胃腸道功能紊亂的患者的疼痛/不適、腹脹/氣脹、急迫和消化障礙等癥狀及總體生活質(zhì)量的療法，其考慮到使腸道菌群恢復(fù)平衡，并且腸壁的功能性也得到恢復(fù)。
[0009]因此，本發(fā)明提供了一種作為益生菌用于食品中和/或用作藥物的兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)菌株或其突變體或變異體，其顯示至少每mm2上皮細(xì)胞單層約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附，或具有至少1.5的粘附指數(shù)，以及作為益生菌用于食品中和/或用作藥物的兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)菌株或其突變體或變異體，其為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75或其突變體或變異體，其不僅顯示對胃腸疾病，特別是IBS，的腹痛/不適、腹脹/氣脹、急迫和/或消化障礙等癥狀的顯著改善，而且同時(shí)導(dǎo)致患者生活質(zhì)量的顯著提高。進(jìn)一步提供了益生菌制劑及該菌株和益生菌制劑的用途。采用本發(fā)明的菌株，如顯示至少每mm2上皮細(xì)胞單層約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有至少1.5的粘附指數(shù)的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，或作為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，所導(dǎo)致的總體IBS的減輕以及疼痛/不適、腹脹/氣脹、急迫和/或消化障礙等單一癥狀的改善，及同時(shí)的QoL改善，是意料之外的結(jié)果，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)中已知并公認(rèn)的是益生菌的有效性是高度菌株特異性的，并且甚至一種雙歧桿菌菌株物種的密切相關(guān)的成員通常不具有相當(dāng)?shù)男再|(zhì)，或者甚至對于胃腸疾病是無效的(Brenner和Chey, 2009)。不打算被一種理論所束縛,本發(fā)明人認(rèn)為，本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌菌株、特別是兩歧雙歧桿菌MMBb75的優(yōu)異及意料之外的效果是由于其阻止致病菌通過胃腸道的腸屏障及穿透粘膜的能力而獲得的。假設(shè)腸屏障的功能障礙是由于致病微生物可通過其進(jìn)入粘膜的腸壁中的“洞”或削弱的部分，則本發(fā)明人認(rèn)為，非致病性細(xì)胞對腸壁的粘附減少了屏障的通透性，從而以“堵洞”的作用模式改善腸壁。這樣，本發(fā)明的菌株和益生菌制劑對胃腸道菌群和健康具有雙重的積極效果，因?yàn)椴粌H粘膜的炎癥反應(yīng)得到阻止，而且腸道菌群也恢復(fù)平衡。另外，非常重要的是，癥狀或疾病本身的減輕在清除期(washout phase)也得到保持，即治療結(jié)束后的階段，其中，例如不對受試者或患者施用進(jìn)一步的本發(fā)明菌株、其突變體或變異體或包含本發(fā)明菌株、其突變體或變異體的益生菌制劑。在本發(fā)明的菌株、其突變體或變異體的情況下，如在下文所詳細(xì)解釋的，以及也在實(shí)施例和附圖部分所描述的，本發(fā)明的菌株、其突變體或變異體對于總體IBS癥狀、腹痛/不適、腹脹/氣脹和消化障礙的積極效果在清除期得到保持。
[0010]因此，本發(fā)明提供了一種作為益生菌用于食品中和/或用作藥物的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，該菌株或其突變體或變異體顯示至少每_2上皮細(xì)胞單層約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附，或者具有至少1.5的粘附指數(shù)。優(yōu)選地，所述菌株是在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75，或其突變體或變異體。此外，也提供了作為益生菌用于食品中和/或用作藥物的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，該菌株是在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75，或其突變體或變異體。所述菌株、突變體或變異體尤其作/為益生菌用于食品中和/或用作藥物以用于預(yù)防和/或治療與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎性活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少和/或胃腸道的腸屏障功能障礙相關(guān)的疾病，和/或用于減輕、預(yù)防和/或治療患有腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化障礙、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感、總體IBS癥狀和/或其組合的受試者,或用于改善患者的生活質(zhì)量。該菌株、突變體或變異體作為益生菌用于食品中和/或用作藥物以用于減輕、預(yù)防和/或治療患有腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化障礙、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感、總體IBS癥狀和/或其組合的受試者的可用性可以使用7點(diǎn)利克特量表來評估，該量表常用于臨床研究中，并將在下文進(jìn)一步描述?；颊叩纳钯|(zhì)量(QoL)可以使用標(biāo)準(zhǔn)SF-12調(diào)查問卷來評估，該調(diào)查問卷也是本領(lǐng)域技術(shù)人員在臨床研究中常用的，并且是公認(rèn)的測量QoL的標(biāo)準(zhǔn)。而且，對于總體IBS癥狀、腹痛/不適、腹脹/氣脹，如在下文所詳細(xì)解釋的，以及也在實(shí)施例和附圖部分所描述的，本發(fā)明的菌株、突變體或變異體的積極效果在清除期得到保持。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病是選自下組的成員:腸易激運(yùn)動、炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、儲袋炎或感染后結(jié)腸炎、胃腸癌、全身性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、由于不希望的炎性活性引起的自身免疫性障礙、由于不希望的炎性活性引起的腹瀉病如艱難梭菌(Clostridium difficile)相關(guān)腹瀉、抗生素相關(guān)腹瀉、輪狀病毒相關(guān)腹瀉或感染后腹瀉，及其組合，優(yōu)選地，該疾病是腸易激運(yùn)動。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的菌株、突變體或變異體是遺傳修飾的突變體，或者該菌株、突變體或變異體是天然存在的變異體。在替代實(shí)施方案中，該菌株、突變體或變異體的細(xì)胞是存活的或非存活的。非存活細(xì)胞產(chǎn)品的制備較簡單，可以很容易地將細(xì)胞引入到藥品中，且存儲要求的限制比存活細(xì)胞的情況要少得多?？梢酝ㄟ^熱或通過暴露于改變的PH值或經(jīng)受壓力而殺死細(xì)胞。然而，存活細(xì)胞能夠棲息于患有如本文所述的疾病或癥狀的受試者的胃腸系統(tǒng)，因此在緩解、預(yù)防和/或治療患有這樣的疾病或癥狀的受試者方面具有較好的功效。
[0013]本發(fā)明還提供一種益生菌制劑，其包含作為益生菌用于食品中和/或用作藥物的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，該菌株或其突變體或變異體顯示至少每_2上皮細(xì)胞單層約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附，或者具有至少1.5的粘附指數(shù)，如在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75，或其突變體或變異體。優(yōu)選地，該益生菌制劑作為益生菌用于食品中和/或用作藥物。
[0014]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，益生菌制劑進(jìn)一步包含至少一種益生素(prebiotic)。優(yōu)選地，該益生素是菊粉或果糖寡糖。
[0015]在任何上述實(shí)施方案中，益生菌制劑進(jìn)一步包含至少一種藥學(xué)上可接受的化合物、可攝取的載體、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物和/或蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和/或微量元素；任選地，所述至少一種藥學(xué)上可接受的化合物是選自一種或多種維生素如B族維生素、一種或多種礦物質(zhì)如鈣或鎂、一種或多種碳水化合物如乳糖、麥芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麥芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物的成員。優(yōu)選地，可攝取的載體是膠囊、片劑、粉末或食物產(chǎn)品；任選地，該食物產(chǎn)品是乳制品、酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、酸奶產(chǎn)品如發(fā)酵酸奶飲料、飲用酸奶、乳酪、發(fā)酵奶油、乳基甜品發(fā)酵乳或人化乳(humanized milk)、奶粉、濃縮乳、涂抹干酪、調(diào)料、飲料等等。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，益生菌制劑進(jìn)一步包含蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和/或微量元素。
[0017]在任何上述實(shí)施方案中，所述菌株、突變體或變異體可以以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO1Cfu,任選地每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品不少于
102、103、IO4UO5或IO6菌落形成單位(Cfu)存在于益生菌制劑中，優(yōu)選地，該菌株、其突變體或變異體以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO7Cfu存在，更優(yōu)選地，該菌株、突變體或變異體以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO8Cfu存在，甚至更優(yōu)選地，該菌株、突變體或變異體以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO9Cfu或超過IOltlCfu存在。一“單位粉末”是指一定量的粉末，其包含超過IO1Cfu,任選地不少于102、
103、IO4>IO5或IO6菌落形成單位(Cfu),優(yōu)選超過IO7Cfu,更優(yōu)選超過108cfu,甚至更優(yōu)選超過IO9Cfu或超過10lclcfu。因此,一單位粉末表示包含患者的標(biāo)準(zhǔn)日劑量的量,然而，由于幾個(gè)原因，并且以下面描述的幾種方式，日劑量可以增加或減少。一單位粉末的典型量(按重量)應(yīng)當(dāng)是容易攝取和消化的，范圍從毫克到數(shù)克，例如，5g、10g、15g或更多。一單位粉末也可以與此處提及的任何食物產(chǎn)品混合，并且也可與本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的另一食物產(chǎn)品混合。因此，每一粉末量(按重量)的cfu量可以比被認(rèn)為容易攝取和消化的粉末量的標(biāo)準(zhǔn)日劑量高得多。在此，粉末將必須用如上所述的益生菌制劑中允許的其它組分來稀釋。一“單位食物產(chǎn)品”或“食物產(chǎn)品”通常表示典型的量(按重量或體積)(其被視為用作可攝取載體的特定食物產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)或典型量)，作為待食用或飲用的消費(fèi)部分而提出的典型量，包裝單位或相當(dāng)?shù)牧?。因此一“單位可攝取載體”表示片劑、膠囊、栓劑或相當(dāng)?shù)?，或一單位粉末或單位食物產(chǎn)品，其表示典型的量(按重量或體積)(其被視為用作可攝取載體的特定食物產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)或典型量)，作為待食用或飲用的消費(fèi)部分而提出的典型量，包裝單位或相當(dāng)?shù)摹?br> [0018]在任何上述實(shí)施方案中，在益生菌制劑中向患者施用的菌株、突變體或變異體的每日量不小于每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品IO1Cfu,任選地不小于102、103、
104、IO5或106cfu,優(yōu)選不小于107cfu,更優(yōu)選不小于108cfu,甚至更優(yōu)選不小于IO9Cfu或不小于 IO10CfUo[0019]根據(jù)任何上述實(shí)施方案的益生菌制劑是有用的，并提供作為益生菌用于食品中和/或用作藥物以用于預(yù)防和/或治療與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎性活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少和/或胃腸道的腸屏障功能障礙相關(guān)的疾病，和/或用于減輕、預(yù)防和/或治療患有腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化失調(diào)、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感、總體IBS癥狀和/或其組合的受試者的用途。任選地，該疾病是選自下組的成員:腸易激運(yùn)動、炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、儲袋炎或感染后結(jié)腸炎、胃腸癌、全身性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、由于不希望的炎性活性引起的自身免疫性障礙、由于不希望的炎性活性引起的腹瀉病如艱難梭菌相關(guān)腹瀉、抗生素相關(guān)腹瀉、輪狀病毒相關(guān)腹瀉或感染后腹瀉，及其組合。優(yōu)選地，該疾病是腸易激運(yùn)動。
[0020]本發(fā)明還提供本發(fā)明的菌株、突變體或變異體和本發(fā)明的益生菌制劑作為益生菌用于食品中和/或用作藥物以用于預(yù)防和/或治療與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎癥活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少和/或胃腸道的腸屏障功能障礙相關(guān)的疾病，和/或用于減輕、預(yù)防和/或治療患有腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化失調(diào)、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感和/或其組合的受試者的用途。任選地，該疾病是選自下組的成員:腸易激運(yùn)動、炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、儲袋炎或感染后結(jié)腸炎、胃腸癌、全身性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、由于不希望的炎性活性引起的自身免疫病、由于不希望的炎性活性引起的腹瀉病如艱難梭菌相關(guān)腹瀉、抗生素相關(guān)腹瀉、輪狀病毒相關(guān)腹瀉或感染后腹瀉，及其組合。
[0021]還提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的益生菌制劑的方法，其至少包括以下步驟:
[0022]a)在富含蛋白質(zhì)的液體生長培養(yǎng)基中發(fā)酵和/或生長本發(fā)明的菌株或突變體或變異體，優(yōu)選地顯示至少每mm2上皮細(xì)胞單層約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有至少1.5的粘附指數(shù)的菌株或其突變體或變異體，或在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75菌株，或其突變體或變異體，
[0023]b)通過細(xì)胞的離心、穩(wěn)定化、冷凍干燥、研磨和過篩來收獲細(xì)胞，
[0024]c)任選地混合/摻混細(xì)胞與益生素、藥學(xué)上可接受的化合物、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物、蛋白質(zhì)和/或肽中的一個(gè)或多個(gè)成員，和
[0025]d)將步驟b)的細(xì)胞或步驟c)的混合物引入可攝取的載體中。
[0026]作為益生菌用于食品中和/或用作藥物的、顯示至少每mm2上皮細(xì)胞單層約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有至少1.5的粘附指數(shù)的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，如在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體，以及作為益生菌用于食品中和/或用作藥物的、作為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體(這兩種菌株被稱為本發(fā)明的“菌株”或“細(xì)胞”)，屬于雙歧桿菌屬，它們是革蘭氏陽性的、非運(yùn)動性的、通常分枝的厭氧細(xì)菌，一般存在于胃腸道和陰道中。它們通常從健康嬰兒和成人的糞便中分離。如果提到菌株，也指該菌株的細(xì)胞。雙歧桿菌已被描述為幫助消化，與較低的變態(tài)反應(yīng)發(fā)生率相關(guān)，并且也可在防止某些形式的腫瘤生長中起作用。雙歧桿菌屬于放線菌綱(Actinobacteria)的雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)。兩歧雙歧桿菌MIMBb75可獲自Industrial Microbiology Culture Collection， DiSTAM， University of Milan， Milan，Italy,且兩歧雙歧桿菌 MIMBb75 于 2011 年 I 月 26 日保藏于 DSMZ (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,Germany),保藏號為 DSM24514。本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌的菌株、突變體或變異體對廣泛的革蘭氏陽性和革蘭陰性細(xì)菌具有抑制活性。本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌菌株或其變異體或突變體表現(xiàn)出對抗包括葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、大腸菌類(Coliform)及芽孢桿菌屬(Bacillus)的種在內(nèi)的細(xì)菌的廣譜活性。本發(fā)明的菌株的“突變體”表示已被修飾的，即通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)突變的兩歧雙歧桿菌菌株。本發(fā)明的菌株的“變異體”是天然存在的變異體，即在健康嬰兒和成人的胃腸道和陰道中存在的、與兩歧雙歧桿菌菌株密切相關(guān)的變異體。本發(fā)明菌株的突變體和變異體兩者，對于患有本文所述的任何疾病或癥狀的患者，類似地具有與本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌菌株，特別是與兩歧雙歧桿菌菌株MMBb75相同的有益性質(zhì)。變異體和突變體兩者也被視為該菌株的DNA同源物。在本發(fā)明的范圍中，術(shù)語“同源物”用于指在染色體DNA水平上共有一定程度的“同源性”，即“同一性”或“相似性”的菌株。存在許多算法來確定這種同源性或相似性程度。優(yōu)選地，可以使用 CLUSTAL 法(Higgins 等人，1989，Comput.Appl.Biosc1.，5 (2)，151)，借助于 DNAstar Inc.,Madison, Wisconsin (USA)公司的Lasergene軟件來確定同源性。在染色體DNA水平上“同源”(=基本相似)的生物體在染色體DNA水平上具有至少55%或60%，優(yōu)選至少65 %或70 %，更優(yōu)選至少75 %或80 %，甚至更優(yōu)選至少85 %或90 %，最優(yōu)選至少92 %、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同源性。
[0027]對于本發(fā)明來說，“疾病”是受試者(也稱為患者或人)的任何病癥，與被認(rèn)為健康的受試者的狀況相比其發(fā)生改變。通常，本發(fā)明的疾病與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎性活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少、胃腸道的腸屏障功能障礙和/或其組合相關(guān)。該菌株、突變體、變異體、益生菌制劑及其用途所針對的典型疾病是胃腸道或消化系統(tǒng)的所有疾病，如腸易激運(yùn)動、炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、儲袋炎或感染后結(jié)腸炎、胃腸癌、全身性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障礙、由不希望的炎性活性引起的腹瀉病如艱難梭菌相關(guān)腹瀉、抗生素相關(guān)腹瀉、輪狀病毒相關(guān)腹瀉或感染后腹瀉等等，及其組合。對于本發(fā)明來說，“癥狀”或“單個(gè)癥狀”是受試者的疾病得到表現(xiàn)的方式，如腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化失調(diào)、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感、總體IBS癥狀和/或其組合，以及總體下降的生活質(zhì)量?！翱傮wIBS癥狀”包括對關(guān)于IBS的上述所有單個(gè)癥狀的全面評價(jià)?！盎颊摺?=個(gè)人或人類或動物)是健康或不健康的受試者，在未患有本文提到的任何疾病或任何癥狀的情況下，其攝取顯示每mm2上皮細(xì)胞單層至少約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有至少1.5的粘附指數(shù)的本發(fā)明益生菌制劑或兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，或采用作為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體進(jìn)行的治療用于預(yù)防目的，或者在患者、人、人類或動物患有本文提到的任何疾病或任何癥狀時(shí)，其攝取本發(fā)明益生菌制劑或顯示每_2上皮細(xì)胞單層至少約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有至少1.5的粘附指數(shù)的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，或采用作為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體進(jìn)行的治療用于治療目的，該疾病如與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎癥活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少和/或胃腸道的腸屏障功能障礙相關(guān)的疾病，該癥狀如腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化障礙、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感和/或生活質(zhì)量下降。因此，患者(=個(gè)人)需要新的療法，如采用顯示每mm2上皮細(xì)胞單層至少約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有至少1.5的粘附指數(shù)的本發(fā)明兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體進(jìn)行的治療，或采用作為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體進(jìn)行的治療?；颊摺⑷嘶蚴茉囌咭部梢允菦]有任何上述疾病或癥狀的人。
[0028]對于本發(fā)明而言，“粘附性菌株”是一種兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，其對人結(jié)腸的細(xì)胞具有粘附性質(zhì)，因而能夠結(jié)合于人或還有動物腸壁的細(xì)胞，從而降低胃腸屏障的通透性并以“堵洞”作用模式改善腸壁。一種測試兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體的這種性質(zhì)的直接方法在實(shí)施例部分給出。在這方面，顯示每_2上皮細(xì)胞單層至少約10個(gè)、優(yōu)選約20個(gè)、更優(yōu)選約30個(gè)、甚至更優(yōu)選約40個(gè)、最優(yōu)選約50或55個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有1.5、優(yōu)選至少2、更優(yōu)選至少2.5、甚至更優(yōu)選至少3的粘附指數(shù)的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體被視為粘附性菌株或其突變體或變異體。
[0029]本發(fā)明的益生菌制劑作為益生菌用于食品中和/或用作藥物，并且包含兩歧雙歧桿菌的菌株或粘附性菌株或其突變體或變異體，其顯示每mm2上皮細(xì)胞單層至少約10個(gè)的粘附、優(yōu)選約20個(gè)、更優(yōu)選約30個(gè)、甚至更優(yōu)選約40個(gè)、最優(yōu)選約50或55個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，或具有1.5、優(yōu)選至少2、更優(yōu)選至少2.5、甚至更優(yōu)選至少3的粘附指數(shù)，或者本發(fā)明的益生菌制劑作為益生菌用于食品中和/或用作藥物，并且包含兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，其為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體。本發(fā)明的益生菌制劑也可被視為藥物制劑。“食品”原則上是指可被人、優(yōu)選地也被動物攝取和消化的任何形式的物質(zhì)或材料。一般來說，這包括可被食用或飲用以提供身體營養(yǎng)支持和/或愉悅的物質(zhì)或材料。對于人來說，這些物質(zhì)可以是植物、微生物或動物來源的。在本發(fā)明的情況下，具體而言，食品的意思是，它包含微生物有機(jī)體，特別是至少本發(fā)明的菌株，以及任選地包含在益生菌制劑中的、本文提及的其他物質(zhì)，如至少一種藥學(xué)上可接受的化合物、可攝取的載體、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物和/或蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和/或微量元素；任選地，所述至少一種藥學(xué)上可接受的化合物是選自一種或多種維生素如B族維生素、一種或多種礦物質(zhì)如鈣或鎂、一種或多種碳水化合物如乳糖、麥芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麥芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物的成員。“藥物”通常不被理解為食品，因?yàn)樗幬镆话阒唤o予特定狀況下的人或患者，該狀況不被視為健康的狀況，而是視為疾病。盡管如此，藥物也可以提供身體的營養(yǎng)支持和/或愉悅，例如在患抑郁癥患者的情況下。藥物和治療品一般都經(jīng)受更嚴(yán)格的監(jiān)管和審批流程。對于被理解為本發(fā)明菌株、突變體或變異體的主要施用方式和主要應(yīng)用的食品，這些審批流程是不必要的。如上文已經(jīng)解釋的，本發(fā)明中的“益生菌”包括非致病性的、人類來源的益生菌，并且已被定義為活微生物食品和醫(yī)療補(bǔ)充劑，其在以特定量攝入后，發(fā)揮超出固有的基本營養(yǎng)的健康效應(yīng)。各種微生物，特別是乳桿菌屬和鏈球菌屬的種的混合物，在傳統(tǒng)上已用于發(fā)酵乳制品中用以促進(jìn)健康。本發(fā)明的益生菌至少包含本發(fā)明的粘附性兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，或本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌MMBb75菌株或其突變體或變異體。然而，已被認(rèn)為是有用的益生菌的其他種的其他菌株、細(xì)胞、突變體或變異體也可以作為細(xì)菌成分存在于本發(fā)明的益生菌制劑中。這些是例如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母屬、鏈球菌屬的種的益生菌菌株或其混合物。因此，“細(xì)菌成分”表示如上提及的益生菌菌株的存活的或非存活的菌株或細(xì)胞，并且可以進(jìn)一步用于化合物，如細(xì)菌來源的或通過細(xì)菌發(fā)酵或表達(dá)產(chǎn)生的生物分子、多糖、脂質(zhì)或其他。甚至任何細(xì)菌種的死材料也可以被理解為細(xì)菌化合物。
[0030]本發(fā)明的益生菌制劑可進(jìn)一步包含至少一種益生素，或兩種、三種、四種或更多種不同益生素的組合。對于本發(fā)明來說，“益生素”意指充當(dāng)本發(fā)明的菌株的營養(yǎng)物，并使他們在從凍干狀態(tài)解凍后保持存活和健康狀態(tài)。每克微生物細(xì)胞，即每克菌株，通常2-5g、優(yōu)選約2.5g、更優(yōu)選至少2.5g、甚至更優(yōu)選至少3g、最優(yōu)選至少4g益生素是必要的。通常，無法被人消化的食物成分，如某些碳水化合物，用作益生素。益生素的例子包括碳水化合物，優(yōu)選寡糖、菊粉、果糖寡糖、半乳糖寡糖、亞麻籽車前草(psyllium)、低聚果糖、異麥芽糖寡糖、木糖寡糖、大豆寡糖、麥芽糊精、葡萄糖寡糖、甘露糖寡糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、低聚乳果糖、葡甘露聚糖(gluconannan)、乳果糖、聚右旋糖、低聚葡聚糖(oligodextran)、龍膽糖寡糖(gentioligosaccharide)、果膠寡糖、黃原膠、阿拉伯膠、半纖維素、抗性淀粉及其衍生物，以及它們的混合物和/或組合。
[0031]本發(fā)明的益生菌制劑可進(jìn)一步包含至少一種藥學(xué)上可接受的化合物、至少一種可攝取的載體、至少一種佐劑、至少一種細(xì)菌成分、至少一種藥物實(shí)體、至少一種生物化合物和/或至少一種蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和/或微量元素。
[0032]“藥學(xué)上可接受的化合物”是指在藥物組合物或制劑中是可以接受的液態(tài)、固態(tài)或氣態(tài)的化學(xué)或生物化合物，其特征在于對于人動物的生理學(xué)和身體的良好耐受性，以及在藥理學(xué)上無活性或?qū)邮苷叩纳韺W(xué)無有害影響。至少一種、兩種、三種、四種、五種乃至更多種不同的藥學(xué)上可接受的化合物可以以不同的量存在于本發(fā)明的益生菌制劑中?？梢杂缮a(chǎn)者根據(jù)所用兩歧雙歧桿菌菌株的具體需要并且根據(jù)特定應(yīng)用、施用方式或劑量方案對該量進(jìn)行調(diào)整。藥學(xué)上可接受的化合物的例子包括益生素、碳水化合物、脂質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、微量元素、氨基酸、核酸、麥芽糊精、菊粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糊精、右旋糖、果糖、山梨糖醇、果糖寡糖、甘露糖醇、玉米淀粉、結(jié)晶纖維素、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、硅酸鈣、微晶纖維素、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠、明膠，優(yōu)選牛明膠、糖漿、氨基水楊酸鹽、柳氮磺胺吡啶、5-氨基水楊酸、4-氨基水楊酸、芐連氮、二鹽酸鹽、奧沙拉嗪、巴柳氮、次水楊酸鉍、甲基纖維素、羧甲基纖維素、甲基羥基苯甲酸酯、丙基羥基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂、惰性聚合物、水和礦物油、碘、鎂、天冬氨酸-抗壞血酸鎂絡(luò)合物、鎂氨基酸螯合物、鋅、鋅氨基酸螯合物、硒、硒氨基酸絡(luò)合物、銅、銅氨基酸螯合物、錳、錳氨基酸螯合物、鉻、聚煙酸鉻、鑰、鑰氨基酸螯合物、鉀、天冬氨酸-抗壞血酸鉀絡(luò)合物、膽堿、重酒石酸膽堿、肌醇、釩、硫酸氧釩、硼、天冬氨酸-檸檬酸硼、柑橘生物黃酮、改性纖維素膠、二氧化硅、植物硬脂(vegetarian stearine)、二氧化鈦、硬脂酸鎂,優(yōu)選地所述至少一種、兩種、三種、四種、五種乃至更多種藥學(xué)上可接受的化合物是選自一種或多種維生素如B族維生素、一種或多種礦物質(zhì)如鎂和鈣、一種或多種碳水化合物、明膠(優(yōu)選牛明膠)、甘露糖醇、糊精、果糖、山梨糖醇、益生素、麥芽糖、麥芽糊精、菊粉、右旋糖、鐵、乳糖及其混合物的成員。而且，益生菌制劑可包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的藥學(xué)上可接受的填充劑、粘合劑、潤滑劑、潤濕劑、崩解劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑和調(diào)味劑。
[0033]本發(fā)明的益生菌制劑和菌株或其突變體或變異體可以進(jìn)行配制，以使得向患者施用后，該菌株或細(xì)胞快速、持續(xù)或緩慢地釋放?？梢园诒景l(fā)明益生菌制劑中的維生素的例子有水溶性和水不溶性維生素，如維生素A(例如視黃醇、視黃醛和類胡蘿卜素類，包括13-胡蘿卜素)、維生素B1 (硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B3(例如煙酸、煙酰胺、尼克酰胺)、維生素B5 (泛酸)、維生素B6 (例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、維生素B7 (生物素)、維生素B9(例如葉酸、亞葉酸)、維生素B12 (例如氰鈷胺素、羥鈷胺素、甲基鈷胺素)、維生素C(抗壞血酸)、維生素D (例如麥角鈣化醇、膽骨化醇)、維生素E (例如生育酚、生育三烯酚)、維生素K (例如葉綠醌、甲基萘醌類)，優(yōu)選地本發(fā)明的益生菌制劑中包含B族維生素，如維生素B1 (硫胺素)、維生素B2 (核黃素)、維生素B3 (例如煙酸、煙酰胺、尼克酰胺)、維生素B5 (泛酸)、維生素B6 (例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、維生素B7 (生物素)、維生素B9 (例如葉酸、亞葉酸)、維生素B12 (例如氰鈷胺素、羥鈷胺素、甲基鈷胺素)及其混合物。包含在本發(fā)明益生菌制劑中的礦物質(zhì)的例子有鎂、鈣、鋅、硒、鐵、銅、錳、鉻、鑰、鉀、釩、硼、鈦，優(yōu)選存在鎂和/或鈣?！拔⒘吭亍笔菍τ谟袡C(jī)體、優(yōu)選人類有機(jī)體的生長、發(fā)育和/或生理學(xué)而言只需要極低量的化學(xué)元素?！疤妓衔铩笔莾H由碳、氫和氧組成并具有經(jīng)驗(yàn)式Cm(H2O)?的有機(jī)化合物，其中氫:氧原子比為2:1?！爸|(zhì)”是由于長疏水性碳水化合物部分而至少部分地不溶于水的生物化合物。脂質(zhì)是生物系統(tǒng)中的細(xì)胞膜的非常重要的部分。
[0034]對于本發(fā)明而言，“可攝取的載體”是用于向受試者或患者施用本發(fā)明的益生菌制劑或菌株或其突變體或變異體的載體，從而幫助攝取本發(fā)明的益生菌制劑和菌株或其突變體或變異體。本文所用的術(shù)語“乳制品”意在包括含有動物和/或植物來源的乳的介質(zhì)。動物來源的乳包括來自牛、綿羊、山羊和水牛的乳。作為植物來源的乳，可以提到任何可根據(jù)本發(fā)明使用的植物來源的可發(fā)酵物質(zhì)，特別是來源于大豆、大米或谷物的。一種可能的可攝取載體是選自膠囊、片劑、粉末、顆粒劑、錠劑、扁囊劑、酏劑、乳劑、溶液、糖漿、懸浮劑、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌包裝的粉末或食物產(chǎn)品的成員；任選地，食物產(chǎn)品是乳制品、酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、酸奶產(chǎn)品如發(fā)酵酸奶飲料、飲用酸奶、乳酪、發(fā)酵奶油、乳基甜品發(fā)酵乳或人化乳、奶粉、濃縮乳、涂抹干酪、調(diào)料、飲料等等。對于本發(fā)明而言，“佐劑”是一種藥理學(xué)或免疫學(xué)制劑，其改變其它藥 劑如藥物或疫苗或本發(fā)明的益生菌制劑、菌株或其突變體或變異體的效果，同時(shí)在單獨(dú)給予時(shí)具有極少的-如果有的話-直接效應(yīng)。
[0035]“藥物實(shí)體”涉及藥學(xué)活性的、同時(shí)對于患者而言藥學(xué)可耐受的化學(xué)或生物化合物，如比沙可啶、洛哌丁胺、氨基水楊酸鹽、柳氮磺胺吡啶、5-氨基水楊酸、4-氨基水楊酸、芐連氮、二鹽酸鹽、奧沙拉嗪、巴柳氮、次水楊酸鉍或其混合物。這樣的化合物可以是任何直接或間接地促進(jìn)本發(fā)明益生菌制劑或菌株、其突變體或變異體的有益效果的化合物?！爸苯拥亍币庵竷善珉p歧桿菌菌株或其突變體或變異體本身得到保護(hù)，其生長或?qū)δc屏障的粘附得到支持?！伴g接地”意指在益生菌制劑中可以單獨(dú)地或與其他藥物實(shí)體組合地包含額外的物質(zhì)或化合物，即藥物實(shí)體，已知其可用于預(yù)防和/或治療與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎性活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少和/或胃腸道的腸屏障功能障礙相關(guān)的疾病，或用于減輕、預(yù)防和/或治療患有腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化失調(diào)、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感和/或其組合的受試者，或用于改善患者的生活質(zhì)量。特別是，益生菌制劑中可以包含作為用于治療以下疾病的已知藥物的藥物實(shí)體:胃腸道疾病如腸易激運(yùn)動、炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、儲袋炎或感染后結(jié)腸炎、胃腸癌，全身性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障礙、由不希望的炎性活性引起的腹瀉病如艱難梭菌相關(guān)腹瀉、抗生素相關(guān)腹瀉、輪狀病毒相關(guān)腹瀉或感染后腹瀉，及其組合。這樣的藥物實(shí)體的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可見于Rote Liste, 2010, Germany或任何其他藥品登記表中。“生物化合物”可以是任何生物化合物，如碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、肽、細(xì)胞區(qū)室、磷脂、聚醚、植物、動物或微生物化合物?！暗鞍踪|(zhì)”、“肽”或“多肽”將根據(jù)它們的通常含義理解為蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性氨基酸的線性組合物，其中蛋白質(zhì)還可以包含一個(gè)或多個(gè)亞基和催化相關(guān)物質(zhì)，如維生素、礦物質(zhì)或物質(zhì)。
[0036]“菌落形成單位”(cfu)是本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體的活細(xì)菌細(xì)胞的量度。本發(fā)明的益生菌制劑以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO1Cfu，任選地不小于102、103、IO4UO5或IO6菌落形成單位(Cfu)包含該菌株、其突變體或變異體，優(yōu)選地，該菌株、突變體或變異體以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO7Cfu存在，更優(yōu)選地，該菌株、突變體或變異體以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO8Cfu存在，甚至更優(yōu)選地，該菌株、突變體或變異體以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO9Cfu存在。在益生菌制劑中向患者施用的菌株、其突變體或變異體的每日量不小于IO1Cfu,任選地不小于102、103、IO4UO5或106cfu，優(yōu)選不小于107cfu，更優(yōu)選不小于IO8Cfu,甚至更優(yōu)選不小于IO9Cfu或不小于101(lCfu。每日量可根據(jù)患者的生理狀況增加，即在嚴(yán)重癥狀的情況下增加。在此，該量可以增加，其中每日量加倍、為三倍或多倍。與此相反，每日量可以減少、減半或除以2、3或4，例如在不耐受性或給予額外藥物的情況下，或者如前面提到的每日量可以不每天施用，而是每隔一天或兩天或每周施用。該菌株、其突變體或變異體或益生菌制劑可以在個(gè)人或患者認(rèn)為方便的任何時(shí)間服用，例如在早晨、中午、下午或晚上，優(yōu)選地，時(shí)間是在早晨，例如醒后，或在晚上，例如臨睡前。如果該菌株、其突變體或變異體或益生菌制劑包含作為食物產(chǎn)品的可攝取載體，則根據(jù)可攝取載體的性質(zhì)，即食物產(chǎn)品，進(jìn)行施用。如果該菌株、其突變體或變異體或益生菌制劑包含可攝取的載體，如片劑膠囊或相當(dāng)?shù)目蓴z取載體，則伴隨著飲料或水，優(yōu)選伴隨著水進(jìn)行口服施用。
[0037]通常，本發(fā)明的益生菌制劑和菌株根據(jù)益生菌、食品或藥物的具體形式進(jìn)行施用。因此，在正常情況下，口服、優(yōu)選腸胃外或通過直腸施用本發(fā)明的益生菌制劑和菌株。
[0038]生產(chǎn)本發(fā)明的益生菌制劑的方法至少包括以下步驟:
[0039]a)在富含蛋白質(zhì)的液體生長培養(yǎng)基中發(fā)酵和/或生長顯示每mm2上皮細(xì)胞單層至少約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有至少1.5的粘附指數(shù)的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，或作為在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，
[0040]b)通過細(xì)胞的離心、穩(wěn)定化、冷凍干燥、研磨和過篩來收獲上述菌株的細(xì)胞，
[0041]c)任選地混合/摻混所述細(xì)胞與益生素、藥學(xué)上可接受的化合物、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物、蛋白質(zhì)和/或肽中的一個(gè)或多個(gè)成員，和
[0042]d)將步驟b)的細(xì)胞或步驟c)的混合物引入可攝取的載體中。
[0043]首先應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌菌株、突變體或變異體的發(fā)酵和生長可以通過如在〃Probiotics and Health Claims" , Wolfgang KneifeI, Seppo Salminen, Johnffiley&Sons ；1.Edition(2011年I月7日)中描述的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)手段和
方法進(jìn)行。
[0044]通常，用于生長和/或發(fā)酵本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌菌株、突變體或變異體的培養(yǎng)基至少包含水、右旋糖、酵母提取物和礦物質(zhì)。用于生長和/或發(fā)酵本發(fā)明的菌株或其變異或突變體的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基是補(bǔ)充有0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯(Difco，Detroit,MI, USA) (cMRS)。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚以下事實(shí):其他培養(yǎng)基也可以用于生長、發(fā)酵和預(yù)培養(yǎng)細(xì)菌有機(jī)體，如兩歧雙歧桿菌菌株。任選地，在步驟a)之前，菌株或其變異體或突變體在搖瓶中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)生長。為了這個(gè)目的，在體積為至少200mL、優(yōu)選至少300mL、更優(yōu)選至少400mL、甚至更優(yōu)選至少500mL和最優(yōu)選至少600mL的如上提及的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中接種該菌株或其變異體或突變體的至少單細(xì)胞。這種預(yù)培養(yǎng)一般在37°C下以220rpm厭氧生長過夜。
[0045]預(yù)培養(yǎng)然后可以完全或部分地用于在容積為至少500L、優(yōu)選至少600L、更優(yōu)選至少700L、甚至更優(yōu)選至少800L、最優(yōu)選至少1000L的預(yù)發(fā)酵罐中接種用于上層發(fā)酵(higherfermentation)。在預(yù)發(fā)酵罐中進(jìn)行本發(fā)明的菌株、變異體和突變體的發(fā)酵后，將含有所述菌株、變異體和突變體的細(xì)胞培養(yǎng)物至少部分地轉(zhuǎn)移到容積為至少5000L、優(yōu)選至少7500L、更優(yōu)選至少10000L、甚至更優(yōu)選至少15000L、最優(yōu)選至少20000L的主發(fā)酵罐中。在預(yù)發(fā)酵罐和主發(fā)酵罐中，也使用上述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基發(fā)酵和生長本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌菌株、其突變體和變異體。在包含在培養(yǎng)基中充當(dāng)本發(fā)明菌株、突變體和變異體的營養(yǎng)物的碳水化合物耗盡后，停止發(fā)酵和生長并收獲細(xì)胞。通常，碳水化合物耗盡后的細(xì)胞密度是至少IO1Cfu,任選地不小于ΙΟ2、ΙΟ3、104、IO5或IO6個(gè)細(xì)胞/ mL,優(yōu)選至少IO7個(gè)細(xì)胞/ mL,更優(yōu)選至少IO8個(gè)細(xì)胞/ mL,甚至更優(yōu)選至少IO9個(gè)細(xì)胞/ mL或至少101°個(gè)細(xì)胞/ mL。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道細(xì)胞密度或生物量測定的方法，如使用標(biāo)準(zhǔn)干燥程序測定作為干重的生物量，和預(yù)稱重的玻璃管的重量測定，或使用分光光度計(jì)(如Hitachi U-1100，Japan)在578nm處吸光度的光密度測量。
[0046]預(yù)發(fā)酵罐和主發(fā)酵罐可以來源于適于培養(yǎng)、發(fā)酵、生長和/或處理本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌菌株、突變體和/或變異體的標(biāo)準(zhǔn)生物反應(yīng)器。標(biāo)準(zhǔn)生物反應(yīng)器的供應(yīng)商例如有 Applikon Biotechnology B.V.(Schiedam, The Netherlands)、Infors(Bottmingen,Switzerland) > Bioengineering (, Wald, Switzerland)和 Sartorius Stedim BiotechGmbH (Gottingen, Germany)。預(yù)發(fā)酵和主發(fā)酵兩者以分批模式進(jìn)行,分批模式通常意味著在發(fā)酵過程中不補(bǔ)充培養(yǎng)基或其他成分。
[0047]主發(fā)酵后，通過離心分離收獲細(xì)胞，如通過使用盤式離心機(jī)或如由GEA WestfaliaSeparator Group GmbH(0eIde, Germany)提供的、具有約 2000-15000L / h 工作能力的分離器或其他的。隨后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用和手段將細(xì)胞穩(wěn)定化、冷凍干燥、研磨并過篩。冷凍干燥獲得體積為500L-1000L、優(yōu)選600L-800L且重量約為100kg_200kg、優(yōu)選約150kg的濃縮物。
[0048]之后，任選地將細(xì)胞與益生素和/或至少一個(gè)或多個(gè)選自下組的成員混合:藥學(xué)上可接受的化合物、可攝取的載體、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物和/或蛋白質(zhì)和/或肽和/或其混合物，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和/或微量元素；任選地，所述至少一種藥學(xué)上可接受的化合物是選自一種或多種維生素如B族維生素、一種或多種礦物質(zhì)如鈣或鎂、一種或多種碳水化合物如乳糖、麥芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麥芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其不同量的混合物的成員。
[0049]為了獲得本發(fā)明的益生菌制劑，通常，15_40g、優(yōu)選18_35g、更優(yōu)選20_30g、甚至更優(yōu)選22-28g、最優(yōu)選25g本發(fā)明兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體與50-100g、優(yōu)選60-90g、更優(yōu)選65-85g、甚至更優(yōu)選70-80g、最優(yōu)選75g的作為該細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體的營養(yǎng)物的一個(gè)或多個(gè)選自益生素、碳水化合物、藥學(xué)上可接受的化合物或其混合物的成員混合，并且任選地與30-70g、優(yōu)選35-65g、更優(yōu)選40_60g、甚至更優(yōu)選45_55g、最優(yōu)選50g的一個(gè)或多個(gè)選自下組的成員混合:藥學(xué)上可接受的化合物、可攝取的載體、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物和/或蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)、微量元素和/或其混合物，以用于改善益生菌制劑的流動性。優(yōu)選地，15-40g、優(yōu)選18-35g、更優(yōu)選20-30g,甚至更優(yōu)選22-28g、最優(yōu)選25g的本發(fā)明兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體與50-100g、優(yōu)選60-90g、更優(yōu)選65-85g、甚至更優(yōu)選70_80g、最優(yōu)選75g碳水化合物、碳水化合物混合物、益生素或其混合物混合，并且任選地與30-70g、優(yōu)選35-65g、更優(yōu)選40_60g、甚至更優(yōu)選45-55g、最優(yōu)選50g的一個(gè)或多個(gè)選自藥學(xué)上可接受的化合物、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)、微量元素和/或其混合物的成員混合。更優(yōu)選地，15-40g、優(yōu)選18-35g、更優(yōu)選20-30g、甚至更優(yōu)選22-28g、最優(yōu)選25g本發(fā)明兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體與50-100g、優(yōu)選60-90g、更優(yōu)選65-85g、甚至更優(yōu)選70_80g、最優(yōu)選75g碳水化合物、菊粉、果糖寡糖或其混合物混合，并且任選地與30-70g、優(yōu)選35-65g、更優(yōu)選40_60g、甚至更優(yōu)選45-55g、最優(yōu)選50g的一個(gè)或多個(gè)選自下組的成員混合:維生素如B族維生素、一種或多種礦物質(zhì)如鈣或鎂、一種或多種碳水化合物如乳糖、麥芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露醇、果糖寡糖、甘露糖醇、麥芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物。甚至更優(yōu)選地，25g本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體與75g選自碳水化合物、益生素、麥芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麥芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物的成員混合，并且與50g選自下組的成員混合:纖維素、藥學(xué)上可接受的化合物、可攝取的載體、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物和/或蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)、微量元素或其混合物。最優(yōu)選地，25g本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體與75g麥芽糊精混合，并與50g纖維素混合。在發(fā)酵和/或生長菌株、收獲、穩(wěn)定化、冷凍干燥、研磨、過篩后，所述成分與本發(fā)明的細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體的混合/摻混可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)、應(yīng)用和手段進(jìn)行，優(yōu)選地使用柱混合器。當(dāng)然，在混合/摻混中也可使用更高或更低的量，這取決于用于混合/摻混的裝置的容積，只要成分的比例對應(yīng)于以上提及的比值即可。例如，一個(gè)典型的比率為25%的菌株、75%的益生菌或碳水化合物或麥芽糊精和70%的藥學(xué)上可接受的化合物，如纖維素。例如，將50mg-300mg、優(yōu)選75mg-250mg、更優(yōu)選100mg-200mg、甚至更優(yōu)選120mg-175mg、最優(yōu)選150mg本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體，或本發(fā)明的上述混合物或益生菌制劑，引入一個(gè)單位的可攝取載體中，例如引入膠囊、片劑、錠劑、扁囊劑、酏劑、乳劑、溶液、糖漿、懸浮劑、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌包裝的粉末或食物產(chǎn)品中，如乳制品、酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、酸奶產(chǎn)品如發(fā)酵酸奶飲料、飲用酸奶、乳酪、發(fā)酵奶油、乳基甜品發(fā)酵乳或人化乳、奶粉、濃縮乳、涂抹干酪、調(diào)料、飲料等等，優(yōu)選地將50mg、優(yōu)選75mg、更優(yōu)選lOOmg、甚至更優(yōu)選120mg、最優(yōu)選150mg本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體或上述混合物引入到膠囊、片劑、錠劑、扁囊劑、軟和硬明膠膠囊、栓劑中，更優(yōu)選地引入膠囊、軟和硬明膠膠囊中。由此，在引入此可攝取載體單元中后，即膠囊、片劑、粉末、顆粒劑、錠劑、扁囊劑、酏劑、乳劑、溶液、糖漿、懸浮劑、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌包裝的粉末或食物產(chǎn)品(如乳制品、酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、酸奶產(chǎn)品如發(fā)酵酸奶飲料、飲用酸奶、乳酪、發(fā)酵奶油、乳基甜品發(fā)酵乳或人化乳、奶粉、濃縮乳、涂抹干酪、調(diào)料和/或飲料)，其包含超過IO1Cfu,任選地不小于102、IO3,104、IO5或106cfu，優(yōu)選超過107cfu,更優(yōu)選超過108cfu,甚至更優(yōu)選超過IO9Cfu或超過101Qcfu。在任何情況下,可根據(jù)cfu的濃度調(diào)整該量(按重量)，使得最終產(chǎn)品如膠囊、片劑、粉末、顆粒劑、錠劑、扁囊劑、酏劑、乳劑、溶液、糖漿、懸浮劑、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌包裝的粉末或食物產(chǎn)品中本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、其突變體或變異體的量相當(dāng)于超過IO1Cfu,任選地不小于102、
103、IO4>IO5或IO6Cfu,優(yōu)選超過IO7Cfu,更優(yōu)選超過108cfu,甚至更優(yōu)選超過IO9Cfu或超過IO10Cfu0 在 cfu 的量小于 IO1Cfu,任選地小于 102、103、IO4UO5 或 106cfu、107cfu、108cfu、甚至IO9Cfu或小于IOltlCfu的情況下，患者可通過施用超過一個(gè)可攝取載體單位而適應(yīng)上述cfu 量。
[0050]在一個(gè)不例性實(shí)施方案中，將25mg在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75細(xì)胞，即至少IO9Cfu的在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75、75mg麥芽糊精和50mg纖維素引入一個(gè)明膠膠囊中，優(yōu)選牛明膠膠囊。優(yōu)選地，上述含有25mg在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75細(xì)胞的膠囊包含至少IO9Cfu的在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75、75mg麥芽糊精和50mg纖維素，其每日施用一次?？蓴z取的載體通常應(yīng)當(dāng)是標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量至高質(zhì)量的，應(yīng)當(dāng)符合食品添加劑的衛(wèi)生要求，并可從各個(gè)生產(chǎn)商獲得。膠囊，例如牛明膠膠囊，例如可以從Capsugel (Bornem, Belgium)獲得。[0051 ] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，25mg在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75細(xì)胞(優(yōu)選包含至少IO9Cfu的在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75)和2g麥芽糊精混合，并被看作一個(gè)單位的粉末。優(yōu)選地，含有25mg在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75細(xì)胞，即至少IO9Cfu在保藏號DSM24514下保藏的兩歧雙歧桿菌MMBb75的上述粉末單位每日施用一次。
[0052]不依賴于由個(gè)人或患者選擇的特定可攝取載體，在益生菌制劑中向患者施用的兩歧雙歧桿菌細(xì)胞、菌株、突變體或變異體的每日量不低于IO1Cfu,任選地不低于102、103、
104、IO5或IO6Cfu,優(yōu)選不低于IO7Cfu,更優(yōu)選不低于IO8Cfu,甚至更優(yōu)選不低于IO9Cfu或不低于10lclcfu?？蛇x的劑量在上文討論。
[0053]本發(fā)明并不限定于前文所述的實(shí)施方案，它們在細(xì)節(jié)上可以進(jìn)行改變。
實(shí)施例
[0054]1.細(xì)菌培養(yǎng)條件
[0055]通常，雙歧桿菌屬的種，如兩歧雙歧桿菌MMBb75，常規(guī)地在補(bǔ)充有0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯(cMRS) (Difco, Detroit, MI, USA)中37°C下厭氧生長過夜。[0056]2.兩歧雙歧桿菌MLMBb75對Caco_2人腸上皮細(xì)胞系的粘附性質(zhì)的測試
[0057]2.1細(xì)菌對Caco-2細(xì)胞的粘附
[0058]可以進(jìn)行該試驗(yàn)以測試某些雙歧桿菌菌株對人結(jié)腸細(xì)胞是否具有粘附性質(zhì)，并因此被理解為對于本發(fā)明而言的粘附性菌株。人結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞(ATCC HTB-37)在顯微鏡蓋玻片上的3-cm培養(yǎng)皿中，在補(bǔ)充有10% (體積/體積)熱滅活(56°C，30分鐘)的胎牛血清、100U mL—1青霉素、IOOmg mL—1鏈霉素、0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中常規(guī)生長，并在帶水夾套的培養(yǎng)箱中在95%空氣和5%二氧化碳的氣氛下37°C溫育。對于該試驗(yàn)，來自任何體內(nèi)來源的上皮細(xì)胞，包括但不限于來自于人胃腸道的上皮細(xì)胞，是合適的，然而，CaCo-2細(xì)胞或其衍生物是最優(yōu)選的，并且可從培養(yǎng)物保藏庫如ATCC和ECACC商購獲得。培養(yǎng)基每周更換兩次。對于粘附分析，細(xì)胞在匯合后15天使用(完全分化的細(xì)胞)。在加入細(xì)菌細(xì)胞之前，細(xì)胞單層用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.3)仔細(xì)洗滌兩次。在DAPI (4'，6' - 二脒基_2_苯基吲哚)染色后，用顯微鏡測定生長過夜的培養(yǎng)物的細(xì)菌細(xì)胞濃度。在PBS (pH7.3)中重懸浮的各菌株約2X IO8個(gè)細(xì)胞與完全分化的Caco-2細(xì)胞的單層一起溫育。在缺氧條件下37°C I小時(shí)后，所有單層用PBS洗滌三次以釋放未結(jié)合的細(xì)菌。然后將細(xì)胞用3mL甲醇固定，并在室溫下溫育8分鐘。除去甲醇后，用3mL姬姆薩染色液(I:20) (Carlo Erba，Milan，Italy)對細(xì)胞進(jìn)行染色，并在室溫下放置30分鐘。然后洗滌各孔，直到在洗滌溶液中觀察不到顏色，并在培養(yǎng)箱中干燥I小時(shí)。然后從培養(yǎng)皿中取出顯微鏡蓋玻片，并進(jìn)行油浸顯微鏡檢查(放大倍數(shù)X 100)。對20個(gè)隨機(jī)選擇的顯微鏡視野中的粘附性細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)和平均。運(yùn)行未配對Studentt檢驗(yàn)以分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
[0059]發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌MMBb75良好地粘附至Caco_2人結(jié)腸細(xì)胞，因?yàn)轱@著比例的該細(xì)菌菌株的細(xì)胞保持附著于Caco-2單層，從而提供了該粘附不只是非特異性物理捕集的證據(jù)。特別是，約55個(gè)細(xì)菌細(xì)胞粘附到Ι-mm2上皮細(xì)胞單層上，導(dǎo)致3874的粘附指數(shù)(細(xì)菌細(xì)胞/ 100個(gè)Caco-2細(xì)胞)(P < 0.026)。在這點(diǎn)上，顯示每mm2上皮細(xì)胞單層至少約10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附或具有至少1.5的粘附指數(shù)的雙歧桿菌菌株細(xì)胞被認(rèn)為是粘附性菌株。
[0060]2.2細(xì)菌細(xì)胞壁提取物的制備
[0061]通過離心從0.2L液體培養(yǎng)物中收獲細(xì)菌細(xì)胞，并根據(jù)以前Mattarelli等人(1993)所描述的方法進(jìn)行處理，其中改進(jìn)是采用弗氏壓碎器(12，0001b / in2，約2，142kg / em2)破碎細(xì)胞。
[0062]3.用于評估兩歧雙歧桿菌MMBb75在腸易激綜合征患者中的功效的雙盲、隨機(jī)化和安慰劑對照研究
[0063]3.1 概述
[0064]將122名患者成功地隨機(jī)分組以接受安慰劑(N=62)或兩歧雙歧桿菌MIMBb75 (N=60)(也稱為“雙歧桿菌組”)。受試者服用I X IO9Cfu /膠囊或安慰劑，每天一次，共四周。每天按照7點(diǎn)利克特量表記錄IBS和單個(gè)IBS癥狀的嚴(yán)重程度。
[0065]3.2研究人群
[0066]患者由主要研究者通過廣告招募。營養(yǎng)研究方案已提交Bavarian Chamber ofPhysicians的倫理委員會。對于入組，考慮年齡為18_68歲、具有輕度到中度IBS (RomeIII標(biāo)準(zhǔn))的臨床上不顯著的受試者。已排除具有炎性器質(zhì)性胃腸疾病、全身性疾病、癌癥、自身免疫性疾病、糖尿病、已知乳糖不耐受或免疫缺陷、已知除闌尾切除術(shù)外的其他腹部手術(shù)、當(dāng)超過50歲時(shí)在最近5年內(nèi)沒有無病乙狀結(jié)腸鏡檢查或結(jié)腸鏡檢查、診斷為甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、在研究開始前使用抗精神病藥或全身性皮質(zhì)類固醇至少3個(gè)月、主要精神異常、乳糜瀉或妊娠的個(gè)體。
[0067]3.3研究設(shè)計(jì)
[0068]該研究作為一項(xiàng)前瞻性、多中心、隨機(jī)化、雙盲、安慰劑對照、雙組營養(yǎng)研究而進(jìn)行。在整個(gè)研究中，患者采用患者日記每天記錄其總體IBS癥狀以及單個(gè)IBS癥狀。另外，在醫(yī)療場所詢問患者的總體及單個(gè)IBS癥狀(訪視2-4)和生活質(zhì)量(訪視3和4)。醫(yī)生訪視發(fā)生在篩選時(shí)、兩周后(測試期(run-1n phase) )、6周后(治療結(jié)束時(shí))及8周后(清除期結(jié)束時(shí))(圖1)。
[0069]在患者給予書面知情同意后，他們有資格進(jìn)行第I天的篩選檢驗(yàn)(訪視I)，這包括完整醫(yī)療史和身體檢查。采集血樣以在中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，包括妊娠試驗(yàn)。在篩選訪視時(shí)，指示患者在整個(gè)研究過程中保持其飲食和生活方式習(xí)慣。分發(fā)患者日記。
[0070]在第二次訪視時(shí)(第15天)，審閱日記。將測試期第二周期間有至少2天具有輕度至中度疼痛且符合所有入選標(biāo)準(zhǔn)和不違反任何排除標(biāo)準(zhǔn)的患者按1:1隨機(jī)分組以接受兩歧雙歧桿菌MMBb75或安慰劑。根據(jù)計(jì)算機(jī)生成的、區(qū)組大小為4的區(qū)組隨機(jī)化列表分配治療。區(qū)組大小沒有透露給研究人員。在干預(yù)期期間，患者每天接受一粒包含益生菌制劑的膠囊共4周，或接受相同外觀的安慰劑?；颊吆凸ぷ魅藛T對于該分配均不知情。
[0071]在治療期結(jié)束時(shí)(訪視3，第43天)，研究人員收集未使用的研究產(chǎn)品和空藥囊以確認(rèn)順應(yīng)性。收集并審閱日記。
[0072]在無營養(yǎng)補(bǔ)充劑的清除期后(訪視4，第57天)，進(jìn)行全面的身體檢查，并采集血樣。允許用比沙可啶和洛哌丁胺作為救護(hù)藥物?？赡苡绊懷芯慨a(chǎn)品的功效的其他益生菌劑和藥物是不允許的。
[0073]3.4益生菌制劑
[0074]在優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)條件下制備營養(yǎng)補(bǔ)充劑。兩歧雙歧桿菌MMBb75在富含蛋白質(zhì)的液體生長培養(yǎng)基中生長，通過離心收獲，穩(wěn)定化，冷凍干燥，研磨并過篩。干粉細(xì)菌與藥學(xué)上可接受的化合物混合，并以I X IO9Cfu填充到膠囊中。安慰劑膠囊外觀相同，并含有麥芽糊精。
[0075]3.5終點(diǎn)定義
[0076]前瞻性定義的主要功效變量為使用7點(diǎn)利克特量表對受試者的IBS癥狀的整體評價(jià)。要求患者每天回答以下問題:“如果你總體上考慮你的IBS癥狀(如腹痛/不適、腹脹/氣脹、消化障礙、急迫、大便習(xí)慣)，在過去24小時(shí)期間你受這些癥狀的影響如何？”可能的回答是從0(根本沒有)、1(極輕度)、2(輕度)、3(中度)、4(強(qiáng))、5(極強(qiáng))到6(無法忍受)。
[0077]次要功效變量包括單獨(dú)IBS的單個(gè)癥狀，如“腹痛/不適”、“腹脹/氣脹”、“消化障礙”和“急迫”，按照相同的7點(diǎn)利克特量表記錄。將單個(gè)癥狀評分另外組合成綜合征狀評分，作為三個(gè)單個(gè)癥狀評分的算術(shù)平均值。此外，排便次數(shù)減少和/或增加、不完全腸排空感和其他藥物的攝入也每天記錄在日記中。
[0078]在結(jié)束治療時(shí)以及在研究結(jié)束時(shí)，醫(yī)生詢問患者關(guān)于對功效和耐受性的整體評價(jià)。功效通過以下問題進(jìn)行評價(jià):“請考慮在4周的治療期間，關(guān)于你的總體健康和腹部不適/疼痛癥狀和大便習(xí)慣改變，你感覺如何。與你在服用研究藥物之前通常的感覺相比，你如何評價(jià)你在過去4周內(nèi)的癥狀緩解？”可能的回答是:“完全緩解(I)、明顯緩解(2)、略微緩解(3)、未改變(4)或更糟(5)”?！巴耆徑狻焙汀懊黠@緩解兩者被定義為“充分緩解”。與健康相關(guān)的生活質(zhì)量在治療前和治療結(jié)束時(shí)利用SF-12調(diào)查問卷進(jìn)行評估。
[0079]整個(gè)研究期間記錄不良事件，并在醫(yī)生訪視3和4時(shí)詢問對耐受性的整體評價(jià)。在篩選訪視時(shí)和在研究結(jié)束時(shí)檢查實(shí)驗(yàn)室值和生命體征。
[0080]3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0081]3.6.1樣本大小估計(jì)
[0082]按照7點(diǎn)利克特量表，受試者的整體評價(jià)(SGA)至少降低20%被認(rèn)為是相關(guān)的治療效果?；诠嫉臄?shù)據(jù)(WhOrwell，2006年)，預(yù)計(jì)按照7點(diǎn)利克特量表，兩歧雙歧桿菌MIMBb75與安慰劑之間IBS癥狀的SGA相差0.6個(gè)點(diǎn)(例如，在安慰劑組中為3.0而在雙歧桿菌組中為2.4)。使用相同的數(shù)據(jù)估計(jì)1.0的標(biāo)準(zhǔn)差。應(yīng)用這些假設(shè)，需要Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗(yàn),其雙側(cè)顯著性水平為α =0.05,效能為1- β =0.8,樣本大小為每組47名患者。采用估計(jì)的隨機(jī)分組后15-20%的退出率，計(jì)劃有110名隨機(jī)分組的患者，并招募132名來應(yīng)對研究開始前可能的退出。
[0083]3.6.2統(tǒng)計(jì)分析
[0084]本研究的主要目標(biāo)是證明雙歧桿菌組與安慰劑組相比在治療結(jié)束時(shí)總體IBS癥狀的SGA顯著降低。將每名受試者的SGA在基線處、治療期間和清除期計(jì)算為算術(shù)平均值。為了說明基線值可能的差異，通過4周治療期間的平均評分減去測試期(第1-2周)期間的平均評分而計(jì)算的距基線的變化被定義為主要目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)。由研究中心分層的非參數(shù)VanElteren檢驗(yàn)用于治療組的比較。ρ < 0.05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。
[0085]主要分析基于有治療意向的人群，其中包括所有成功隨機(jī)分組的患者。對于主要目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)用基線值輸入基線后漏失值，并且這些患者被評價(jià)為非響應(yīng)者。為了支持目的，進(jìn)行額外的符合方案分析(per protocol analysis)。
[0086]次要目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的描述性分析是基于可獲得的數(shù)據(jù)。對于連續(xù)變量利用非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn),或者對于二元變量利用Fishers精確檢驗(yàn)對治療差異進(jìn)行檢驗(yàn)。所有的P值均為雙側(cè)的。
[0087]次要功效變量包括治療期間基于50%癥狀緩解原則的響應(yīng)(治療期內(nèi)的四周中至少有兩周改善，以及被定義為距基線降低至少一個(gè)點(diǎn)的改善)。所有的統(tǒng)計(jì)分析都采用windows 版的 SAS9.1.3 (SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)進(jìn)行。
[0088]3.7 結(jié)果
[0089]3.7.1 受試者
[0090]總共132名患者入選該研究，而122名患者成功隨機(jī)分組以接受安慰劑(N=62)或兩歧雙歧桿菌MMBb75(N=60)。分析所有隨機(jī)分組的患者的治療意向(ITT) (N=122)。一名未接受隨機(jī)分組后訪視的患者被排除在不良事件分析之外?？偣?03名患者(49人安慰劑，54人真實(shí)(verum))按照方案進(jìn)行了分析(圖2)。
[0091]3.7.2基線特征
[0092]在基線特征方面，組間無顯著性差異。21.5%被分類為以腹瀉為主的IBS，19.8%分類為以便秘為主的IBS，58.7%分類為交替者，雙歧桿菌和安慰劑組之間無顯著性差異。
[0093]人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)在治療組之間得到很好的平衡，具有約67%的女性患者，平均體重為71kg，對應(yīng)于體重指數(shù)為24。安慰劑組中的患者平均41歲，而雙歧桿菌組中的患者平均37歲(表1)。
[0094]
【權(quán)利要求】
1.一種作為益生菌用于食品中和/或用作藥物的兩歧雙歧桿菌菌株或其突變體或變異體，該菌株是以保藏號DSM24514保藏的兩歧雙歧桿菌MIMBb75或其突變體或變異體。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株、突變體或變異體，其作為益生菌用于食品中和/或用作藥物以用于預(yù)防和/或治療與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎性活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少和/或胃腸道的腸屏障功能障礙相關(guān)的疾病，或用于減輕、預(yù)防和/或治療患有腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化失調(diào)、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感和/或其組合的受試者，或用于改善患者的生活質(zhì)量。
3.如權(quán)利要求2所述的菌株、突變體或變異體，其中，所述疾病選自腸易激運(yùn)動、炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、儲袋炎或感染后結(jié)腸炎、胃腸癌、全身性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障礙、由不希望的炎性活性引起的腹瀉病如艱難梭菌相關(guān)腹瀉、抗生素相關(guān)腹瀉、輪狀病毒相關(guān)腹瀉或感染后腹瀉，以及它們的組合。
4.一種包含如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的菌株、突變體或變異體的益生菌制劑，其優(yōu)選地作為益生菌用于食品中和/或用作藥物。
5.如權(quán)利要求4所述的益生菌制劑，其進(jìn)一步包含至少一種益生素，任選地至少包含菊粉和/或果糖寡糖。
6.如權(quán)利要求4或5所述的益生菌制劑，其進(jìn)一步包含至少一種藥學(xué)上可接受的化合物、可攝取的載體、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物和/或蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和/或微量元素；任選地，所述至少一種藥學(xué)上可接受的化合物是選自一種或多種維生素如B族維生素、一種或多種礦物質(zhì)如鈣或鎂、一種或多種碳水化合物如乳糖、麥芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麥芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物的成員。
7.如權(quán)利要求6所述的 方法，其中，所述可攝取的載體是膠囊、片劑、粉末或食物產(chǎn)品；任選地，該食物產(chǎn)品是乳制品、酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、奶粉、濃縮乳、涂抹干酪、調(diào)料或飲料。
8.如權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的益生菌制劑，其中，所述菌株、突變體或變異體以每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品超過IO1Cfu,任選地每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品不小于102、103、104、IO5或IO6Cfu存在。
9.如權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)所述的益生菌制劑，其中，對患者施用的所述菌株、突變體或變異體的每日量不小于每個(gè)膠囊或片劑或每單位粉末或食物產(chǎn)品IO1Cfu,任選地不小于 IO2UO3UO4UO5 或 IO6CfUo
10.如權(quán)利要求4至9中任一項(xiàng)所述的益生菌制劑，其作為益生菌用于食品中和/或用作藥物以用于預(yù)防和/或治療與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎性活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少和/或胃腸道的腸屏障功能障礙相關(guān)的疾病，和/或用于減輕、預(yù)防和/或治療患有腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化失調(diào)、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感和/或其組合的受試者。
11.如權(quán)利要求10所述的益生菌制劑，其中，所述疾病選自腸易激運(yùn)動、炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、儲袋炎或感染后結(jié)腸炎、胃腸癌、全身性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障礙、由不希望的炎性活性引起的腹瀉病如艱難梭菌相關(guān)腹瀉、抗生素相關(guān)腹瀉、輪狀病毒相關(guān)腹瀉或感染后腹瀉，以及它們的組合。
12.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的菌株、突變體或變異體或如權(quán)利要求4至11中任一項(xiàng)所述的益生菌制劑作為益生菌用于食品中和/或用作藥物以用于預(yù)防和/或治療與胃腸道功能紊亂相關(guān)、與不希望的胃腸炎性活性相關(guān)、與腸道菌群失衡、胃腸道中雙歧桿菌的減少和/或胃腸道的腸屏障功能障礙相關(guān)的疾病，和/或用于減輕、預(yù)防和/或治療患有腹痛、不適、腹脹、氣脹、消化失調(diào)、排便急迫和/或排便次數(shù)減少和/或增加、不完全排空感和/或其組合的受試者中的用途。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述疾病選自腸易激運(yùn)動、炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、儲袋炎或感染后結(jié)腸炎、胃腸癌、全身性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障礙、由不希望的炎性活性引起的腹瀉病如艱難梭菌相關(guān)腹瀉、抗生素相關(guān)腹瀉、輪狀病毒相關(guān)腹瀉或感染后腹瀉，以及它們的組口 ο
14.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求4至11中任一項(xiàng)所述的益生菌制劑的方法，至少包括以下步驟: a)在富含蛋白質(zhì)的液體生長培養(yǎng)基中發(fā)酵和/或生長如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的菌株， b)通過細(xì)胞的離心、穩(wěn)定化 、冷凍干燥、研磨和過篩來收獲細(xì)胞， c)任選地混合/摻混細(xì)胞與益生素、藥學(xué)上可接受的化合物、佐劑、細(xì)菌成分、藥物實(shí)體、生物化合物、蛋白質(zhì)和/或肽中的一個(gè)或多個(gè)成員，和 d)將步驟b)的細(xì)胞或步驟c)的混合物引入可攝取的載體中。
【文檔編號】A61K35/74GK103476273SQ201280012521
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月31日
【發(fā)明者】S·古列爾梅蒂, D·莫拉 申請人:納圖爾沃爾制藥有限責(zé)任公司