一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗的制備方法

一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗的制備方法，所述方法，包括如下步驟：將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行降解；降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結(jié)合，隨后制成疫苗制劑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種疫苗的制備，特別涉及一種肺炎多糖蛋白結(jié)合疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)可引起鼻竇炎、中耳炎、氣管炎和肺炎等非侵襲性感染以及膿毒癥和腦膜炎等侵襲性感染，是一種引起所有年齡組高發(fā)病率和病死率的主要致病菌。在兒童呼吸系統(tǒng)中，肺炎發(fā)病率居第二位。世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，每年死于肺炎鏈球菌感染的160萬(wàn)人中，約有60%人群為5歲以下兒童?？梢?jiàn)，肺炎鏈球菌堪稱(chēng)威脅兒童健康的“頭號(hào)殺手”。目前，中國(guó)是全世界發(fā)病率高的五個(gè)亞洲國(guó)家之一 O
[0003]在中國(guó)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，由于抗生素的過(guò)度使用，目前肺炎球菌對(duì)于紅霉素和青霉素等常見(jiàn)抗菌素的耐藥性正在升高，《應(yīng)高度重視兒童肺炎的預(yù)防措施)一文中提到例如血清6型對(duì)紅霉素的耐藥性已經(jīng)達(dá)到百分之百。因此，接種肺炎球菌結(jié)合疫苗，是預(yù)防兒童患上肺炎球菌疾病的最佳方式。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)上市的肺炎球菌結(jié)合疫苗產(chǎn)品主要有輝瑞的7價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗(PCV7)，商品名為Prevenar，包含7種血清型的肺炎鏈球菌，分別為4，6B，9V，14，18C，19F和23F。PCV7的使用， 降低了兒童侵襲性肺炎鏈球菌疾病(IB))的整體發(fā)病率。但是由于該疫苗價(jià)格昂貴，接種四針需要花費(fèi)3000多人民幣，這或許會(huì)使許多家長(zhǎng)望而卻步，放棄對(duì)孩子的接種。另一方面流行病學(xué)調(diào)查顯示，PCV7在美國(guó)和歐洲的覆蓋率為86%和74%，而在亞洲的覆蓋率僅為 43% ,參見(jiàn) World Health Orgnization.Pneumococcal conjugatedvaccine for childhood immunization-WHO position paper.WklyEpidemiol Recj2007，82(12): 93-104。而且廣泛使用PCV7后的檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，非疫苗覆蓋血清型引起的IB)發(fā)病率持續(xù)升高，例如19A，在美國(guó)，2000-2005年由19A引起的侵襲性肺炎鏈球菌疾病的增長(zhǎng)超過(guò)330%。這種血清型替代可能消弱PCV7帶來(lái)的益處。因此，開(kāi)發(fā)價(jià)格適中并且適用中國(guó)國(guó)情的肺炎球菌結(jié)合疫苗迫在眉睫。
[0005]由于肺炎鏈球菌莢膜多糖分子量大多大于lOOOKDa，且粘度較大，在與蛋白結(jié)合過(guò)程中容易交聯(lián)形成分子量更大的結(jié)合物凝膠，不利于分離純化，亦不利于控制多糖蛋白結(jié)合物中的蛋白與多糖的質(zhì)量比。因此，需要將純化的莢膜多糖進(jìn)行水解處理。世界專(zhuān)利WO 2008/079732 A2，提到可以用醋酸對(duì)18C型和3型莢膜多糖進(jìn)行降解，其他專(zhuān)利如WO2007/071707 A2提到可以用微流體化法對(duì)多糖進(jìn)行降解。但上述方法對(duì)于某些特殊的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分離效果不佳，如在用醋酸對(duì)9V型和4型多糖進(jìn)行酸水解過(guò)程中，導(dǎo)致9V型和4型多糖的抗原性丟失，表現(xiàn)為免疫雙擴(kuò)結(jié)果為陰性。
[0006]莢膜多糖的理化性質(zhì)和生物活性與分子量及分子量分布有很大的關(guān)系。因此，在質(zhì)量控制中，分子量是一個(gè)重要的指標(biāo)。對(duì)于多糖類(lèi)化合物，其分子量的描述和測(cè)定都較小分子困難得多。目前，傳統(tǒng)的測(cè)定多糖分子量的方法是通過(guò)分子量標(biāo)準(zhǔn)品校正曲線來(lái)確定分子量大小以及分子量的分布。這些方法存在的問(wèn)題在于，當(dāng)所測(cè)樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與分子量標(biāo)準(zhǔn)品不同時(shí)，會(huì)給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)明顯的誤差。參見(jiàn)Wang W，Bo S，Li S, et al.Determination of the Mark-Houwink equation for chitosan with different degreesof deacctylation.1nt J Biol Macromolj 1991, 13:281 □本發(fā)明釆用高效凝膠體積排阻色譜(SEC)與多角度激光散射(MALLS)檢測(cè)器、示差折光(RI)檢測(cè)器聯(lián)用增加了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。該方法可以直接反應(yīng)各型多糖的絕對(duì)分子量大小，不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)條件的影響。操作更加簡(jiǎn)捷，提高了工作效率。
[0007]本發(fā)明的目的之一在于提供一種多價(jià)或者13價(jià)肺炎多糖結(jié)合疫苗。其中13價(jià)疫苗含有13種血清型，分別為1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，23F。較目前上市的7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗提供更廣泛的保護(hù)，而且成本經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明的目的之二在于公開(kāi)一種莢膜多糖的水解方法——超聲降解，這種方法簡(jiǎn)便易操作，且容易線性放大，多糖回收率達(dá)到90%以上。本發(fā)明的目的之三在于應(yīng)用一種莢膜多糖分子量的測(cè)定方法一多角度激光散射法，該方法簡(jiǎn)便快速，可以準(zhǔn)確獲得分子量大小以及多糖的分散度等信息；本發(fā)明的目的之四在于提供一種多糖蛋白結(jié)合物的制備方法，CDAP活化多糖，該方法簡(jiǎn)便，結(jié)合效率高。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0008]本發(fā)明公開(kāi)了一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗，該疫苗可以是單價(jià)，也可以是多價(jià)，優(yōu)選的是13價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗，所述13價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗，其中的肺炎鏈球菌莢膜多糖選自血清型為1，3，4，5，6A，6B, 7F，9V,14，18C，19A，19F，23F的肺炎鏈球菌產(chǎn)生的莢膜多糖，結(jié)合疫苗中的載體蛋白為CRM197蛋白或TT蛋白。
[0009]肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗的制備方法很多，但本發(fā)明通過(guò)研究，找到一種新的肺炎鏈球菌莢膜多糖 蛋白結(jié)合疫苗的制備方法，所述方法，包括如下步驟:
[0010]一，將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行降解；
[0011]二，肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白的結(jié)合；
[0012]三，結(jié)合疫苗的純化。
[0013]其中，所述提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行制備或從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)得到，如通過(guò)培養(yǎng)肺炎鏈球菌，滅活，提取滅活的肺炎鏈球菌莢膜多糖以及對(duì)其進(jìn)行純化的方式得到。
[0014]其中，所述肺炎鏈球菌莢膜多糖的降解方法，包括如下步驟:
[0015]I)將血清型莢膜多糖溶于二純水中，制備成濃度為l_4mg/ml的溶液，低溫充分溶解；
[0016]2)冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20_40kHz的超聲波處理溶液，處理時(shí)間為10-30min，冷凍干燥；
[0017]3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小，待分子量降解至目標(biāo)大小為50KDa-500KDa時(shí)得降解多糖。
[0018]優(yōu)選的降解方法，包括如下步驟:
[0019]I)將莢膜多糖溶于二純水中，制備成濃度為l_2mg/ml的溶液，4°C充分溶解；
[0020]2)冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20kHz的超聲波處理溶液。處理時(shí)間為10_30min ；
[0021]3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小為80KDa_300KDa。
[0022]其中，所述肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白的結(jié)合的方法；包括如下步驟:
[0023]I)取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，溶解于溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液；[0024]2)向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP( 1-氰基_4_ 二甲氨基-吡啶四氟硼酸)乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質(zhì)量比為0.5-1.5:1，維持lmin-3min ；
[0025]3)加入 0.3M NaOH調(diào)節(jié) pH 至 9-10，維持 l_5min，加入濃度為 2-lOmg/ml 的 CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質(zhì)量比為1-1.5:1，維持pH9.5，室溫反應(yīng)l_2h，加入2M甘氨酸終止反應(yīng)，2-8°C緩慢攪拌6-18h。
[0026]4)利用Sepharose 4FF層析介質(zhì)對(duì)結(jié)合物分別進(jìn)行純化:用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時(shí)具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物，0.22um無(wú)菌過(guò)濾后，2-8°C存放；
[0027]5)將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規(guī)技術(shù)制備成疫苗制劑。
[0028]優(yōu)選的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白的結(jié)合的方法；包括如下步驟:
[0029]I)取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，溶解于二純水、2M NaCl或者0.2M NaCl溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液；
[0030]2)向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質(zhì)量比為1:1，維持1.5min-2min ；
[0031]3)加入0.3M NaOH調(diào)節(jié)pH至9.5，維持l-5min，加入溶度為5mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質(zhì)量比為1.2:1，維持pH9.5，室溫反應(yīng)l_2h，加入2M甘氨酸終止反應(yīng)，2-8 °C緩慢攪拌6-18h;
[0032]4)利用Sepharose 4FF層析介質(zhì)對(duì)結(jié)合物分別進(jìn)行純化:用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時(shí)具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為單價(jià)結(jié)合物原液。0.22um無(wú)菌過(guò)濾后，4 °C放置；
[0033]5)將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規(guī)技術(shù)制備成疫苗制劑。
[0034]以上制備方法適用于本發(fā)明所述的13種肺炎鏈球菌莢膜多糖中的任意一種，若制備成多價(jià)疫苗，則按照比例將按照前4步制備得到的各型單價(jià)結(jié)合物混合，加入適量藥用輔料，制備成多價(jià)肺炎多糖蛋白結(jié)合疫苗，必要時(shí)加入鋁佐劑。對(duì)于多價(jià)疫苗，其中各型多糖的濃度為4-8ug/ml,優(yōu)選的是4ug/ml。
[0035]其中，肺炎鏈球菌莢膜多糖的制備方法，可以為:
[0036]肺炎鏈球菌的培養(yǎng)，方法如下:
[0037]在發(fā)酵罐中接種單菌型肺炎鏈球菌菌株后，pH控制在6.5-8.0,轉(zhuǎn)速50_200r/min，培養(yǎng)開(kāi)始階段采用從發(fā)酵罐底部通壓縮氣體，溶氧量控制在1-10%，當(dāng)發(fā)酵液菌濃(0D600nm)達(dá)到0.5-1時(shí)，改變通氣方式為從發(fā)酵罐的頂部通壓縮氣體，溶氧控制在
0.01-2%，當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到2-2.5時(shí)，適量補(bǔ)充碳源，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體生長(zhǎng)的平臺(tái)期后滅活菌體。[0038]肺炎鏈球菌莢膜多糖的提取，方法如下:
[0039]所述肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的提取中，優(yōu)選的步驟是:
[0040]a、取滅活后的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，去除菌體、菌體碎片及培養(yǎng)液中的小分子成分，得濃縮液；
[0041]b、濃縮液緩慢加入乙醇至終濃度為15-35%后，2_8°C靜置過(guò)夜；
[0042]C、所得靜置液離心去除沉淀，上清繼續(xù)加乙醇至終濃度為60-90%后，2-8°C靜置過(guò)夜；[0043]d、所得靜置液離心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液復(fù)溶后，離心去除沉淀，所得上清即為粗糖溶液；
[0044]肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的精制，方法如下:
[0045]所得粗糖溶液，采用S印harose 4 Fast Flow分子篩排阻層析分離，按照各個(gè)型別的肺炎多糖在歐洲藥典5.0版中的標(biāo)準(zhǔn)收集大分子多糖；分離后的多糖采用30kDa超濾膜包脫鹽，再經(jīng)冷凍干燥后即得肺炎鏈球菌莢膜多糖。
[0046]優(yōu)選的制備方法為:
[0047]取肺炎鏈球菌某型工作種子，接種于含10%脫纖維羊血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，370C ±1°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。驗(yàn)證無(wú)污染物。
[0048]將上述培養(yǎng)物刮下，接種在數(shù)個(gè)IL (培養(yǎng)基裝量500ml)三角瓶中，于37°C ±2°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-20h，于此過(guò)程中監(jiān)測(cè)菌體密度(600nm)。當(dāng)菌體密度達(dá)到2.0-2.5時(shí)，采用平板劃線和鏡檢方法驗(yàn)證無(wú)污染物發(fā)生。
[0049]將1.5L上述培養(yǎng)物接種到50L發(fā)酵罐(裝量30L)中，培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度370C ±2°C，pH維持在7.2±0.2，轉(zhuǎn)速100r/min。接種后，培養(yǎng)開(kāi)始階段采用從發(fā)酵罐底部通壓縮空氣的通氣方式，溶氧量控制在1_10%，較優(yōu)的3-7%，更優(yōu)的5%。培養(yǎng)過(guò)程檢測(cè)菌濃(0D600nm)o當(dāng)菌濃達(dá)到0.5-1時(shí)，將通氣方式改成從發(fā)酵罐的頂部通壓縮空氣(表面通氣)的通氣方式，溶氧量控制在0-2%，較優(yōu)的0.1-1%，更優(yōu)的0.2%。當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到2-2.5，補(bǔ)充600ml 50%的葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體生長(zhǎng)的平臺(tái)期，加入終濃度0.5%的苯酚滅活菌體。繼而進(jìn)入莢膜多糖提取工藝階段。
[0050]肺炎鏈球菌莢膜多糖的提取
[0051]上述已滅活的培養(yǎng)液，采用15000g離心30min去除菌體及菌體碎片，上清液進(jìn)一步采用微濾或深層過(guò)濾的方式去除殘余的顆粒性物質(zhì)。澄清后的溶液采用IOOkDa的超濾系統(tǒng)濃縮并去除培養(yǎng)液中的小分子成分，最終得濃縮液約3L。
[0052]分步醇沉:上述濃縮液邊攪拌邊緩慢加入預(yù)冷無(wú)水乙醇，每100ml濃縮液加入33.3ml無(wú)水乙醇，充分混勻后4°C靜置過(guò)夜。15000g離心30min去除沉淀，上清繼續(xù)邊攪拌邊緩慢補(bǔ)加乙醇至終濃度80%，充分混勻后4°C靜置過(guò)夜。15000g離心30min收集沉淀，沉淀采用0.2M NaCl溶液600ml復(fù)溶。15000g離心30min去除沉淀得上清，即為粗多糖溶液。
[0053]分子篩排阻層析分離:上述上清采用分子篩排阻層析S^harose CL-4B(其他分子篩排阻層析填料 Sephacryl S-200、Sepharose 4 Fast Flow>Superdex 200 等也可以米用)分離，紫外檢測(cè)器(波長(zhǎng)206nm)和示差檢測(cè)器監(jiān)測(cè)樣品峰，收集相對(duì)分子量kd ( 0.20的樣品峰。分離后的多糖樣品采用30kDa超濾膜包脫鹽，再經(jīng)冷凍干燥后即得精制多糖，精制多糖產(chǎn)量為90-120mg/L發(fā)酵液。精制多糖存于_20°C以下冰箱中。精制多糖在層析柱上的分布情況為在206nm下有較高吸收峰的情況下，280nm下吸收值(主要代表蛋白峰)非常低，可見(jiàn)提取的多糖具有較高的純度。
[0054]精制多糖特征鑒定
[0055]生化鑒定項(xiàng)目及方法參見(jiàn)歐洲藥典5.0 ；
[0056]采用IH-NMR對(duì)精制多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征分析；
[0057]采用Pnl9F特異性血清(購(gòu)自丹麥國(guó)家血清研究所)利用免疫雙擴(kuò)散或反向電流免疫電泳對(duì)精制多糖進(jìn)行鑒定；
[0058]米用分子篩排阻層析(Sepharose CL-4B或Sepharose CL-2B)測(cè)定精制多糖的相
對(duì)分子量。
[0059]本發(fā)明還提供一種利用MALLS準(zhǔn)確測(cè)定13種莢膜多糖分子量的方法。實(shí)施過(guò)程如下:
[0060]a將超聲降解后的多糖配制成濃度為l_4mg/ml水溶液，
[0061]b利用SEC-R1-MALLS聯(lián)用技術(shù)以0.2M NaCl為流動(dòng)相，SRT-SEC 1000A為色譜分離柱，在流速0.5 mL柱溫30 °C的條件下對(duì)超聲降解后多糖水溶液進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)器為多角度激光檢測(cè)器(MALLS)以及示差折光檢測(cè)儀(RI)。
[0062]c對(duì)降解后多糖的分子量及分子量分布的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0063]I 型平均分子量 Mw 為:120.3-132.3KDa, Mw/Mn=l.21
[0064]3 型平均分子量 Mw 為:84.0-120.5KDa, Mw/Mn=l.18
[0065]4 型平均分子量 Mw 為:124.4-138.2KDa, Mw/Mn=l.24
[0066]5 型平均分子量 Mw 為:104.2-153.2KDa, Mw/Mn=l.26
[0067]6A 型平均分子量 Mw 為:215.8-325.2KDa, Mw/Mn=l.20
[0068]6B 型平均分子量 Mw 為:326.3-456.3KDa, Mw/Mn=l.25
[0069]7F 型平均分子量 Mw 為:318-425.3KDa, Mw/Mn=l.21
[0070]9V 型平均分子量 Mw 為:212.7-322.3KDa, Mw/Mn=l.32
[0071]14 型平均分子量 Mw 為:231.2-321.2KDa, Mw/Mn=l.25
[0072]18C 型平均分子量 Mw 為:111.8-232.2KDa, Mw/Mn=l.22
[0073]19A 型平均分子量 Mw 為:133.7-213.2KDa, Mw/Mn=l.29
[0074]19F 型平均分子量 Mw 為:168.8-320.0KDa, Mw/Mn=l.36
[0075]23F 型平均分子量 Mw 為:182.3-236.0KDa, Mw/Mn=l.28
[0076]d所述Mw為聞分子的重均分子量，Mw/Mn表不聞分子的分子量分布。
[0077]與現(xiàn)有肺炎結(jié)合疫苗相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0078]I，本發(fā)明較PCV7又分別增加了 6種血清型肺炎鏈球菌:包括1，3，5，6A，7F和19A，組成13價(jià)的肺炎多糖結(jié)合疫苗，覆蓋率提高，交叉保護(hù)率提高至90%以上；
[0079]2，本發(fā)明采用的多糖降解方法，使降解后的多糖黏度降低，分子大小更加均一，有利于結(jié)合物的分離純化以及結(jié)合物的質(zhì)量控制。降解后的莢膜多糖利用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)活化多糖形成氰酯鍵，然后與CRM197蛋白形成共價(jià)鍵。該方法簡(jiǎn)單易操作、結(jié)合效率高、獲得的結(jié)合物的穩(wěn)定性良好。
[0080]3，超聲降解13種莢膜多糖的方法，該方法簡(jiǎn)單、易操作、容易實(shí)現(xiàn)線性放大、回收率高、在保留多糖的抗原完整性的基礎(chǔ)上能夠使多糖的分子量分布趨于均一。能夠很好的滿足產(chǎn)業(yè)化需求。
【具體實(shí)施方式】:
[0081]實(shí)施例1
[0082]7F超聲降解:
[0083]a 稱(chēng)取7F多糖250mg，加入二純水，制備成濃度為2.5mg/ml的溶液，4°C過(guò)夜溶解。在冰浴中，用功率為80-100W，頻率為20kHz的超聲波處理溶液，處理時(shí)間為23min。
[0084]b冷凍干燥
[0085]c利用SEC-R1-MALLS聯(lián)用技術(shù)以0.2M NaCl為流動(dòng)相，SRT-SEC 1000A為色譜分離柱，在流速0.5 mL柱溫30 °C的條件下對(duì)超聲降解后多糖進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)器為多角度激光檢測(cè)器(MALLS)以及示差折光檢測(cè)儀(RI )。
[0086]d結(jié)果如下表
[0087]表1 7F型多糖降解前后的質(zhì)量比較
【權(quán)利要求】
1.一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗的制備方法，包括將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行降解；降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結(jié)合，隨后制成疫苗制劑的步驟，其特征在于，其中降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結(jié)合，隨后制成疫苗制劑，包括以下步驟: O取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，溶解于溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液； 2)向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質(zhì)量比為0.5-1.5:1，維持lmin-3min ； 3)加入0.3M NaOH調(diào)節(jié)pH至9-10，維持l_5min，加入濃度為2-10mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質(zhì)量比為1-1.5:1，維持pH9.5，室溫反應(yīng)l_2h，加入2M甘氨酸終止反應(yīng)，2-8°C緩慢攪拌6-18h ； 4)利用Sepharose4FF層析介質(zhì)對(duì)結(jié)合物分別進(jìn)行純化:用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時(shí)具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為單價(jià)結(jié)合物原液；0.22um無(wú)菌過(guò)濾后，2-8 °C存放； 5)將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規(guī)技術(shù)制備成疫苗制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結(jié)合，隨后制成疫苗制劑包括以下步驟: 1)取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別溶解于二純水、2MNaCl或者0.2M NaCl溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液； 2)向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質(zhì)量比為1:1，維持1.5min-2min ； 3)加入(λ3M NaOH調(diào)節(jié)pH至9.5，維持l-5min，加入溶度為5mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質(zhì)量比為1.2:1，維持pH9.5，室溫反應(yīng)l_2h，加入2M甘氨酸終止反應(yīng)，2-8 °C緩慢攪拌6-18h; 4)利用Sepharose4FF層析介質(zhì)對(duì)結(jié)合物分別進(jìn)行純化:用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時(shí)具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為單價(jià)結(jié)合物原液；0.22um無(wú)菌過(guò)濾后，4 °C放置； 5)將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規(guī)技術(shù)制備成疫苗制劑。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述CRM197蛋白可用TT蛋白代替。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行降解，方法如下: 1)將不同的血清型莢膜多糖分別溶于二純水中，制備成濃度為l_4mg/ml的溶液，低溫充分溶解； 2)冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20-40kHz的超聲波處理溶液；處理時(shí)間為10-30min，冷凍干燥； 3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小，待分子量降解至目標(biāo)大小為50KDa-500KDa時(shí)得降解多糖。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行降解，方法如下: 1)將不同的血清型莢膜多糖分別溶于二純水中，制備成濃度為l_2mg/ml的溶液，4°C充分溶解； 2)冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20kHz的超聲波處理溶液；處理時(shí)間為10_30min ； 3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小為80KDa-300KDa。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述疫苗制劑為多價(jià)疫苗制劑，其中的肺炎鏈球菌莢膜多糖選自血清型為I, 3，4，5，6A，6B, 7F，9V, 14，18C，19A，19F，23F中的幾種肺炎鏈球菌產(chǎn)生的莢膜多糖。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述疫苗制劑為13價(jià)疫苗制劑，其中的肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型為I, 3，4，5，6A，6B, 7F，9V, 14，18C，19A，19F，23F的肺炎鏈球菌產(chǎn)生的莢膜多糖。
8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，制備多價(jià)疫苗制劑，則將按照前4步制備得到的各型單價(jià)結(jié)合物按照比例混合，加入藥用輔料，必要時(shí)加入鋁佐劑，制備成多價(jià)肺炎多糖蛋白結(jié)合疫苗制劑。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，對(duì)于多價(jià)疫苗，其中結(jié)合物混和后，各單價(jià)多糖的濃度為4-8ug/ml。
10.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，對(duì)于多價(jià)疫苗，結(jié)合物混和后，各單價(jià)多糖的濃度均為4ug/ml。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK103830723SQ201210491658
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月26日
【發(fā)明者】趙秋敏, 孫倩, 李軍強(qiáng), 金永杰, 李亞冰, 劉賀軍, 曹小丹, 李靜, 李劍 申請(qǐng)人:天士力制藥集團(tuán)股份有限公司