專利名稱：一種具有提高人nk及nkt細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)與基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽(簡稱HA-FC)及其在抗腫瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中主要的免疫細(xì)胞，在清除腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞中，T細(xì)胞的CTL發(fā)揮著重要的作用。但是CTL作用的前提是腫瘤或病毒抗原必須與自身細(xì)胞表面的MHC I類結(jié)合并遞呈在細(xì)胞表面后才能被T細(xì)胞識(shí)別繼而被T細(xì)胞清除，即所謂的MHC限制。然而，多數(shù)的腫瘤細(xì)胞以及部分病毒感染細(xì)胞為了逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視，其細(xì)胞表面的MHC I類表達(dá)通常都明顯下調(diào)甚至消失(稱之為“缺失自我”)。此時(shí)，T細(xì)胞就無法發(fā)揮作用，機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫清除功能則主要由NK細(xì)胞來承擔(dān)。與殺傷性T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞的殺傷活性不需誘導(dǎo)即可直接殺滅腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞。因此，NK細(xì)胞在腫瘤的過繼免疫治療上，有著廣泛的應(yīng)用前景。NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用與T細(xì)胞的CTL細(xì)胞毒作用不同，NK的細(xì)胞毒作用不需要腫瘤抗原與MHC結(jié)合，就能夠立即殺滅腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞。它的活性依靠其細(xì)胞表面的受體與靶細(xì)胞表面的配體相互作用來實(shí)現(xiàn)，這種激活是非特性的激活。此外，NK細(xì)胞還是連接特異性免疫與非特異性免疫的橋梁?？贵w介導(dǎo)的特異性殺傷作用在NK細(xì)胞的抗腫瘤與抗病毒中也具有重要的作用。NK細(xì)胞通過自身表面的CD16與特異性抗體的Fe段結(jié)合，發(fā)揮ADCC作用(“抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”，antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity)。在抗體介導(dǎo)的ADCC作用過程中，抗體能與祀細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，而NK細(xì)胞可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，NK細(xì)胞等對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的。在抗腫瘤與抗病毒免疫中，通過ADCC的效應(yīng)，能使NK的抗腫瘤、抗病毒活性發(fā)揮更高、更強(qiáng)的效能。NK細(xì)胞與NKT細(xì)胞具有類似的抗腫瘤活性，但兩種細(xì)胞來源不同NKT來源于T淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞直接由淋巴系干細(xì)胞分化而來。表面標(biāo)記上NK細(xì)胞為⑶56陽性、⑶3陰性；NKT為CD56陽性、CD3陽性。噬菌體隨機(jī)肽庫是一種有效尋找能與某一特定目標(biāo)蛋白特異結(jié)合的蛋白并確定其氨基酸序列的技術(shù)方法。曬菌體隨機(jī)肽庫有商品化的產(chǎn)品，篩選的結(jié)果取決于包被在96孔板上的目標(biāo)蛋白。商品化的噬菌體隨機(jī)肽庫是由上億種氨基酸隨機(jī)排列的短肽與噬菌體外殼蛋白在基因水平進(jìn)行連接后，以融合蛋白的形式表達(dá)(呈現(xiàn))在噬菌體表面的多肽。庫中上億種多肽分別呈現(xiàn)在上億個(gè)噬菌體表面，眾多重組型噬菌體便組成了噬菌體隨機(jī)肽庫。隨機(jī)肽庫所用的噬菌體為絲狀噬菌體。噬菌體隨機(jī)肽庫含有的大量不同序列結(jié)構(gòu)多肽可作為篩選與任何靶蛋白表位結(jié)合的模擬肽。利用噬菌體肽庫技術(shù)已經(jīng)確定了許多蛋白分子的相互作用位點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明依據(jù)NK細(xì)胞借助抗體發(fā)揮ADCC作用的理論，首先，通過噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)，分別篩選到了一條能與腫瘤抗原“天冬酰胺羥化酶”(腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的一種抗原，廣泛存在于各種惡性腫瘤細(xì)胞中)特異結(jié)合的多肽Gln His He Arg Glu Leu Pro Tyr ThrGly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr ;以及一條能與 CD16特異結(jié)合的多妝Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn GluAsp Pro tyr Thr。在此基礎(chǔ)上,通過人工肽合成的方式,將這兩條肽的特點(diǎn)(氨基酸序列)合成在一條完整的肽鏈上，即本發(fā)明所指的多肽HA-FC。該多肽的氨基端具有模擬抗體的功能，能與腫瘤抗原“天冬酰胺羥化酶”特異結(jié)合；多肽的羧基端則模擬抗體的Fe段功能，能夠與NK細(xì)胞上的CD16分子結(jié)合。通過HA-FC多肽的橋梁作用，NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞更貼近、結(jié)合更加牢固，最終使NK細(xì)胞通過釋放穿孔素與顆粒酶殺傷腫瘤細(xì)胞的效率更高。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是獲得了(篩選到了)能與天冬酰胺羥化酶特異結(jié)合的肽序列和能與CD16結(jié)合的肽序列。申請(qǐng)者采用噬菌體隨機(jī)肽庫的方法，分別以天冬酰胺羥化酶以及CD16為目標(biāo)蛋白，對(duì)噬菌體肽庫中能與天冬酰胺羥化酶結(jié)合的克隆以及肽庫中能與CD16結(jié)合的克隆分別進(jìn)行了篩選。篩選所用的目標(biāo)蛋白是采用人工合成的天冬酰胺羥化酶肽段以及人工合成的⑶16肽段，以這兩種合成的多肽分別包被96孔板進(jìn)行篩選。本發(fā)明的目的在于公開了一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于公開了具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽，其中，所述多肽的序列如序列表I所示。一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽，其中，所述多肽包括如序列表I所示的多肽序列。一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽，其中，所述多肽為在序列表I所示序列中插入其他氨基酸后與序列表I所示序列保持80%以上同源性的多肽。上述技術(shù)方案所述的具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)，篩選到了能與天冬酰胺羥化酶特異結(jié)合的肽進(jìn)而獲得了其氨基酸序列信息(Gin His He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser AlaArg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr)。應(yīng)用卩遼菌體隨機(jī)肽庫技術(shù),篩選到了能與⑶16特異結(jié)合的肽進(jìn)而獲得了其氨基酸序列信息(lie Asn Pro Ala Trp Phe Ala TyrGly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr)。依據(jù)這兩條肽的氨基酸序列信息，隨后人工合成出了一條多妝Gln His He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser AlaArg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Gly Gly Ser He Asn Pro Ala Trp PheAla Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr(對(duì)應(yīng)序列的符號(hào)為QHIRELPYTGGSARHYGSSYYFDYGGSINPAWFAYGGSQQSNEDPYT)，其一端(氨基端)能與腫瘤抗原“天冬酰胺羥化酶”特異結(jié)合，另一端(羧基端)又能與NK及NKT細(xì)胞表面CD16分子特異結(jié)合。通過體外抗腫瘤活性的比較，確認(rèn)該多肽(以下簡稱HA-FC)具有明顯的增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。該多肽鏈中能與“天冬酰胺羥化酶”特異結(jié)合的氨基端序列為Gln HisHe Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr PheAsp Tyr ;能與⑶16特異結(jié)合的肽羧基端序列為Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr GlyGly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr。本發(fā)明具有以下有益效果I、本發(fā)明多肽的氨基端能與腫瘤抗原“天冬酰胺羥化酶”特異結(jié)合；其羧基端能夠與NK細(xì)胞上的CD16分子結(jié)合，通過該多肽的橋梁作用，NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞更貼近、結(jié)合更加牢固，最終使NK細(xì)胞通過釋放穿孔素與顆粒酶殺傷腫瘤細(xì)胞的效率更高。2、將本發(fā)明的多肽應(yīng)用于腫瘤的治療時(shí)可使人NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性提高20%以上；分別給腫瘤動(dòng)物模型注射該多肽時(shí)，動(dòng)物腫瘤模型上的瘤體明顯縮小。
圖I為能與天冬酰胺羥化酶結(jié)合的第一株噬菌體克隆DNA序列測定圖；圖2為能與天冬酰胺羥化酶結(jié)合的第二株噬菌體克隆DNA序列測定圖；圖3為能與⑶16結(jié)合的第三株噬菌體克隆DNA序列測定圖；圖4為能與⑶16結(jié)合的第四株噬菌體克隆DNA序列測定圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明所述的多肽(以下簡稱“HA-FC”)作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I :一、隨機(jī)肽庫的篩選PH. D.-12卩遼菌體隨機(jī)肽庫試劑盒購自美國NewEngland Biolabs公司。用于篩選的靶標(biāo)蛋白分別為天冬酰胺羥化酶第61 —100位的氨基酸序列人工合成肽；人CD16第11-50位的氨基酸序列人工合成肽。篩選方法參照噬菌體肽庫產(chǎn)品的說明書進(jìn)行。篩選的噬菌體克隆，經(jīng)序列測定，確定其基因序列并推導(dǎo)出其能與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的蛋白氨基酸序列。將能與天冬酰胺羥化酶結(jié)合的2株噬菌體克隆，測序，如圖I和圖2所示，獲得的第一株噬菌體克隆的基因序列如序列表2所示為CAG CAC ATT CGA GM CTC CCA TAC ACC,第二株噬菌體克隆的基因序列如序列表4所示為GCT CGT CAC TAT GGC TCC TCC TAT TATTTC GAC TAT ;推導(dǎo)的氨基酸序列分別為Gln His He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr (序列表3 所不)和 Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr (序列表 5 所不)。通過連接子 Gly-Gly-Ser 將 Gln His He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr 與 Ala Arg His Tyr GlySer Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr連接,獲得了能與天冬酰胺輕化酶結(jié)合的氨基酸序列GlnHis He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr TyrPhe Asp Tyr (序列表10所示)。將能與⑶16結(jié)合的2株噬菌體克隆，測序，如圖3和圖4所示，獲得的第三株噬菌體克隆的基因序列如序列表6所示為ATT AAC CCC GCA TGG TTT GCT TAT，第四株噬菌體克隆的基因序列如序列表8所示為CAA CAA TCT AAT GAA GAT CCA TAC ACA ;推導(dǎo)的氨基酸序列為Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr (如序列表 7 所不)和 Gln Gln Ser Asn GluAsp Pro Tyr Thr (如序列表 9 所不)。通過連接子 Gly-Gly-Ser 將 lie Asn Pro Ala TrpPhe Ala Tyr 和 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr 連接，獲得了能與 CD16 結(jié)合的氨基酸序列Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu AspPro Tyr Thr (如序列表11所示)；能與天冬酰胺羥化酶結(jié)合的氨基酸序列以及能夠與CD16結(jié)合的氨基酸序列通過Gly-Gly-Ser 連接子連接，形成了本專利的多肽‘HA-FC’ Gln His He Arg Glu Leu ProTyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Gly Gly SerHe Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro TyrThr (序列表I所示)。上述圖I、圖2、圖3和圖4中的堿基序列與峰之間從左至右依次對(duì)應(yīng)。二、人工合成多肽具有ADCC活性的多肽‘HA-FC’由47個(gè)氨基酸組成，多肽的合成由美聯(lián)生物科技有限公司完成，合成方法采用化學(xué)合成法，合成肽的純度在85%以上；本發(fā)明以下的多肽合成均由美聯(lián)生物科技有限公司完成。以下通過具體試驗(yàn)例來說明本發(fā)明的人工合成多肽所具有的提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性有益效果。試驗(yàn)例I :多肽提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的體外實(shí)驗(yàn)96孔培養(yǎng)板，肽實(shí)驗(yàn)孔按照不同的肽濃度分為6個(gè)組，每組4孔。另設(shè)有不加肽的對(duì)照組4個(gè)孔。以上每孔分別加入50萬個(gè)NK細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)后，每孔再分別加入10萬個(gè)腫瘤細(xì)胞K562 (靶細(xì)胞)，在效靶比為5:1條件下測定NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。每孔總體積200 μ I (液體為含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液)，6組肽實(shí)驗(yàn)組，各孔中‘HA-FC’的濃度分別為 0. lmg/ml、0. 05mg/ml、O. O lmg/ml、0. 005mg/ml、0. 00 lmg/ml、0. 0005mg/ml。37°C C02培養(yǎng)箱4h，每孔加入20 μ I MTT細(xì)胞活性檢測試劑，37°C C02培養(yǎng)箱2h，550nm波長測定吸光值，計(jì)算殺傷率。同時(shí)設(shè)只有NK細(xì)胞以及只有K562細(xì)胞的對(duì)照孔。按照公式(一)計(jì)算殺傷率，人NK細(xì)胞的獲取，采用NK細(xì)胞分離試劑盒，從人的外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離，殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示公式(一):殺傷率(%)=〔 I — (0De+t — 0De) / 0Dt) X 100% ；其中ODe :單純效應(yīng)細(xì)胞孔即NK細(xì)胞孔的OD值；ODt :單純靶細(xì)胞孔即K562細(xì)胞孔的OD值；0De+t :效應(yīng)細(xì)胞加靶細(xì)胞孔的OD值；表I不同濃度‘HA-FC’對(duì)NK細(xì)胞殺傷K562腫瘤細(xì)胞的影響
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權(quán)利要求
1.一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽，其特征在于所述多肽的序列如序列表I所示。
2.一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽，其特征在于所述多肽包含如序列表I所示序列。
3.一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽，其特征在于所述多肽為在序列表I所示序列中插入其他氨基酸后與序列表I所示序列保持80%以上同源性的多肽。
4.權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽及其應(yīng)用，屬于免疫學(xué)與基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽為(1)、如序列表1所示序列的多肽，或(2)、包含如序列表1所示序列的多肽，或(3)、為在序列表1所示序列中插入其他氨基酸后與序列表1所示序列保持80%以上同源性的多肽。本發(fā)明所述的具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明多肽具有氨基端能與腫瘤抗原“天冬酰胺羥化酶”特異結(jié)合；其羧基端能夠與NK細(xì)胞上的CD16分子結(jié)合，通過該多肽的橋梁作用，NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞更貼近、結(jié)合更加牢固，最終使NK細(xì)胞通過釋放穿孔素與顆粒酶殺傷腫瘤細(xì)胞的效率更高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102924579SQ201210406318
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者曾榮南, 馬旭東, 黃文華, 許慎, 黃建麗, 黃俊達(dá) 申請(qǐng)人:曾榮南, 馬旭東, 黃文華