一種d型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，該靶向脂質(zhì)體的組成為：.磷脂、膽固醇、.甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物、D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料；各成分之間的摩爾比為：a：b=5：1～1：5，a：c=1000：1～1000：100，a：d=1000：0.1～1000：100。由于D型多肽與相對應(yīng)的L型多肽相比穩(wěn)定性有顯著提高，因此本發(fā)明得到的D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體顯示出更好的腫瘤靶向性與抗腫瘤作用。該靶向脂質(zhì)體可用于腫瘤診斷或治療藥物的靶向遞送。
【專利說明】一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及靶向脂質(zhì)體制劑，具體說是一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體。本發(fā)明專利涉及D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料、D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體、載藥脂質(zhì)體、制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤一直是困擾人類的重要疾病，目前尚無治愈癌癥的方法。常用的化學(xué)藥物療法，由于其選擇性差，毒副作用大，在應(yīng)用上受到極大的限制。因此，開發(fā)一種能將化療藥物選擇性地濃集在腫瘤組織，并且將其高效地載入腫瘤細胞的具有腫瘤靶向性的載體就具有十分重要的意義。
[0003]由于腫瘤組織對具有一定粒徑的納米顆粒(10_500nm)具有EPR(高通透性和滯留)效應(yīng)，即處在血循環(huán)中的納米顆?？杀粍影邢蛑聊[瘤組織，發(fā)揮所包載藥物的抗腫瘤作用。目前，已有多種利用此效應(yīng)用于腫瘤靶向治療的納米遞藥系統(tǒng)上市，如阿霉素脂質(zhì)體、順鉬脂質(zhì)體和紫杉醇白蛋白納米粒。同時由于腫瘤細胞或腫瘤血管內(nèi)皮細胞上表達有一系列特異性受體，研究者們利用其配體修飾納米遞藥系統(tǒng)，以實現(xiàn)對腫瘤組織的主動靶向遞藥。
[0004]脂質(zhì)體因具有良好的生物相容性，對被包載的藥物具有保護作用以及良好的藥動學(xué)特征被認為是非常有前途的腫瘤靶向載體。在脂質(zhì)體表面連接配體或抗體，可以使脂質(zhì)體獲得主動靶向。其中，多肽配基以其分子量小、特異性強的特點在遞藥系統(tǒng)導(dǎo)向分子中占有重要地位。目前常用的多肽配基為天然L型多肽，由于體內(nèi)存在大量蛋白多肽水解酶，L型多肽在體內(nèi)易被降解，失去靶向活性。
[0005]因此，為了克服傳統(tǒng)的L型多肽配基在生理環(huán)境下穩(wěn)定性不理想，易被酶降解的局限性，研究者開展了大量的工作以提高生物活性多肽的穩(wěn)定性，采用的策略包括多肽側(cè)鏈改造、非天然氨基酸替換、結(jié)構(gòu)環(huán)化等。最終，Chorev和Goodman等人提出的逆反化(retro-1nverso)技術(shù)為獲取穩(wěn)定性多肽提供了新的思路。通過逆反化技術(shù)獲得的D型多肽具有高度穩(wěn)定性。通過穩(wěn)定性更強的D型多肽介導(dǎo)有望為腫瘤主動靶向治療及其納米載體設(shè)計提供新的思路，實現(xiàn)更優(yōu)的治療效果，顯示出良好的潛在應(yīng)用價值。
[0006]Neuropilin-1 (NRP-1)是細胞表面的一種I型跨膜糖蛋白，通常表達在一些腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞表面，是血管內(nèi)皮生長因子165 (VEGF165)的受體，在腫瘤轉(zhuǎn)移、血管新生、調(diào)節(jié)血管通透性等方面發(fā)揮重要功能。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理標本中有NRP-1顯著表達，且其表達量隨神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度增加而增加，但在相應(yīng)的正常組織上皮細胞中卻沒有表達。目前已有研究者利用NRP-1受體抑制劑來抑制腫瘤血管新生從而達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。多肽RPARPAR、RPAKPAR、RGERPPR、PVTRPPR、APARPAP等是通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到的直鏈七肽，是NRP-1的配體，它們對NRP-1高表達的腫瘤細胞和腫瘤血管表現(xiàn)出特異親和性，且具有介導(dǎo)噬菌體穿透腫瘤血管進入腫瘤組織內(nèi)部的能力。
[0007]本發(fā)明利用逆反化技術(shù)，設(shè)計了上述這些靶向多肽對應(yīng)的D型多肽:dRdAdPdRdAdPdR, dRdPdPdRdEGdR、dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP, dPdAdPdRdAdPdA,并將其用于修飾脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過靜脈注射給藥，利用腫瘤EPR效應(yīng)和D型多肽介導(dǎo)作用將其靶向至腫瘤部位，且能在體內(nèi)停留較長的時間。此脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)可用作腫瘤診斷或治療藥物的靶向遞送。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的是提供一種D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料、靶向脂質(zhì)體、載藥脂質(zhì)體、制備方法及應(yīng)用。
[0009]為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，該靶向脂質(zhì)體的組成為:
a.磷脂；
b.膽固醇；
c.甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物；
d.D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料；
上述各成分之間的摩爾比為:a:b=5:1~1:5，a:c=1000:1~1000:100，a:d=1000:0.1 ~1000:100。
[0010]組分a所述的磷脂為:蛋磷脂、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化蛋磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蘧酰-2-棕櫚 酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-亞油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酸、二肉豆蘧酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂酰絲氨酸、二肉豆蘧酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂中的一種。
[0011 ] 組分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的磷脂為:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一種。
[0012]組分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量為400 ~6000。
[0013]組分d所述D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料由D型多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物，其中D型多肽、聚乙二醇和磷脂的摩爾比為1:1:1 ;
其中所述D型多肽的氨基酸序列選自dRdAdPdRdAdPdR、dRdPdPdRdEGdR, dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP、dPdAdPdRdAdPdA ;所述的聚乙二醇的重均分子量為400~8000 ;所述的磷脂為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一種；
其中所述的D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料的制備方法包括如下步驟:采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸(Cys)的D型多肽，將其溶于pH7.0的PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，兩者混合后攪拌反應(yīng)至Mal-PEG-DSPE反應(yīng)完全，去除過量的多肽和DMF，冷凍干燥，得到D型多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物，即D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料。
[0014]所述的聚乙二醇的重均分子量為2000~5000。
[0015]本發(fā)明提供一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:分別稱取上述各組分溶于氯仿中制備得到均勻脂質(zhì)膜，真空干燥；再加入0.155M的硫酸銨溶液，在20~_70°C水浴中震蕩得到脂質(zhì)體混懸液；再于20~70°C水浴中依次擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質(zhì)體，即為D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體。
[0016]本發(fā)明提供一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體作為載藥脂質(zhì)體在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用；其中包載的藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇或紫杉醇衍生物。
[0017]本發(fā)明利用逆反化技術(shù)，設(shè)計了上述這些靶向多肽對應(yīng)的D型多肽:dRdAdPdRdAdPdR, dRdPdPdRdEGdR、dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP, dPdAdPdRdAdPdA,并將其用于修飾脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過靜脈注射給藥，利用腫瘤EPR效應(yīng)和D型多肽介導(dǎo)作用將其靶向至腫瘤部位，且能在體內(nèi)停留較長的時間。此脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)可用作腫瘤診斷或治療藥物的靶向遞送。
[0018]本發(fā)明利用逆反化技術(shù)，設(shè)計了多個L型靶向多肽所對應(yīng)的D型多肽:dRdAdPdRdAdPdR, dRdPdPdRdEGdR、dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP, dPdAdPdRdAdPdA,并將這些 D 型多肽修飾到脂質(zhì)體表面。該系統(tǒng)可通過靜脈注射給藥，利用腫瘤EPR效應(yīng)和D型多肽介導(dǎo)作用將其靶向至腫瘤部位。
[0019]與常規(guī)L型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體相比，由于體內(nèi)沒有D型多肽的水解酶，D型多肽比L型多肽穩(wěn)定性大大提高，從而提高其靶向效果和對腫瘤的治療效果。
[0020]與L型多肽相比，D型多肽在體外血漿中的穩(wěn)定性比相對應(yīng)的L型多肽穩(wěn)定性有顯著增加。
`[0021]本發(fā)明的脂質(zhì)體用激光散射法測定粒徑分布。其平均粒徑為5(T200nm。
[0022]本發(fā)明通過熒光示蹤脂質(zhì)體，考查腫瘤細胞對載羧基熒光素(FAM)脂質(zhì)體的體外攝取，結(jié)果證實D型多肽在體外能介導(dǎo)脂質(zhì)體進入腫瘤細胞。
[0023]本發(fā)明通過近紅外染料DiR標記脂質(zhì)體，將包載DiR脂質(zhì)體經(jīng)靜脈注射于腫瘤動物模型體內(nèi)，在活體成像儀下觀測，證明D型多肽修飾的脂質(zhì)體對腫瘤組織具有很好的靶向性。
[0024]此脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)可用作腫瘤診斷或治療藥物的靶向遞送。
[0025]于D型多肽與相對應(yīng)的L型多肽相比穩(wěn)定性有顯著提高，因此本發(fā)明得到的D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體顯示出更好的腫瘤靶向性與抗腫瘤作用。該靶向脂質(zhì)體可用于腫瘤診斷或治療藥物的祀向遞送。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]附圖1 是 RPAKPAR 與 dRdAdPdKdAdPdR (R1-RPAKPAR)在血漿中的穩(wěn)定性。
[0027]附圖2 是 dRdAdPdKdAdPdRC-PEG-DSPE 的 1H-NMR 圖譜。
[0028]附圖3是脂質(zhì)體/DOX和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DOX粒徑分布圖。
[0029]附圖4是四種脂質(zhì)體的透射電鏡照片。[0030]附圖5是dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM和脂質(zhì)體/FAM被PC-3腫瘤細胞攝取照片。
[0031]附圖6是dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR和脂質(zhì)體/DiR在前列腺癌皮下瘤動物模型的活體成像圖片。
[0032]附圖7是dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/阿霉素(R1-RPAKPAR-LS/DOX)對前列腺癌皮下瘤的生長抑制作用。
【具體實施方式】
[0033]通過下述實施例將有助于進一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0034]實施例1:
D型多肽-PEG-DSPE的合成、純化和表征:
采用Boc固相多肽合成技術(shù)合成dRdAdPdRdAdPdRC多肽，將其溶于PBS溶液中(pH7.0)，取Mal-PEG-DSPE (馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物)溶于DMF，兩者混合后磁力攪拌反應(yīng)，HPLC (高效液相色譜法)監(jiān)測反應(yīng)，待Mal-PEG-DSPE反應(yīng)完全后停止反應(yīng)，過量的dRdAdPdRdAdPdRC和DMF通過透析(截留分子量3.5kDa)除去。冷凍干燥，得dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE,NMR表征其結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，Mal-PEG-DSPE 圖譜在 6.67ppm處顯示Mal 的特征峰，而 dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE 圖譜上此峰消失，說明 dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE合成成功。
[0035]其余D 型多肽 dRdPdPdRdEGdRC、dRdAdPdKdAdPdRC、dRdPdPdRdTdVdPC、dPdAdPdRdAdPdAC按上述步驟操作，可分別獲得 dRdPdPdRdEGdRC-PEG-DSPE、dRdAdPdKdAdPdRC-PEG-DSPE、dRdPdPdRdTdVdPC-PEG-DSPE、dPdAdPdRdAdPdAC-PEG-DSPE。
[0036]實施例2:`
DRDADPDRDADPDR -脂質(zhì)體/FAM的制備和表征:
脂質(zhì)體膜材料處方組成為HSPC (氫化大豆磷脂)/Chol (膽固醇)/mPEG-DSPE (聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復(fù)合物)(55: 45: 2，mo 1/mo I)/RdAdPdRdAdPdR修飾的PEG脂質(zhì)體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5,mol/mol)。稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶媒，得均勻脂質(zhì)膜，真空干燥24小時。加入FAM水溶液水化，60°C水浴震蕩2小時，得脂質(zhì)體混懸液。在60°C水浴中，使用高壓均質(zhì)機(若脂質(zhì)體體積少于10 mL則改用微型擠出器)依次將脂質(zhì)體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，使其粒徑減小。然后以生理鹽水為洗脫液過葡聚糖凝膠G-50層析柱分離除去未包封的FAM，得脂質(zhì)體。脂質(zhì)體用動態(tài)光散射法和透射電子顯微鏡測定粒徑，結(jié)果顯示，平均粒徑均為90nm左右，dRdAdPdRdAdPdR修飾對其粒徑無明顯影響。
[0037]其余D型多肽按上述步驟操作，可分別獲得dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/FAM、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /FAM、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /FAM、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /FAM。
[0038]實施例3:
DRDADPDRDADPDR -脂質(zhì)體/DiR的制備和表征:
脂質(zhì)體膜材料處方組成為HSPC (氫化大豆磷脂)/Chol (膽固醇)/mPEG-DSPE (聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復(fù)合物)(55: 45: 2，mol/mol)/RdAdPdRdAdPdR修飾的PEG脂質(zhì)體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5，mol/mol)。稱取上述膜材料溶于氯仿,加入DiR甲醇溶液(1.5mg/ml) 30 μ I,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶媒，得均勻脂質(zhì)膜，真空干燥24小時。加入生理鹽水水化，60°C水浴震蕩2小時，得脂質(zhì)體混懸液。在60°C水浴中，使用高壓均質(zhì)機(若脂質(zhì)體體積少于10 mL則改用微型擠出器)依次將脂質(zhì)體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，使其粒徑減小。然后以生理鹽水為洗脫液過葡聚糖凝膠G-50層析柱分離除去未包封的DiR，得脂質(zhì)體。脂質(zhì)體用動態(tài)光散射法和透射電子顯微鏡測定粒徑，結(jié)果顯示，平均粒徑均為90nm左右，dRdAdPdRdAdPdR修飾對其粒徑無明顯影響。
[0039]其余D型多肽按上述步驟操作，可分別獲得dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/DiR、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /DiR、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /DiR、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /DiR。
[0040]實施例4:
dRdAdPdRdAdPdR -脂質(zhì)體/DOX的制備和表征: PEG-脂質(zhì)體膜材料處方組成為HSPC (氫化大豆磷脂)/Chol (膽固醇)/mPEG-DSPE (聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復(fù)合物)(55: 45: 2，mol/mol)/RdAdPdRdAdPdR修飾的PEG脂質(zhì)體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5,mol/mol)。分別稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，得均勻脂質(zhì)膜，真空干燥24h。加入一定體積的0.155M硫酸銨溶液，60°C水浴震蕩2h，得脂質(zhì)體混懸液。在60°C水浴中，使用高壓均質(zhì)機(若脂質(zhì)體體積少于IOmL則改用微型擠出器)依次將脂質(zhì)體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質(zhì)體。以生理鹽水為洗脫劑，將空白脂質(zhì)體洗脫通過Sephadex G_50凝膠柱更換外水相。按照藥脂比1:10 (w/w)加入阿霉素生理鹽水溶液，60°C水浴20min。以生理鹽水洗脫通過S印hadex G-50凝膠柱，除去游離藥物，得阿霉素脂質(zhì)體。脂質(zhì)體用動態(tài)光散射法和透射電子顯微鏡測定粒徑，結(jié)果顯示，平均粒徑均為90nm左右，dRdAdPdRdAdPdR修飾對其粒徑無明顯影響。
[0041 ] 其余D型多肽按上述步驟操作，可分別獲得dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/D0X、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /D0X、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /D0X、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /D0X。
[0042]實施例5:
DRDADPDRDADPDR-脂質(zhì)體體外腫瘤細胞靶向性驗證:
取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)PC-3腫瘤細胞，用0.25%胰蛋白酶和0.025%乙二胺四乙酸二鈉消化單層培養(yǎng)細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細胞懸液，以每孔I X IO5個細胞接種于培養(yǎng)皿中，每孔體積1ml，將培養(yǎng)板移入二氧化碳培養(yǎng)箱中，37 0C，5% 二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。次日，用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制一系列不同濃度的脂質(zhì)體/FAM和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM溶液。將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸出，加入脂質(zhì)體/FAM和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM的系列溶液，37°C孵育lh，吸棄上清液。用PBS溶液洗皿兩次，在激光共聚焦顯微境下觀察細胞內(nèi)化情況。結(jié)果顯示脂質(zhì)體/FAM幾乎不被攝取，而dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM則被大量攝取，說明dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM對腫瘤細胞具有良好的體外靶向性。
[0043]采用上述方法，驗證其余D型多肽修飾脂質(zhì)體(dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/FAM、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /FAM、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /FAM、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /FAM)的體外靶向性。
[0044]實施例6:
DRDADPDRDADPDR-脂質(zhì)體體內(nèi)靜脈注射后對前列腺癌皮下瘤靶向性的驗證:將處于對數(shù)生長期的PC-3細胞胰酶消化，PBS洗滌，分散于PBS中，以I X IO7細胞(100--1)濃度皮下注射接種于裸鼠右側(cè)肩胛骨部位，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。取成瘤裸鼠模型6只，隨機分為兩組，分別尾靜脈注射脂質(zhì)體/DiR和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR，給藥后不同時間點將裸鼠麻醉，在活體動物成像系統(tǒng)內(nèi)掃描脂質(zhì)體/DiR和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR在裸鼠腫瘤組織的分布。結(jié)果顯示與脂質(zhì)體/DiR相比，dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR在裸鼠腫瘤組織內(nèi)的分布顯著增加，表明dRdAdPdRdAdPdR的修飾實現(xiàn)了脂質(zhì)體對腫瘤的靶向遞藥。
[0045]采用上述方法，驗證其余D型多肽修飾脂質(zhì)體(dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/DiR、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /DiR、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /DiR、DPDADPDRDADPDA_ 脂質(zhì)體 /DiR)的體內(nèi)靶向性。
[0046]實施例7:
DRDADPDRDADPDR-脂質(zhì)體/DOX對前列腺癌皮下瘤的生長抑制作用:
將處于對數(shù)生長期的PC-3腫瘤細胞胰酶消化，PBS洗滌，分散于PBS中，以I X IO7細胞(100--1)濃度皮下注射接種于裸鼠右側(cè)肩胛骨部位，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。將24只已接種PC-3腫瘤細胞的裸鼠隨機分為4組(每組6只)，分別設(shè)為N.S.，D0X,脂質(zhì)體/DOX和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DOX組。將100--1相應(yīng)的制劑分別在接種后第29、35、41天經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，阿霉素的總劑量為18mg/kg。在接種后51天，將裸鼠處死，取出皮下瘤測量體積。體積由以下公式計算得到:
V (mm3) = (d2 X D) / 2
其中d和D分別為皮下瘤的短徑和長徑，單位為mm。
[0047]采用上述方法，驗證其余D型多肽修飾脂質(zhì)體(dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/D0X、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /DOX、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /DOX、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /D0X)的體內(nèi)靶向性。
[0048]附圖1、RPAKPAR 與 dRdAdPdKdAdPdR (R1-RPAKPAR)在血漿中的穩(wěn)定性
由圖可見，多肽RPAKPAR在血漿中24h降解剩余15%左右，而dRdAdPdKdAdPdR則基本未被降解，說明D型多肽與對應(yīng)的L型多肽相比，穩(wěn)定性有顯著提高。
[0049]附圖2、dRdAdPdKdAdPdRC-PEG-DSPE 的 1H-NMR 圖譜
圖中A為Mal-PEG-DSPE的核磁圖譜，B為dRdAdPdKdAdPdRC-PEG-DSPE的核磁圖譜，由圖可看出，A圖顯示出馬來酰亞胺峰，而B圖中該峰消失，而其余峰基本保持不變，顯示Mal-PEG-DSPE中的馬來酰亞胺基團已與dRdAdPdKdAdPdRC反應(yīng)。
[0050]附圖3、脂質(zhì)體/DOX和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DOX粒徑分布圖
脂質(zhì)體/FAM和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM粒徑分布圖，由圖可知，兩者粒徑大小及分布無顯著差異。
[0051]附圖4四種脂質(zhì)體的透射電鏡照片
由圖可見脂質(zhì)體均為球形或近球形的小單室脂質(zhì)體，外觀圓整，平均粒徑與粒度儀測定結(jié)果相近。
[0052]附圖5、dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM和脂質(zhì)體/FAM被PC-3腫瘤細胞攝取照片 dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM (A)和脂質(zhì)體/FAM (B)于37°C分別與腫瘤細胞作用4小
時后的熒光顯微照片，由圖可知，腫瘤細胞對dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM的攝取量遠大于脂質(zhì)體/FAM。[0053]附圖6 dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR和脂質(zhì)體/DiR在前列腺癌皮下瘤動物模型的活體成像圖片
dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR (左)和脂質(zhì)體/DiR (右)分別尾靜脈注射至前列腺癌皮下瘤動物模型體內(nèi)，24小時后活體成像儀檢測，由圖可知，dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR在腫瘤組織內(nèi)的分布量遠大于脂質(zhì)體/FAM，顯示出良好的腫瘤靶向性。
[0054]附圖7 dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/阿霉素(R1-RPAKPAR-LS/DOX)對前列腺癌皮下瘤的生長抑制作用
藥效學(xué)實驗結(jié)果如圖所示，dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DOX組皮下瘤體積顯著小于RPAKPAR-脂質(zhì)體/DOX組，說明 與L型多肽相比，D型多肽修飾的脂質(zhì)體在增強阿霉素抗腫瘤生長作用方面顯示出顯著的優(yōu)越性。
【權(quán)利要求】
1.一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，該靶向脂質(zhì)體的組成為: a.磷脂； b.膽固醇； c.甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物； d.D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料； 上述各成分之間的摩爾比為:a:b=5:1~1:5，a:c=1000:1~1000:100，a:d=1000:0.1 ~1000:100。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，組分a所述的磷脂為:蛋磷脂、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化蛋磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蘧酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-亞油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酸、二肉豆蘧酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂酰絲氨酸、二肉豆蘧酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，組分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的磷脂為:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，組分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量為400~6000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，組分d所述D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料由D型多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物，其中D型多肽、聚乙二醇和磷脂的摩爾比為1:1:1 ; 其中所述D型多肽的氨基酸序列選自dRdAdPdRdAdPdR、dRdPdPdRdEGdR, dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP、dPdAdPdRdAdPdA ;所述的聚乙二醇的重均分子量為400~8000 ;所述的磷脂為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一種； 其中所述的D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料的制備方法的具體步驟為:采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸(Cys)的D型多肽，將其溶于pH7.0的PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，兩者混合后攪拌反應(yīng)至Mal-PEG-DSPE反應(yīng)完全，去除過量的多肽和DMF，冷凍干燥，得到D型多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物，即D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，所述的聚乙二醇的重均分子量為2000~5000。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6之一所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:分別稱取上述各組分溶于氯仿中制備得到均勻脂質(zhì)膜，真空干燥；再加入0.155M的硫酸銨溶液，在20~-70°c水浴中震蕩得到脂質(zhì)體混懸液；再于20~70°C水浴中依次擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質(zhì)體，即為D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~6之一所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體作為載藥脂質(zhì)體在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用；其中包載的藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇或紫杉醇衍生物。`
【文檔編號】A61P35/00GK103720655SQ201210383701
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月11日
【發(fā)明者】閆志強, 楊一祎, 魏岱旭, 鐘建, 何丹農(nóng) 申請人:上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司