專利名稱：鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療男性抗精子免疫不育的新藥物，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)明。
背景技術(shù)：
男性不育的原因非常復(fù)雜，其中抗精子免疫性因素是非常重要的方面林寶英.抗精子抗體與免疫性不育[J]·皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，23 (1):71 73 ;[2]萬(wàn)霞·免疫性不育與抗精子抗體，實(shí)用醫(yī)技雜志，2007，14 (21) :2926— 2927。一項(xiàng)關(guān)于男性不育癥病因的研究發(fā)現(xiàn)，抗精子免疫性不育高達(dá)29. 9%向桂橋，陳榮安，張益康，等.6498例男性不育癥病因分析[J]·南華大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2005，33(2):211-223?？咕涌贵w(AsAb)介導(dǎo)的免疫性不育已證實(shí)為男性不育的重要原因之一。目前，WHO已把免疫性因素列為男性不育常規(guī)檢查的項(xiàng)目?！?br>
男性抗精子免疫性不育是指以精子作為抗原，在體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)所引起的不育。正常情況下，由于生殖免疫屏障的存在，機(jī)體不會(huì)對(duì)自身精子產(chǎn)生免疫反應(yīng)。但在病理狀態(tài)下，由于血睪屏障的破壞，就會(huì)造成精子或其可溶性抗原成分的逸出，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗精子抗體(AsAb)。AsAb可對(duì)體內(nèi)精子產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，影響精子受精過(guò)程和受精卵及胚胎的發(fā)育，造成生殖障礙。泌尿生殖道的感染和阻塞等因素有可能與抗精子抗體產(chǎn)生有關(guān)?？咕涌贵w導(dǎo)致男性不育的機(jī)理十分復(fù)雜，可在抵制和降低精子獲能、頂體反應(yīng)穿越透明帶和精卵融合、受精卵甚至胚胎發(fā)育等多個(gè)環(huán)節(jié)上影響生育?？贵w引起的精子制動(dòng)、精子凝集，精子的運(yùn)動(dòng)能力下降等，都有可能使其不能達(dá)到女性生殖道的受精地點(diǎn)。此外，AsAb所具有的細(xì)胞毒效應(yīng)，在補(bǔ)體的參與下，也可造成精子死亡或失去活力。精漿的中TNF-α、IL-6、IL-2的過(guò)度表達(dá)也不同程度參與了發(fā)病。目前，對(duì)男性抗精子免疫性不育的治療尚缺乏高效特異的方法。現(xiàn)有的治療首先是去除病因，其次是降低患者體內(nèi)的抗精子抗體的滴度?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物治療主要是類固醇激素江海身.男性不育的診斷與治療.中國(guó)性科學(xué)，2007，16 (7): 18-21。其他如采用免疫阻斷和輔助生育技術(shù)。輔助生育技術(shù)因條件所限，一般難以廣泛推廣。而激素類藥物的毒副作用和可能存在的其他風(fēng)險(xiǎn)，使得其臨床應(yīng)用非常謹(jǐn)慎。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者在采用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合的方法治療該病方面取得了一定的成績(jī)。但目前有關(guān)中藥在這方面的研究缺乏系統(tǒng)性，尤其是作用機(jī)理不清楚。鹽酸青藤堿，是從中藥青風(fēng)藤[防已科植物青藤sinomenium acutum(Thumb)Rehd. et Wils 毛青藤 sinomenium acutum (thumb) Rehd. et Wils. Var cinereum Rehd.Et Wils的莖或根莖]中提取的青藤堿的鹽酸鹽。研究證實(shí)，鹽酸青藤堿具有顯著的免疫抑制作用，和抗炎、鎮(zhèn)痛作用。目前由該成分制成的口服片劑和注射液在臨床使用。商品名為“正清風(fēng)痛寧”的系列產(chǎn)品即為由鹽酸青藤堿制成的系列藥品制劑，目前，該類制劑批準(zhǔn)用途為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、慢性腎炎等疾病，有非常確切的療效，近年來(lái)，對(duì)鹽酸青藤堿抗炎、免疫作用機(jī)理的研究不斷深入，但是，尚未見到有鹽酸青藤堿治療男性抗精子免疫不育的研究報(bào)道，本專利的申請(qǐng)，是關(guān)于首次發(fā)現(xiàn)鹽酸青藤堿抗精子免疫免疫不育治療作用新用途的研究結(jié)果。本發(fā)明的目的是提供一種治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫性不育的新藥劑，為男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫性不育的臨床治療開辟新的治療途徑。
發(fā)明內(nèi)容
一、本發(fā)明的技術(shù)方案為
第一步明確鹽酸青藤堿的來(lái)源及確定已有鹽酸青藤堿制劑作為藥品在臨床應(yīng)用。每二步研究證實(shí)鹽酸青藤堿對(duì)抗精子陽(yáng)性免疫不育的治療作用并分析其作用機(jī)制，包括
I:模擬制備男性抗精子免疫性不育的動(dòng)物模型
2:對(duì)模型動(dòng)物采用鹽酸青藤堿進(jìn)行治療，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照。3:考察治療藥物對(duì)模型動(dòng)物生殖力的影響，將治療后雄鼠與雌鼠合籠交配，通過(guò)觀察所交配雌鼠的妊娠率與胚胎數(shù)與發(fā)育情況，考察鹽酸青藤堿對(duì)免疫性不育動(dòng)物模型生殖力的影響。4 :對(duì)鹽酸青藤堿治療男性抗精子免疫不育的作用機(jī)理進(jìn)行分析。觀察指標(biāo)包括經(jīng)鹽酸青藤堿治療后模型動(dòng)物血清和精漿中的抗精子抗體滴度、精子的數(shù)量和質(zhì)量、與抗精子免疫相關(guān)的細(xì)胞因子、及生精組織與細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。二、本發(fā)明的有益效果為
I.免疫性不育模型動(dòng)物經(jīng)鹽酸青藤堿治療后生育力較模型對(duì)照明顯增強(qiáng)，所交配雌鼠的受孕率提高、胚胎數(shù)增加，且胚胎發(fā)育正常。2.鹽酸青藤堿顯著降低抗精子免疫不育雄性大鼠血清中的抗精子抗體水平，劑量增加后作用增強(qiáng)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.鹽酸青藤堿能對(duì)抗與精子免疫相關(guān)的部分細(xì)胞因子表達(dá)。降低精漿中的腫瘤壞死因子(TNF-α )、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞介素2 (IL-2)的含量，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.鹽酸青藤堿可改善抗精子免疫不育大鼠的精子數(shù)量和質(zhì)量，使精子數(shù)量增加、精子的活率和活力均明顯提高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.睪丸組織病理學(xué)檢查證實(shí)，鹽酸青藤堿可改善抗精子抗體陽(yáng)性大鼠睪丸組織中治療后的動(dòng)物較對(duì)照組的成熟精子增多。三、本發(fā)明的具體實(shí)施方式
為
對(duì)鹽酸青藤堿來(lái)源及制劑產(chǎn)品的研究
鹽酸青藤堿是從中藥青風(fēng)藤防已科植物青藤sinomenium acutum (Thumb) Rehd. etWils 或毛青藤 sinomenium acutum (thumb) Rehd. et Wils. Var cinereum Rehd. Et Wils的莖或根莖中提取的生物堿單體——青藤堿，再制備成可供藥用的鹽酸鹽，目前，已有獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)生產(chǎn)的鹽酸青藤堿制劑在臨床使用，目前常見的片劑、緩釋劑和注射液均有此作用。青藤堿來(lái)源的原植物
青藤堿是從中藥青風(fēng)藤防已科植物青藤sinomenium acutum (Thumb) Rehd. et Wils或毛青藤 sinomenium acutum (thumb) Rehd. et Wils. Var cinereum Rehd. Et Wils 的莖或根莖中提取的生物堿單體。青藤Sinomenium acutum (Thun b. )Rehd. Et Wils0 為落葉纏繞藤本。莖帶木質(zhì)，枝綠色，葉互生，花小，單性，雌雄異株；種子半月形。藥用其干燥藤莖部分。藤莖呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，直徑5 20毫米，外表灰褐色，有縱皺及橫向皮孔，節(jié)處膨大。體輕，質(zhì)堅(jiān)實(shí)而脆，易折斷，斷面灰黃色或淡灰棕色，不平坦。橫切面韌皮部很窄，木質(zhì)部導(dǎo)管與射線呈放射狀排列，導(dǎo)管較大，中央為圓形的髓。氣弱，味苦。毛青藤 sinomenium acutum(thumb)Rehd. et Wils. Var cinereum Rehd. EtWils，外表特征與青藤相似，維管束數(shù)稍多。青藤堿的提取工藝
是從青風(fēng)藤中提取青藤堿已經(jīng)有了比較成熟工藝，回流提取和超聲提取的方法為目前常用的提取工藝。 (一)回流提取法
采用回流提取法提取青藤堿時(shí)，優(yōu)選出青風(fēng)藤中青藤堿最佳提取工藝為用8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次I. 5h，該提取工藝還可進(jìn)一步優(yōu)化為以7. 5% 10%的熟石灰、I. 8倍量水進(jìn)行堿化，用I. 5倍量工業(yè)苯回流提取。產(chǎn)品經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定，青藤堿含量大于95%。(二)超聲提取法
以苯為溶劑，采用超聲法也可從青風(fēng)藤中提取青藤堿。超聲提取物經(jīng)活性炭脫色和重結(jié)晶得到青藤堿，青藤堿的產(chǎn)率為2. 12%，含量為98. 73%。使用超聲提取分離青藤堿不影響其分子結(jié)構(gòu)、操作簡(jiǎn)便，所得產(chǎn)品的含量與回流提取法基本相近，但高效液相色譜檢測(cè)時(shí)，雜質(zhì)峰較回流提取法多。、青藤堿的理化性質(zhì)
青藤堿由氫菲核及乙胺橋組成，類似嗎啡，分子式C19H23NO4,分子質(zhì)量329. 39Da,其性狀為長(zhǎng)絲狀晶體，熔點(diǎn)161°C，熔化后熔點(diǎn)又升至182°C，易溶于氯仿、丙酮、乙醇和堿液中，微溶于水、乙醚和苯，較難溶于乙酸乙酯中，其鹽酸溶液加三氯化鐵呈草綠色，鹽酸鹽為長(zhǎng)針狀晶體，熔點(diǎn)233°C，易溶于水
O1
青藤堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
(二).對(duì)鹽酸青藤堿治療男性抗精子免疫不育治療作用的研究
I.實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF級(jí)SD性成熟大鼠，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，體重180 220g。實(shí)驗(yàn)藥物 1.2. I受試藥物
鹽酸青藤堿片(商品名正清風(fēng)痛寧片)。國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)Z43020278。由湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1001109，規(guī)格24片/盒，每片含20mg鹽酸青藤堿。I. 2. 2陽(yáng)性對(duì)照藥物
醋酸潑尼松片(強(qiáng)的松片)國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H33021207，由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):100875，規(guī)格:5mg/片。實(shí)驗(yàn)試劑
M199培養(yǎng)液賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；
Freund完全佐劑美國(guó)Sigma公司；
大鼠抗精子抗體(AsAb)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、白細(xì)胞介素-2 (IL-2)腫瘤壞死因子α (TNF-α )酶聯(lián)免疫試劑盒均由長(zhǎng)沙力生試劑公司提供?！?br>
主要實(shí)驗(yàn)儀器
島津UV-1750紫外可見分光度計(jì)(島津儀器公司)；RT-6000全自動(dòng)酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；
Reichert Histo STAT 820型切片機(jī)為美國(guó)生產(chǎn)，MOTIC BISERLES型顯微攝影系統(tǒng)為麥克奧迪(廈門)醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)方案
2.1抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育大鼠模型的建立
模型的制備參照文獻(xiàn)[I]:張淑芹，溫海霞，趙林山，等.抗精子陽(yáng)性大鼠動(dòng)物模型的建立[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2003，13 (6) :370-373; [2]:張瑋，張輝，邊淑玲，等.NO對(duì)抗精子抗體陽(yáng)性大鼠精予凋亡的影響[J].中國(guó)男科學(xué)雜志，2003，17(6) :384-386方法并加以改進(jìn)，采用人工主動(dòng)免疫法造模，共免疫三次，在第三次免疫后于大鼠眼眶采血，分離血清，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清的抗精子抗體(AsAb)滴度，與正常對(duì)照動(dòng)物比較應(yīng)有明顯增加，具體過(guò)程如下
2. I. I制備大鼠佐劑性精子抗原
取性成熟雄性大鼠若干只，用頸椎脫白法處死，立即取出雙側(cè)附睪，在滅菌紙上除去血液和脂肪組織，然后在2ml生理鹽水中剪碎附睪，37°C靜置lOmin，使精子充分游出，用孔徑200 μ m尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液置37°C培育20min后用血球計(jì)數(shù)板調(diào)精子數(shù)為3X 109/ml，與等量完全弗氏佐劑混勻，在乳缽中充分研磨，直至呈“油包水”狀，即為精子的免疫性抗原。同種異體注射佐劑性精子抗原制備抗精子抗體陽(yáng)性大鼠模型
取性成熟雄性大鼠(體質(zhì)理180—220g)，除正常對(duì)照組外，其余各鼠均以制備的上述精子抗原O. 5ml，在雙側(cè)腹股溝及頸背部脊柱兩側(cè)皮下多點(diǎn)注射作為首次抗原免疫，分別采用了于首次免疫后的第10天在原部位I次注射免疫攻擊、和在首次免疫后的第10天和第20天，在原部位2次注射免疫攻擊的方法進(jìn)行模型制備，正常組給予O. 5ml生理鹽水注射作為對(duì)照，在免疫攻擊完成后第7天，采血檢測(cè)血清中的抗精子抗體(AsAb)滴度，檢測(cè)方法采用酶聯(lián)免疫分析法，具體操作按試劑盒要求，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠抗精子抗體(AsAb)濃度。結(jié)果，用精子與弗氏佐劑制備的佐劑免疫抗原進(jìn)行攻擊，2次免疫攻擊與I次攻擊比較，大鼠經(jīng)2次免疫攻擊后，血清中抗精子抗體滴度升高更顯著，見表1，表明制備抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育模型，采用同種異體精子抗原2次免疫注射攻擊更為可靠。表I.同種異體精子抗原不同免疫攻擊次數(shù)的大鼠血清AsAb檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供了一種鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育中的應(yīng)用，即為臨床使用的鹽酸青藤堿有治療男子抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育的作用。
3.如權(quán)利要求I所述的鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育中的應(yīng)用，證明鹽酸青藤堿可顯著降低人或動(dòng)物血清的抗體水平和與抗精子免疫相關(guān)的部分細(xì)胞因子表達(dá)，精子數(shù)量增加、活率和活力明顯提高，有增強(qiáng)模型動(dòng)物生育力作用。
4.如權(quán)利要求I所述的鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育中的應(yīng)用，證明經(jīng)鹽酸青藤堿治療后男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育的生育力較模型對(duì)照明顯增強(qiáng)，所交配雌鼠的受孕率提高、胚胎數(shù)增加，且胚胎發(fā)育正常。
5.如權(quán)利要求I所述的鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫不育中的應(yīng)用，證明目前常見的鹽酸青藤堿片劑、緩釋劑和注射液均有此作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫性不育的新藥劑，該藥劑為已被批準(zhǔn)在臨床使用的鹽酸青藤堿。本項(xiàng)目首次發(fā)現(xiàn)鹽酸青藤堿用于治療男性抗精子抗體陽(yáng)性免疫性不育的新用途。
文檔編號(hào)A61K31/485GK102908348SQ20121034584
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者邱賽紅, 吳紅娟, 朱傳湘, 鄒龍 申請(qǐng)人:湖南中醫(yī)藥大學(xué)