抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物及制備方法

抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物及其制備方法。該疫苗組合物含有豬肺炎支原體抗原、豬胸膜肺炎放線桿菌抗原，其免疫程序簡單，既可產(chǎn)生抗體，又同時(shí)具有攻毒保護(hù)，能有效的防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎。該疫苗組合物的免疫效果至少與分別注射單苗效果相當(dāng)，副反應(yīng)小，血清抗體效價(jià)高，免疫期長，耗時(shí)少、費(fèi)力少、對(duì)豬的侵害也小。該疫苗組合物生產(chǎn)工藝簡單，免疫成本低廉，實(shí)用性強(qiáng)。
【專利說明】抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于畜類生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎的二聯(lián)多價(jià)疫苗組合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬氣喘病又稱豬支原體肺炎(Macoplasmal pneumoniae of swine, MPS)或豬地方性流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumonia, SEP),是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病,普遍存在于世界各地。患病豬主要表現(xiàn)為咳嗽和氣喘，生長遲緩，飼料轉(zhuǎn)化率低，體溫基本正常。解剖時(shí)以肺部病變?yōu)橹?，尤以兩肺心葉，中間葉和尖葉出現(xiàn)胰樣變和肉樣變?yōu)槠涮卣?。發(fā)病率高，死亡率低。近年的研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體與豬繁殖呼吸綜合癥病毒和其它病原混合感染，使其感染的重要性進(jìn)一步提高。到目前為止，該病仍是造成養(yǎng)豬經(jīng)濟(jì)損失最重要的疾病之一。
[0003]豬肺炎支原體對(duì)培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件要求非常苛刻，在一般的培養(yǎng)基中很難生長，是動(dòng)物支原體中較難培養(yǎng)的一種。該疾病通過咳嗽產(chǎn)生的飛沫以及與感染或恢復(fù)期的病原攜帶豬直接接觸而傳播。感染動(dòng)物和未感染動(dòng)物混居導(dǎo)致早期和頻繁的再感染，感染通常開始于攜帶病原的母豬產(chǎn)胎時(shí)感染小豬。由于豬群集中管理技術(shù)的影響，感染在生命后期才變得明顯。當(dāng)斷乳后把豬集中起來時(shí)，通常還可發(fā)現(xiàn)其它感染。在六周齡或更大的豬中常常觀察到明顯的疾病，感染豬的生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率顯著降低。使用抗生素治療貴并且需要長期使用。再感染也是一個(gè)問題。目前疫苗是避免感染及其影響的最有效方法。
[0004]豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP),是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的豬的一種高度傳染性呼吸道疾病。該病在世界范圍內(nèi)分布廣泛，常呈地方性流行，造成持續(xù)的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。由于APP血清型眾多，且各個(gè)國家及地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型各不相同，給該病的防治帶來了極大的困難。我國已分離到1、2、3、4、5、7和8型，其中以7型最多，該病在我國不同省市流行的血清型不同。豬傳染性胸膜肺炎主要是由感染豬直接傳染給易感豬群的，能感染任何年齡的豬只，I~4月齡最易感，APP最主要的傳播方式是通過感染豬呼出的小液滴進(jìn)行的，這些小液滴隨著氣流漂移，當(dāng)距離較近的易感豬呼入或直接接觸到小液滴時(shí)就容易發(fā)病。豬傳染性胸膜肺炎與豬傳染性萎縮性鼻炎和豬氣喘病一起成為當(dāng)今大型養(yǎng)豬場的三大呼吸道傳染病。該病以急性出血和慢性纖維素性胸膜肺炎為特征，目前在多數(shù)工廠化的養(yǎng)豬國家均有發(fā)生。本病主要通過飛沫傳播，也可通過接觸傳染。該病造成的豬只死亡、生長緩慢、飼料報(bào)酬降低及藥物防治費(fèi)用的增加，給世界各地的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005]但是，迄今為止，尚沒有能夠同時(shí)防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎的二聯(lián)組合疫苗。因此，目前需要研究開發(fā)一種安全有效、使用簡便，并能同時(shí)防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎的二聯(lián)組合疫苗。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎的二聯(lián)疫苗組合物及其制備方法。該疫苗組合物含有豬肺炎支原體抗原、豬胸膜肺炎放線桿菌抗原，免疫程序簡單，既可產(chǎn)生抗體，又同時(shí)具有攻毒保護(hù)，能同時(shí)有效的防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎。該疫苗生產(chǎn)工藝簡單，免疫成本低廉，實(shí)用性強(qiáng)。
[0007]為此，本發(fā)明提供了一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物，其包括豬肺炎支原體抗原、豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
[0008]在本發(fā)明中，所述豬肺炎支原體抗原包含至少一種在對(duì)豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗豬肺炎支原體感染的免疫應(yīng)答的豬肺炎支原體抗原。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，所述豬肺炎支原體抗原為豬肺炎支原體全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬肺炎支原體細(xì)菌，或者含有豬肺炎支原體的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種。
[0010]本發(fā)明中所述用語“豬肺炎支原體全菌體”，是指豬肺炎支原體的完整細(xì)胞體。
[0011]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述豬肺炎支原體抗原選自勃林格殷格翰公司的豬支原體肺炎滅活疫苗(Ingeivacs M.hyo)、哈藥集團(tuán)公司的瑞倍適Respisure和RespisureOne、美國先靈德雅公司的豬支原體肺炎滅活疫苗(Myco Silencer? )、西班牙海博萊生物大藥廠的J株(喜可舒)、美國普泰克公司的MycoGard、美國輝瑞公司的RespiFendMH、梅里亞動(dòng)物保健公司的豬克喘中的一種或幾種。
`[0012]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的J株或HN0613株全菌體。優(yōu)選所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的HN0613株全菌體。所述豬肺炎支原體 HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2012230，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))。保藏日期為2012年6月13日。
[0013]本發(fā)明中所述用語“豬肺炎支原體HN0613”，也稱為“豬肺炎支原體HN0613株” (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)。
[0014]根據(jù)本發(fā)明，在所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體HN0613滅活前含量為IO8~101QMHDCE/ml (MHDCE =豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物，即I MHDCE相當(dāng)于I個(gè)豬肺炎支原體)。優(yōu)選在所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體HN0613抗原滅活前含量為2X109MHDCE/ml。
[0015]正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變異，然而，當(dāng)變異不影響其蛋白質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)或者主要作用功能區(qū)時(shí)，該微生物之他種野外分離株即使基因序列無法百分之百相同，其基本的生理功能并不會(huì)有所改變。但是同源性比較如果針對(duì)全部的基因來進(jìn)行比對(duì)，實(shí)際上是非常巨大的工程，不太可行，目前國際上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)來進(jìn)行細(xì)菌型的分辨，因此在相似性的比較上可以用16S rRNA來進(jìn)行比對(duì)而得到其同源性。所以本發(fā)明所使用的支原體抗原并不限定于本發(fā)明所使用的野外分離株，16s rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(包含約50個(gè)功能域)。[0016]因此，本發(fā)明中，所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16SrRNA的同源性至少為80%的菌株。優(yōu)選所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16SrRNA的同源性至少為90%的菌株。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株，更優(yōu)選的是，所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16S rRNA的同源性為98%~99%的菌株。即在不改變豬肺炎支原體16S rRNA的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過簡單的篩選或誘變本發(fā)明的豬肺炎支原體，獲得與本發(fā)明豬肺炎支原體16S rRNA高度同源的菌株，并獲得相應(yīng)地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。
[0017]同樣，在本發(fā)明中，所述胸膜肺炎放線桿菌抗原包含至少一種在對(duì)豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗豬傳染性胸膜肺炎的免疫應(yīng)答的胸膜肺炎放線桿菌抗原。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為豬胸膜肺炎放線桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬胸膜肺炎放線桿菌細(xì)菌，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種。
[0019]本發(fā)明中所述用語“豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌全菌體”，是指豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的完整細(xì)胞體。
[0020]本發(fā)明中所述用語“豬胸膜肺炎放線桿菌”，也稱為“豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌”或“胸膜肺炎放線桿菌”(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),該病原菌生長要求嚴(yán)格，為革蘭氏陰性球桿菌，有莢膜。
[0021]同樣，本發(fā)明中所述用語“豬胸膜肺炎放線桿菌抗原”，也稱為“豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原”或“胸膜肺炎放線桿菌抗原”。
[0022]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述胸膜肺炎放線桿菌抗原選自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗(1、2、7型)；專利文件CN 102058880中的傳染性胸膜肺炎放線桿菌HT株(豬傳染性胸膜肺炎HT株的分離、鑒定與定型試驗(yàn)，中國動(dòng)物檢疫，1999，16(2):7~9)、52株(保藏編號(hào)為 CGMCC N0.4215)、DY 株(保藏編號(hào)為 CGMCC N0.4216)中的一種或幾種。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為滅活形式的全菌體。優(yōu)選所述豬胸膜放線桿菌抗原為滅活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌體。
[0024]所述胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株(ActinobaciIIuspIeuropneumoniaeserotypeI strain LC, APP-1)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011458 ；所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5strainYC，APP-5)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011459 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型 YS 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7 strain YS, APP-7)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011460 ;上述菌種均保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))。保藏日期均為2011年12月9日。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，在所述疫苗組合物中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌滅活前血清I型LC株含量為IO8~10lclCFU/ml，血清5型YC株含量為IO8~10lclCFU/ml，血清7型YS株含量為IO8~101(lCFU/ml。優(yōu)選在所述疫苗組合物中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌滅活前血清I型LC株含量為109CFU/ml，血清5型YC株含量為109CFU/ml，血清7型YS株含量為109CFU/ml。
[0026]在本發(fā)明中，所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體的附加抗原，其選自豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的抗原、豬瘟抗原、豬偽狂犬病毒(PRV)抗原、豬圓環(huán)病毒抗原(PCV)、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、豬流感病毒(SIV)中的一種或幾種。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗組合物還包括疫苗輔劑，并且，在所述疫苗組合物中，所述疫苗輔劑含量為10wt%~60wt%。
[0028]在本發(fā)明中，所述疫苗輔劑包括疫苗佐劑、防腐劑、代謝油混合物、稀釋劑。其中，所述疫苗佐劑為氫氧化招膠、礦物油、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel 01 (法國 SEPPIC)、蜂膠、ISA206(法國 SEPPIC)、ISA760VG (法國 SEPPIC)，優(yōu)選卡波姆(Carbomer)(商品名 Carbopol)、Ge 101 (法國 SEPPIC)、ISA206 (法國 SEPPIC)、ISA760VG (法國 SEPPIC)，更優(yōu)選卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、GelOl (法國SEPPIC),更優(yōu)選卡波姆(Carbomer)(商品名 Carbopol)。
[0029]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述疫苗組合物的制備方法，包括配苗步驟:將抗原與疫苗輔劑混合制得抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物，其中，所述抗原包括豬肺炎支原體抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
[0030]可任意選擇的，在配苗步驟中，所述抗原還包括其它豬的病原體的附加抗原。
[0031]根據(jù)本發(fā)明方法，所述方法還包括在配苗步驟之前的抗原準(zhǔn)備步驟，包括制備抗原，或者通過其他方法獲得抗原，如直接購置抗原。所述制備抗原包括分別培養(yǎng)豬肺炎支原體和豬胸膜肺炎放線桿菌，并分別進(jìn)行濃縮，獲得豬肺炎支原體抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。優(yōu)選所述制備抗原包括分別培養(yǎng)豬肺炎支原體和豬胸膜肺炎放線桿菌，并分別進(jìn)行滅活、濃縮，獲得豬肺炎支原體滅活抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌滅活抗原。
[0032]本發(fā)明還提供了一種 根據(jù)本發(fā)明所述的疫苗組合物在稀釋PRSS疫苗中的應(yīng)用。
[0033]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供了一種含有豬肺炎支原體與豬胸膜肺炎放線桿菌的二聯(lián)多價(jià)疫苗組合物，該疫苗組合物免疫程序簡單，能同時(shí)有效的防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎。該產(chǎn)品既可產(chǎn)生抗體，又同時(shí)具有攻毒保護(hù)，其免疫效果至少與分別注射單苗效果相當(dāng)，副反應(yīng)小，血清抗體效價(jià)高，免疫期長，耗時(shí)少、費(fèi)力少、對(duì)豬的侵害也小。該疫苗組合物生產(chǎn)工藝簡單，免疫成本低廉，實(shí)用性強(qiáng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是實(shí)施例1中豬肺炎支原體HN0613的狄氏染色結(jié)果圖。
[0035]圖2是實(shí)施例1中豬肺炎支原體HN0613的PCR鑒定結(jié)果圖。
[0036]圖2中附圖標(biāo)記的含義如下:1 Marker DL 2000 ；2病料分離株HN0613 ；3致病性試驗(yàn)分離株；4陰性對(duì)照。
[0037]圖3是實(shí)施例1中豬胸膜肺炎放線桿菌的PCR鑒定結(jié)果圖
[0038]圖3中附圖標(biāo)記的含義如下:I Marker ；2豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株；3豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株；4豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株。
[0039]mmm
[0040]豬肺炎支原體HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2012年6月13日，保藏編號(hào):CCTCC NO:M 2012230。
[0041]胸膜肺炎放線桿菌血清I 型 LC 株(Actinobacillus pleuropneumoniaeserotypelstrain LC, APP-1),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號(hào):CCTCC NO:M2011458。
[0042]豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype5 strain YC, APP-5),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保減中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)洛咖山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號(hào):CCTCCN0:M 2011459。
[0043]豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype7 strain YS, APP-7),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保減中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)洛咖山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行 保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號(hào):CCTCCN0:M 2011460。
[0044]為獲得免疫性強(qiáng)的菌種，各菌種經(jīng)敏感豬體復(fù)壯鑒定合格后凍干保存并保藏。
【具體實(shí)施方式】
[0045]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0046]實(shí)施例
[0047]實(shí)施例1:豬肺炎支原體HN0613的分離鑒定
[0048]1.材料與方法
[0049](I)材料
[0050]①病料來源
[0051]2006年從河南省各地采集疑似豬支原體肺炎病變肺臟，共16份。
[0052]②培養(yǎng)基
[0053]豬肺炎支原體Friis培養(yǎng)基購自BD公司；豬血清購自GIBCO公司；酚紅指示劑購自美國AMRESC0公司。
[0054]③試劑
[0055]生化試劑及化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0056]細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，狄氏染色試劑盒購自于重慶龐通醫(yī)療器械有限公司。生化鑒定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。
[0057]④陰、陽性血清
[0058]兔抗豬肺炎支原體J株特異性血清，按參考文獻(xiàn)方法制備(Meens，J.，Selke,M.，Gerlach, G.F.，2006.1dentification and immunological characterizationof conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 and Mhp651.Vet.Microbiol.116:85~95)。未免兔血清作為陰性血清。
[0059]2.方法[0060](I)病料處理
[0061]取疑似支原體肺炎病變肺臟，在超凈臺(tái)內(nèi)用無菌手術(shù)剪刀剪取發(fā)病部位邊緣組織，放入無菌平皿，將病肺組織剪成I~2_3碎塊，接種Friis肉湯，37°C培養(yǎng)，每日觀察培養(yǎng)液PH值變化。培養(yǎng)液變色時(shí)，取第一代經(jīng)0.45 ii m過濾器過濾的培養(yǎng)物0.5ml接種到
1.5ml含青霉素2000U/ml的Frris肉湯培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基變黃后直接取培養(yǎng)物進(jìn)行移植傳代，如培養(yǎng)物變色，進(jìn)行涂片，分別進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢。如革蘭氏染色未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，同時(shí)瑞氏染色發(fā)現(xiàn)支原體樣菌體時(shí)，取0.2ml培養(yǎng)物涂布于Frris平板固體培養(yǎng)基表面，置37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)，每日觀察是否有支原體樣菌落。取支原體樣單個(gè)菌落接種于Friis肉湯,培養(yǎng)基顏色變黃后取0.2ml培養(yǎng)物涂布于Frris平板固體培養(yǎng)基表面置37°C ,5% CO2條件下進(jìn)行純化培養(yǎng)，如此進(jìn)行純化培養(yǎng)2次。將最后一次純化培養(yǎng)生長的支原體樣菌落接種Frris液體培養(yǎng)基所得的顏色變黃培養(yǎng)物保存于_70°C備用。
[0062](2)菌落狄氏染色
[0063]按參考文獻(xiàn)進(jìn)行(曹澍澤.獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M]，北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992:49~50，126~129，371~373)，采用無菌方法從固體培養(yǎng)基上切下菌落，放到載玻片上，在兩邊墊上竹簽，滴上狄氏染色液后再蓋上一塊玻片，置于4°C染色30min后低倍鏡下觀察結(jié)果。
[0064](3) PCR鑒定及測序分析
[0065]用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA模板。PCR引物參考文獻(xiàn)進(jìn)行合成(J.Caron, M.0uardani, and S.Dea.Diagnosis and Differentiation of Mycoplasmahyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplificationof the p36 and p46 Genes[J].Journal of clinical microbiology,2000,38(4):1390~1396)。 FSp36，5’ -GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3’ Rsp36，5’ -GCCGCGAAATTAAATATTTTTAAITGCATCCTG-3’，上海生工合`成。PCR 反應(yīng)體系:超純水 34.5 y 1、10XPCR Buffer 5u I,dNTP 4 ill、引物各2 ill、模板2 ill、TaqDNA聚合酶0.5 ill。按下列參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng):預(yù)變性 94°C 3min ；94°C 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 90s，35 個(gè)循環(huán)后;72°C終延伸 IOmin0 擴(kuò)增結(jié)束后取上述產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測。直接將有特異性條帶的PCR產(chǎn)物及引物提交至上海生工進(jìn)行測序分析。
[0066](4)生化試驗(yàn):
[0067]生化試驗(yàn)參考文獻(xiàn)進(jìn)行(曹澍澤.獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M]，北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992:49~50，126~129，371~373)。主要進(jìn)行洋地黃皂甙敏感性試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、葡萄糖分解試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、三苯基氯化四氮唑(TTC)還原試驗(yàn)、七葉甙水解試驗(yàn)、甘露醇分解試驗(yàn)、薄膜和斑點(diǎn)形成試驗(yàn)。
[0068](5)生長抑制試驗(yàn)(GIT)
[0069]Friis平板接種0.1ml對(duì)數(shù)生長期的豬肺炎支原體培養(yǎng)物，將未稀釋的抗血清25 Ul吸附于滅菌的6mm濾紙片，將吸附有血清的濾紙片貼附于平板表面，培養(yǎng)至菌落可見。正常兔血清處理的紙片作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)觀察圓紙片周圍有無菌落抑制環(huán)的產(chǎn)生。抑制寬度達(dá)2mm以上時(shí)判為豬肺炎支原體陽性。
[0070](6)分離菌株的致病性[0071]將分離菌株培養(yǎng)物經(jīng)氣管注射I~2周齡健康易感豬3頭，每頭5ml (HN0613,108CCU/ml)。另設(shè)3頭條件相同的對(duì)照豬，各氣管注射培養(yǎng)基5ml，作為對(duì)照。試驗(yàn)豬、對(duì)照豬隔離飼養(yǎng)。攻毒后按常規(guī)飼養(yǎng)，飼料中無抗生素。觀察28日，每日測體溫。注射28日后剖檢，根據(jù)豬支原體肺炎肺病變指數(shù)記分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)豬的肺病變進(jìn)行記分。試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行肺病變指數(shù)差異分析。對(duì)試驗(yàn)豬及對(duì)照豬按實(shí)施例1第2部分方法(4)中“生化試驗(yàn)”的方法進(jìn)行豬肺炎支原體的分離，對(duì)分離株按實(shí)施例1第2部分方法(3)中“PCR鑒定及測序分析”的方法進(jìn)行PCR鑒定。
[0072]3.結(jié)果
[0073](I)培養(yǎng)結(jié)果
[0074]16份病料中僅有1份病料接種的培養(yǎng)基7日后變黃色，過濾接種后5日培養(yǎng)液變黃，培養(yǎng)液均勻混濁，轉(zhuǎn)接于含青霉素的Friis培養(yǎng)基變色后，革蘭氏染色未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，瑞氏染色發(fā)現(xiàn)支原體樣菌體。轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基后，菌落生長入培養(yǎng)基內(nèi)部。菌落呈典型煎荷包蛋狀，與支原體菌落形態(tài)相符，命名為HN0613株豬肺炎支原體。
[0075](2)狄氏染色結(jié)果
[0076]在低倍鏡下觀察到，在Friis固體培養(yǎng)基的豬肺炎支原體的菌落被染成不褪色的中心深藍(lán)色菌落(參見圖1)，與支原體菌落染色特性相符。
[0077](3) PCR 鑒定
[0078]所提取的分離培養(yǎng)物模板經(jīng)PCR擴(kuò)增后，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，待檢病料或培養(yǎng)物均在750~1000bp之間接近1000bp的位置有一條帶，與預(yù)期948bp相符(參見圖2)。
[0079](4)序列測定與分析
[0080]將所分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物測序與GenBank中進(jìn)行blast比較。結(jié)果顯示，HN0613分離菌株P(guān)36基因序列與NCBI中公布的Mhp P36基因序列相應(yīng)序列同源性為98%以上。測序結(jié)果見序列表。
[0081](5)生化及血清學(xué)鑒定
[0082]分離菌株生化反應(yīng)與豬肺炎支原體生化特性相符(表1)。
[0083]表1 HN0613分離株生化及生長抑制試驗(yàn)結(jié)果表
[0084]
【權(quán)利要求】
1.一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物，其包括豬肺炎支原體抗原、豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述豬肺炎支原體抗原為豬肺炎支原體全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬肺炎支原體細(xì)菌，或者含有豬肺炎支原體的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為豬胸膜肺炎放線桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬胸膜肺炎放線桿菌細(xì)菌，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的J株或HN0613株全菌體； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為滅活形式的全菌體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的HN0613株全菌體； 在所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體HN0613滅活前含量為IO8~1kiMhdceAiI ； 所述豬肺炎支原體HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain)的保藏編號(hào)為:CCTCCNO:M 2012230，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心； 所述豬胸膜放線桿菌抗原為滅活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌體； 在所述疫苗組合物中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌滅活前血清I型LC株含量為IO8~101QCFU/ml，血清5型YC株含量為IO8~10lclCFU/ml，血清7型YS株含量為IO8~IOiciCFU/ml ； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株(Actinobacillus pIeuropneumoniaeserotypel strain LC)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011458 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清 5 型 YC 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5 strain YC)的保藏編號(hào)為=CCTCC NO:M 2011459 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株(Actinobacilluspleuropneumoniae serotype7 strain YS)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011460 ;上述菌種均保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16S rRNA的同源性至少為80%的囷株； 在所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體HN0613抗原滅活前含量為2X 109MHDCE/ml ； 在所述疫苗組合物中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌滅活前血清I型LC株含量為IO9CFU/ml，血清5型YC株含量為109CFU/ml，血清7型YS株含量為109CFU/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于:所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其特征在于:所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體的附加抗原，其選自豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抗原、豬瘟抗原、豬偽狂犬病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、豬流感病毒中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其特征在于:所述疫苗組合物還包括疫苗輔劑，并且，在所述疫苗組合物中，所述疫苗輔劑含量為10wt%~ 60wt%。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1~8中任意一項(xiàng)所述疫苗組合物的制備方法，包括配苗步驟:將抗原與疫苗輔劑混合制得抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物，其中，所述抗原包括豬肺炎支原體抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:在配苗步驟中，所述抗原還包括其它豬的病原體的附加抗原。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求 1~6中任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物在稀釋PRSS疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/20GK103623400SQ201210305034
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月24日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司