一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉 及一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)資料表明目前中國(guó)每年新生腫瘤患者總數(shù)約212. 7萬(wàn)人左右，其中，每年有106萬(wàn)左右的惡性腫瘤新生患者；同時(shí)，全國(guó)約有268. 5萬(wàn)左右的腫瘤現(xiàn)有患者，其中惡性腫瘤現(xiàn)有患者148. 5萬(wàn)左右。以肺癌的發(fā)病率和死亡率為例，美國(guó)每年約有16萬(wàn)人死于肺癌，其中75%的患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。我國(guó)主要城市中，肺癌的發(fā)病率已占據(jù)各種惡性腫瘤發(fā)病率首位。我國(guó)每年有近80萬(wàn)人死于肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌患者約占 80-85% (McCracken M 等，2007，CACancer J Clin57:190-205)。由于肺癌的發(fā)展進(jìn)程快，早期不易發(fā)現(xiàn)，晚期易轉(zhuǎn)移，因此其死亡率很高?，F(xiàn)有的治療方法(如放療、化療等)副作用大、存在藥物抵抗性，治療效果有限，因此，尋求新的治療靶點(diǎn)和新的治療方法顯得十分必要。細(xì)胞凋亡是目前臨床上最常用的腫瘤治療原理，無(wú)論是化療或者放療都是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，但是腫瘤細(xì)胞常常會(huì)產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞凋亡的抵抗，從而極大地影響細(xì)胞凋亡治療腫瘤的效果。例如，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員中繼TNF，F(xiàn)as-L之后發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)凋亡分子。TRAIL具有選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，但對(duì)正常組織及細(xì)胞無(wú)凋亡誘導(dǎo)作用，并且TRAIL在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，具有較TNF、Fas-L所引起的炎癥反應(yīng)明顯較少的優(yōu)勢(shì)，因此TRAIL已成為新一代的抗腫瘤藥物的熱點(diǎn)分子(Walczak H等，1999，Nat Med5:157-163)，目前TRAIL已作為抗腫瘤藥物在美國(guó)正在II期臨床試驗(yàn)、在中國(guó)已經(jīng)完成III期臨床試驗(yàn)，主要用于治療難治性腫瘤如肺癌等，顯示出較好的治療效果。然而，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)仍有不少病人包括肺癌患者出現(xiàn)對(duì)TRAIL的藥物抵抗，大大降低了 TRAIL的治療效果，限制了 TRAIL的治療人群，因此，如何克服TRAIL等細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑治療中的藥物耐受成為迫切需要解決的一個(gè)問(wèn)題。熱休克蛋白HSP，除了作為分子伴侶幫助蛋白正確折疊等基本作用外，還以直接或間接的方式參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，其作用靶點(diǎn)涉及不同凋亡信號(hào)通路的各主要激酶或關(guān)鍵性調(diào)控蛋白(Jaattela M，1999，Exp Cell Res248:30-43)，從而可能會(huì)是引起TRAIL藥物耐受的原因之一。已有研究報(bào)道，利用HSP90特異性的抑制劑在體外抑制前列腺癌腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP90逆轉(zhuǎn)了前列腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的抵抗性(Ma Y等，2006，Mol CancerTher5:170-178)。該研究提示HSP90可能是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL抵抗性的一個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)。目前針對(duì)HSP90作為治療靶點(diǎn)的藥物geldanamycin和17-AAG已經(jīng)進(jìn)入臨床研究，然而，雖然geldanamycin和17-AAG有良好的抗腫瘤活性,但仍具有局限性，主要表現(xiàn)在穩(wěn)定性及溶解度有限，分子量大，能夠被細(xì)胞色素P450所代謝，生物利用率低，且geldanamycin具有嚴(yán)重的肝臟毒性，這些都使其臨床應(yīng)用受到了限制。由于HSP家族成員包括HSP110、HSP90、HSP70，中等分子量HSP和小分子量HSP五大家族，因此，其它熱休克蛋白，例如HSP27、HSP70,能夠作為腫瘤治療靶點(diǎn)和腫瘤治療策略和方法嗎？

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)TRAIL等細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑治療過(guò)程中存在的藥物抵抗難題，探索一種增加腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性的新方法，開(kāi)發(fā)一種新的、有效的肺癌治療策略。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種增加腫瘤組織或細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡敏感性的方法，其特征是通過(guò)抑制腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白HSP70的表達(dá)來(lái)增加腫瘤組織或細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白HSP70數(shù)量及活性的方法，其特征是通過(guò)常規(guī)的影響細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白HSP70數(shù)量及活性的方法或手段達(dá) 到通過(guò)抑制腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白HSP70的數(shù)量及活性來(lái)增加腫瘤組織或細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性的目的。例如，通過(guò)篩選HSP70轉(zhuǎn)錄的抑制劑抑制HSP70mRNA的轉(zhuǎn)錄，或者利用RNA干擾技術(shù)或者反義RNA技術(shù)降低HSP70mRNA的數(shù)量、或者利用HSP70蛋白質(zhì)合成的抑制劑或者通過(guò)加速HSP70蛋白質(zhì)的降解而減少HSP70蛋白質(zhì)的數(shù)量、或者利用HSP70的抑制劑抑制HSP70的功能及活性。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B活性的方法，其特征是通過(guò)常規(guī)的抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性的方法或手段達(dá)到增加腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF- K B活性的目的。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)死亡受體DR4和DR5表達(dá)水平的方法，其特征是通過(guò)常規(guī)的抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性的方法或手段達(dá)到提高腫瘤組織或細(xì)胞DR4和DR5表達(dá)水平的目的。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)JNK和C-Jun的磷酸化或活性的方法，其特征是通過(guò)常規(guī)的抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性的方法或手段達(dá)到提高腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)JNK和c-Jun的磷酸化或活性的目的。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)p53蛋白活性的方法，其特征是通過(guò)常規(guī)的抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性的方法或手段達(dá)到提高腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)P53蛋白活性的目的。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑促凋亡分子Bax、Bid、t-Bid的表達(dá)的方法，其特征是通過(guò)常規(guī)的抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性的方法或手段達(dá)到提高腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)Bax、Bid、t_Bid、capase3、capase8、capase9的表達(dá)、促進(jìn)腫瘤組織或細(xì)胞凋亡的目的。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白C-FLIP和Bcl-2表達(dá)的方法，其特征是通過(guò)常規(guī)的抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性的方法或手段達(dá)到降低腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)C-FLIP和Bcl-2表達(dá)、促進(jìn)腫瘤組織或細(xì)胞凋亡的目的。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞中熱休克蛋白表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡治療藥物聯(lián)合應(yīng)用的治療策略，其特征是將下調(diào)腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70的表達(dá)來(lái)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤治療藥物的藥物敏感性,增加腫瘤治療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力、從而顯著提高其抗腫瘤效果。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞中熱休克蛋白表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡治療藥物聯(lián)合應(yīng)用的治療策略，其特征是將下調(diào)腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70的表達(dá)來(lái)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑TRAIL的藥物敏感性，增加細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力、從而顯著提高其抗腫瘤效果。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織及細(xì)胞中HSP70及各細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)及活性的方法在分別制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控腫瘤組織及細(xì)胞中HSP70及各細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)及活性的方法在分別制備與細(xì)胞凋亡治療藥物聯(lián)合應(yīng)用的藥物中的應(yīng)用。
進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控細(xì)胞中HSP70及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)及活性的方法在分別制備促細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種調(diào)控細(xì)胞中HSP70及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)及活性的方法在分別制備與細(xì)胞凋亡治療藥物聯(lián)合應(yīng)用的藥物中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是首先構(gòu)建熱休克蛋白HSP70和HSP27的干擾質(zhì)粒psiHSP70和psiHSP27，分別以非小細(xì)胞癌A549SW1573、H460等細(xì)胞株為研究對(duì)象，驗(yàn)證了以上干擾質(zhì)粒的干擾效果，然后考查了 HSP70或HSP27通過(guò)RNA干擾后低表達(dá)與TRAIL治療聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。在細(xì)胞水平工作的基礎(chǔ)上，本發(fā)明又分別建立了 A549皮下實(shí)體瘤模型和原位肺癌模型，驗(yàn)證了 HSP70或HSP27通過(guò)RNA干擾后低表達(dá)與TRAIL聯(lián)用進(jìn)行體內(nèi)治療的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSP70和HSP27的干擾質(zhì)粒都能很好地下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70和HSP27的蛋白表達(dá)水平，在細(xì)胞水平與TRAIL聯(lián)用都可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而TRAIL、psiHSP70致HSP70低表達(dá)、psiHSP27致HSP27低表達(dá)單獨(dú)使用均不能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。與TRAIL聯(lián)用時(shí)，psiHSP70致HSP70低表達(dá)和psiHSP27致HSP27低表達(dá)兩種方法體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力相當(dāng)。在皮下實(shí)體瘤模型和原位肺癌模型實(shí)驗(yàn)時(shí)，HSP70和HSP27的干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)合治療的結(jié)果表明psiHSP70致HSP70低表達(dá)可顯著提高腫瘤對(duì)細(xì)胞凋亡治療方法的敏感性，顯著提高腫瘤組織和細(xì)胞凋亡及壞死，從而顯著抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)，而psiHSP27致HSP27低表達(dá)在體內(nèi)動(dòng)物模型上與TRAIL聯(lián)合治療不能達(dá)到顯著提高腫瘤對(duì)細(xì)胞凋亡治療方法的敏感性，不能提高腫瘤組織和細(xì)胞凋亡及壞死，不能顯著抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)。下調(diào)腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性顯著增強(qiáng)NF- κ B的ρ65亞基轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中、同時(shí)加速I K B的降解，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子NF- K B的活性，顯著上調(diào)NF- κ B下游靶基因一死亡受體DR4和DR5的表達(dá)水平，例如，下調(diào)腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性能將DR5的表達(dá)水平上調(diào)2倍、與TRAIL聯(lián)用時(shí)則能將DR5的表達(dá)水平上調(diào)6倍。下調(diào)腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性還能增加JNK和c-Jun的磷酸化、從而促進(jìn)P53蛋白的活化，p53蛋白的活化將導(dǎo)致下游靶基因一死亡受體DR4和DR5的表達(dá)水平上升、增加線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑促凋亡分子Bax、Bid、t_Bid、caspase3、caspase8、caspase9和細(xì)胞色素C的表達(dá)、同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白c_FLIP、Bcl_2的表達(dá),從而達(dá)到顯著提高腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性、提高腫瘤組織和細(xì)胞凋亡及壞死，顯著抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)的效果。與現(xiàn)有的抗腫瘤治療策略相比，本發(fā)明的創(chuàng)新和特別之處在于
(I)首次發(fā)明了一種通過(guò)調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性增加其對(duì)細(xì)胞凋亡治療藥物或治療方法敏感性的方法。(2)首次發(fā)明了一種調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞中HSP70表達(dá)、數(shù)量或活性與腫瘤細(xì)胞凋亡治療藥物聯(lián)合應(yīng)用、顯著增加抗腫瘤療效的治療策略。(3)首次發(fā)明了一種通過(guò)下調(diào)腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性能夠顯著增強(qiáng)NF- κ B的活性、顯著上調(diào)NF- κ B下游靶基因一死亡受體DR4和DR5的表達(dá)水平、增加JNK和c-Jun的磷酸化、促進(jìn)p53蛋白的活化、增加線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑促凋亡分子Bax、Bid、t_Bid、caspase3、caspase8、caspase9和細(xì)胞色素C等蛋白質(zhì)的表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白c-FLIP、Bcl-2等蛋白質(zhì)表達(dá)方法，從而達(dá)到顯著提高腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性、提高腫瘤組織和細(xì)胞凋亡及壞死，顯著抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)的效果。(4)調(diào)控HSP70表達(dá)、數(shù)量或活性能夠顯著增強(qiáng)腫瘤對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的敏感性，能 夠顯著增加抗腫瘤療效，這一特點(diǎn)不是通過(guò)下調(diào)所有熱休克蛋白都能夠取得的。更重要的是，即使調(diào)控某一 HSP的表達(dá)、數(shù)量或活性能夠在細(xì)胞水平顯著增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的敏感性，也不一定能夠在動(dòng)物模型水平達(dá)到顯著提高腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡治療方法的敏感性，不一定能夠顯著增加抗腫瘤療效。最顯著的例證就是本發(fā)明發(fā)現(xiàn)雖然調(diào)控HSP27的表達(dá)、數(shù)量或活性在細(xì)胞水平能夠有效增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性，其效果甚至與調(diào)控HSP70表達(dá)、數(shù)量或活性的效果相當(dāng)，但是HSP27的調(diào)控在體內(nèi)實(shí)體瘤治療上沒(méi)有產(chǎn)生明顯的增加抗腫瘤療效的治療效果。相形之下，調(diào)控HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性無(wú)論在細(xì)胞水平還是在動(dòng)物模型體內(nèi)都能增加腫瘤組織或細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡治療藥物或方法的敏感性，與細(xì)胞凋亡治療藥物或方法聯(lián)用能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，具有良好的抗腫瘤治療效果。(5)調(diào)控HSP70表達(dá)、數(shù)量或活性能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)敏感性的方法可以應(yīng)用于各種促細(xì)胞凋亡的治療，用于制備促細(xì)胞凋亡藥物。綜上所述，本發(fā)明了一種通過(guò)調(diào)控腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性增加其對(duì)細(xì)胞凋亡治療藥物或治療方法的敏感性的方法，將該方法與腫瘤細(xì)胞凋亡治療藥物或治療方法聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著增加抗腫瘤療效。利用該策略，有效解決了腫瘤組織或細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡治療抵抗的難題，達(dá)到了有效治療腫瘤的目的。
四

圖I. RNA干擾技術(shù)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)。1A. RT-PCR方法檢測(cè)RNA干擾后細(xì)胞內(nèi)HSP70的mRNA水平1、psiLUC; 2、psiHSP70。IB. RNA 干擾后細(xì)胞內(nèi) HSP70mRNA 水平的定量分析(*P < O. 05) :1、psiLUC; 2、psiHSP70。1C.用HSP70抗體Western blot檢測(cè)RNA干擾后細(xì)胞內(nèi)HSP70蛋白的表達(dá)水平
l、psiLUC;2、psiHSP70。ID. RNA干擾后細(xì)胞內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)水平的定量分析(*P < O. 05):l、psiLUC; 2、psiHSP70。圖2.細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)了 A549細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，抑制了 A549細(xì)胞的克隆形成能力。2A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)psiLUC、psiHSP70和TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞的凋亡率(*P < O. 05) :1、PBS; 2, psiLUC; 3, psiHSP70;4、PBS+TRAIL;5、psiLUC+TRAIL;6、psiHSP70+TRAIL。2B. Tunel凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)psiLUC、psiHSP70和TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞的凋亡情況。l、A549;2、A549+psiLUC ;3、A549+psiHSP70(*P < O. 05)。2C.A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同劑量的psiLUC或psiHSP70后TRAIL (40ng/ml)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。l、psiLUC;2、psiHSP70。2D.A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染O. 5μ gpsiLUC或psiHSP70后，不同劑量的TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(*P < O. 05)。2E. A549細(xì)胞經(jīng)psiLUC、psiHSP70和TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞的克隆 形成能力測(cè)定。l、A549;2、A549+psiLUC ;3、A549+psiHSP70 (*P < O. 05)。圖3. RNA干擾技術(shù)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)。3Α. RT-PCR方法檢測(cè)RNA干擾后細(xì)胞內(nèi)HSP27的mRNA水平1、psiLUC; 2、psiHSP27。3B. RNA 干擾后細(xì)胞內(nèi) HSP27mRNA 水平的定量分析(*P < O. 05) :1、psiLUC; 2、psiHSP7027。3C.用HSP27抗體Western blot檢測(cè)RNA干擾后細(xì)胞內(nèi)HSP27蛋白的表達(dá)水平l、psiLUC;2、psiHSP27。3D. RNA干擾后細(xì)胞內(nèi)HSP27蛋白表達(dá)水平的定量分析(*P < O. 05):l、psiLUC; 2、psiHSP27。圖4.細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)了 A549細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，抑制了 A549細(xì)胞的克隆形成能力。4A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)psiLUC、psiHSP70和TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞的凋亡率(*P < O. 05) :1、PBS; 2, psiLUC; 3, psiHSP27;4、PBS+TRAIL;5、psiLUC+TRAIL;6、psiHSP27+TRAIL。4B. Tunel凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)psiLUC、psiHSP27和TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞的凋亡情況。l、A549;2、A549+psiLUC ;3、A549+psiHSP27(*P < O. 05)。4C.A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同劑量的psiLUC或psiHSP27后TRAIL (40ng/ml)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。l、psiLUC;2、psiHSP27。4D. A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染O. 5 μ g psiLUC或psiHSP27后，不同劑量的TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(*P < O. 05)。4E. A549細(xì)胞經(jīng)psiLUC、psiHSP27和TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞的克隆形成能力測(cè)定。l、A549;2、A549+psiLUC ;3、A549+psiHSP27 (*P < O. 05)。圖5. HSP70、HSP27低表達(dá)對(duì)相關(guān)下游信號(hào)分子的調(diào)控和影響。5A. Western blot 檢測(cè) A549 細(xì)胞經(jīng) psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞內(nèi)Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Bax、Bad、Bid)的表達(dá)1、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL;4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。5B. Western blot 技術(shù)檢測(cè) A549 細(xì)胞經(jīng) psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)I K Ba和NF-KB p65的蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞核內(nèi)NF-kB p65的蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞質(zhì)中以GAPDH作為內(nèi)標(biāo)，細(xì)胞核中以Lamin B作為內(nèi)標(biāo)1、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL; 3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。5C. Western blot 技術(shù)檢測(cè) A549 細(xì)胞經(jīng) psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞內(nèi)c-FLIP-L的蛋白表達(dá)水平。I、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。5D. Western blot 技術(shù)檢測(cè) A549 細(xì)胞經(jīng) psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL 單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞內(nèi)P53和磷酸化p53的蛋白表達(dá)水平1、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL;4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。5E. Western blot 技術(shù)檢測(cè) A549 細(xì)胞經(jīng) psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞內(nèi)c-JUN、phospho-c-JUN, JNK, phospho-JNK的蛋白表達(dá)水 平。I、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL; 3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。圖6· A549細(xì)胞經(jīng)psiLUC、psiHSP70、psiHSP27和TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞內(nèi)DR4、DR5mRNA和蛋白水平的變化.6A. RT-PCR 技術(shù)檢測(cè) A549 細(xì)胞經(jīng) psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL 單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞內(nèi)DR4和DR5的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。I、psiHSP70+TRAIL; 2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。6B.圖 6A 的定量分析(*P〈0. 05)。I、psiHSP70+TRAIL; 2、psiHSP27+TRAIL; 3、psiLUC+TRAIL;4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。6C. Western blot 技術(shù)檢測(cè) A549 細(xì)胞經(jīng) psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞內(nèi)DR4和DR5的蛋白表達(dá)水平。I、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。圖7.體內(nèi)異位腫瘤動(dòng)物模型分析RNA干擾致HSP70低表達(dá)與TRAIL聯(lián)用的抗腫瘤治療效果。7A.腫瘤生長(zhǎng)曲線(*Ρ〈0· 05)。1、PBS對(duì)照；2、psiLUC對(duì)照；3,TRAIL ;4、psiHSP70 ；5、psiLUC+TRAIL ;6、psiHSP70+TRAIL。7B.腫瘤組織中 DR4、DR5 的 mRNA 水平。UPBS 對(duì)照;2、psiLUC 對(duì)照；3,TRAIL ;4、psiHSP70 ;5、psiLUC+TRAIL ;6、psiHSP70+TRAIL。圖8.體內(nèi)異位腫瘤動(dòng)物模型分析RNA干擾致HSP27低表達(dá)與TRAIL聯(lián)用的抗腫瘤治療效果。8A.腫瘤生長(zhǎng)曲線(*P〈0. 05): 1、PBS 對(duì)照;2、psiLUC 對(duì)照;3、TRAIL ;4、psiHSP27 ；5、psiLUC+TRAIL ;6、psiHSP27+TRAIL。8Β·腫瘤組織中 DR4、DR5 的 mRNA 水平:I、PBS 對(duì)照;2、psiLUC 對(duì)照;3、TRAIL ;4、psiHSP27 ;5、psiLUC+TRAIL ;6、psiHSP27+TRAIL。圖9.流式細(xì)胞儀檢測(cè)三種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NSCLC (A549，SW1573和H460)經(jīng)psiLUC、psiHSP70和TRAIL單獨(dú)處理或者聯(lián)合處理后細(xì)胞的凋亡率(*P<0. 05)。1、PBS;2、psiLUC;3、psiHSP70;4、PBS+TRAIL;5、psiLUC+TRAIL;6、psiHSP70+TRAIL。
圖10.體內(nèi)原位肺癌動(dòng)物模型分析RNA干擾致HSP70及HSP27低表達(dá)與TRAIL聯(lián)用的抗腫瘤治療效果。10A.熒光素活性檢測(cè)肺癌生長(zhǎng)曲線。I、PBS對(duì)照；2、TRAIL ;3、psiHSP27 ;4、psiHSP70 ;5、psiHSP27+TRAIL ;6、psiHSP70+TRAIL。10B.體內(nèi)原位肺癌動(dòng)物模型生存情況。I、PBS對(duì)照；2、TRAIL ;3、psiHSP27 ;4、psiHSP70 ;5、psiHSP27+TRAIL ;6、psiHSP70+TRAIL。
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一以RNA干擾技術(shù)下調(diào)腫瘤細(xì)胞或組織中HSP70的表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤藥物TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，治療小鼠A549實(shí)體瘤模型為實(shí)施例I、HSP70干擾質(zhì)粒的構(gòu)建米用Genscript公司的軟件siRNA target finder從HSP70序列內(nèi)選擇合適的革巴序列，然后再用Genscript公司的軟件siRNA Construct Builder構(gòu)建了可以連接到載體pRNAT-U6. Ι/Neo的用于干擾的DNA片段。該DNA片段包括正義鏈(sense strand,與目標(biāo)序列相同)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、反義鏈(antisense strand,與正義鏈互補(bǔ)),位于3’端可使轉(zhuǎn)錄終止的poly T信號(hào)；此外，為了便于與載體pRNAT-U6. 1/Neo相連,在兩端分別添加了 BamH I(G I GATCC),Hind III (A I AGCTT)的酶切位點(diǎn)。由Gensicript公司軟件設(shè)計(jì)出的用于HSP70RNA 干擾的片段如下5’ -GGATCCCGGACGAGTTTGAGCACAAGTTGATATCCGCTTGTGCTCAAACTCGTC CTTTTTTCCAAAAGCTT-3’。設(shè)計(jì)好的干擾序列的兩條互補(bǔ)單鏈由申能博彩生物科技有限公司合成。兩條片斷序列分別為5' -GATCCCGGACGAGTTTGAGCACAAGTTGATATCCGCTTGTGCTCAAACTCGTCCTTTTTTCCAAA-S'；5' - AGCTTTTGGAAAAAAGGACGAGTTTGAGCACAAGCGGATATCAACTTGTGCTCAAACTCGTCCGG-3’ 。本實(shí)驗(yàn)選用pRNA-U6. Ι/Neo作為表達(dá)HSP70干擾RNA的載體。將公司合成的兩條片斷退火得到雙鏈DNA，載體質(zhì)粒pRNAT-U6. Ι/neo用BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶酶切，退火后的dsDNA與酶切后的質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接從而得到HSP70的干擾質(zhì)粒psiHSP70。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增，用Ampcillin平板篩選并轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌落。用PCR鑒定出的陽(yáng)性克隆并交給上海博彩公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明HSP70的RNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建正確。具體步驟與條件如下合成的兩條互補(bǔ)單鏈退火得到dsDNA。退火步驟具體如下1 μ I正義鏈片段(1μ g/μ 1)，1μ I 反義鏈片段(1μ g/μ 1)，1μ I 20XSSC,17y I ddW，混合后置于 95°C 10分鐘，然后25°C I小時(shí)，最后稀釋混合物至終濃度為40ng/l·! I (I. 25倍稀釋)，_20°C存放備用。質(zhì)粒載體的酶切條件如下雙蒸水(ddW) 49 μ I, Buffer K 6 μ I, pRNAT_U6. 1/Neo1μ I (I μ g/μ I), BamH 12 μ 1，Hind ΙΙΙ2μ 1,60 μ I 酶切體系 37°C 酶切 3 小時(shí)。然后 3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒回收目的載體片段。DNA片斷與質(zhì)粒載體的連接條件如下2 μ I消化的載體，6 μ I退火產(chǎn)物，3μ 1T4DNA連接酶緩沖液，1μ I BSA, 2 μ I T4DNA連接酶，16 μ I ddW混勻后25°C反應(yīng)3小時(shí)，-20°C存放備用。2、HSP70干擾質(zhì)粒的干擾效果及其與TRAIL聯(lián)用在細(xì)胞水平誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡能力的檢測(cè)(1)HSP70干擾質(zhì)粒干擾效果分析A549細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新生牛血清的DMEM(含100U/ml青霉素和ΙΟΟμ g/ml鏈霉素)中，并放置37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后以每孔IX IO5個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，每孔加Iml完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，除去培養(yǎng)液，用制備的已經(jīng)靜置10-15分鐘的體積為ΙΟΟμ I的轉(zhuǎn)染復(fù)合物(100 μ I PBS，2yg質(zhì)粒,3 μ gGenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑),加入200 μ I無(wú)血清和無(wú)抗生素的培養(yǎng)液,混勻后得到共計(jì)300 μ I的轉(zhuǎn)染液，然后分別加入孔中，每孔300 μ I轉(zhuǎn)染液。37°C培養(yǎng)4小時(shí)后將24孔板中溶液吸出，每孔加入Iml完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收獲細(xì)胞進(jìn)行RT-PCT和western blot 分析。 RT-PCR:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，PBS洗滌一次。加入Iml TrizoK IO6個(gè)細(xì)胞)，用槍吹打至細(xì)胞完全溶解。室溫放置5分鐘。加入200 μ I的氯仿/mlTrizol，振蕩15秒后放置2-3分鐘，12000g離心15分鐘，2-8°C。吸取上層，轉(zhuǎn)移到干凈eppendorf管中，加入500 μ I異丙醇，放置10分鐘，12000g離心10分鐘，2-8°C?？梢?jiàn)RNA沉淀。棄去上清，加入lml75%乙醇洗滌沉淀，7500g離心5分鐘，在空氣中晾干RNA沉淀，加入30 μ I DEPC處理的DDW溶解。采用25μ I逆轉(zhuǎn)錄體系，將提取的模板RNA5y I與9. 5μ I oligo(dT)混勻，70°C變性5分鐘，立即轉(zhuǎn)移至冰上放置5分鐘。隨后加入AMV buffer 5μ l,dNTP 2. 5 μ l,RNaseInhibitor I μ I, AMV Reverse Transcriptase 2 μ I,混勻后 42°C水浴反應(yīng) I 小時(shí)。取等量的cDNA做模板做PCR擴(kuò)增，采用20 μ I PCR反應(yīng)體系:10 X Taq buffer 2 μ I，dNTP2 μ I，Mg2+ly I, DDWll. 5 μ 1，上游引物 I μ 1，下游引物 I μ 1，cDNA 模板 I μ 1，Taqpolymerase0. 5 μ I。PCR條件94 V熱變性4分鐘，94 V變性40秒，55 °C退火40秒，72 °C延伸40秒，循環(huán)數(shù)為25個(gè)，最后72°C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色。所用特異性引物為HSP70 正義鏈5，-GTGCCGGCCTACTTCAACGACTC-3'；HSP70 反義鏈5’-GCTGGCCTGGGTGCTGGACGACA-3'；GAPDH 正義鏈 W-AACGACCCCTTCATTGACHV ；GAPDH 反義鏈 j’-TCCACGACATACTCAGCACHV。Western blot :轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞沉淀洗滌一次后，加入細(xì)胞裂解液混勻，冰上放置30分鐘后，12000rpm離心15分鐘，吸取上清,通過(guò)考染法進(jìn)行蛋白定量，最后加入4X loading buffer沸水浴10分鐘,樣品便制備完成,可以-20°C保存。按照分子克隆中的配方配制12% SDS-PAGE膠，通過(guò)測(cè)定的樣品蛋白含量計(jì)算，盡可能保持各個(gè)樣品上樣量一致，上樣量為50μ g。采用恒壓進(jìn)行電泳分離，然后使用半干法將PAGE膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，恒流lmA/cm2電轉(zhuǎn)3小時(shí)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后用麗春紅S對(duì)膜進(jìn)行染色，直至出現(xiàn)紅色的蛋白條帶，標(biāo)記Marker的位置。然后配制5%的脫脂奶粉(PBST配制)對(duì)膜進(jìn)行包被，可以4°C封閉過(guò)夜或者25°C室溫I小時(shí)。包被結(jié)束后，用PBST將牛奶洗去，根據(jù)抗體說(shuō)明用PBST稀釋一抗(primary antibody)至最佳工作濃度,將膜一抗包被室溫孵育I小時(shí)或4°c過(guò)夜。然后將膜放置在搖床，用PBST洗滌5次，每次5-10分鐘。下一步為包被二抗，將HRP (辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的二抗1:2000PBST稀釋，與膜共同孵育I小時(shí)后，同樣PBST洗漆5次,每次5-10分鐘。最后，按照產(chǎn)品說(shuō)明配制發(fā)光底物溶液滴加于PVDF膜上，室溫放置1-2分鐘，用濾紙將多余發(fā)光液吸干，將膜用保鮮膜包被后放入壓片夾移入暗房，取X光片置于膜上曝光1-5分鐘后，沖洗膠片，根據(jù)曝光條帶判斷蛋白的表達(dá)結(jié)果O(2)HSP70干擾與TRAIL聯(lián)用在細(xì)胞水平誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡能力的檢測(cè)A,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，重懸于100 μ I的sample buffer中，一邊振蕩一邊滴加預(yù)冷的70%乙醇lml,4°C固定過(guò)夜。 然后3000rpm離心5分鐘，吸去上清，加入ImlPI染色液，混勻后室溫避光放置30分鐘以上，在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。使用cellquest軟件采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。B, TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，TUNEL試劑盒(德國(guó)默克公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。比較HSP70干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與否對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡效果的影響，設(shè)好各項(xiàng)平行對(duì)照。(3)HSP70干擾與TRAIL聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞克隆形成能力的影響分析克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSP70干擾質(zhì)粒前后對(duì)TRAIL的藥物敏感性。約300個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(不轉(zhuǎn)染細(xì)胞設(shè)為對(duì)照)均分到60mm的平皿中(設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn))，48小時(shí)后待細(xì)胞完全貼壁后加入TRAIL處理細(xì)胞，48小時(shí)后，細(xì)胞換上完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14天，每5天換一次培養(yǎng)基。14天培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行Giemsa染色，計(jì)數(shù)每個(gè)平皿中的細(xì)胞克隆數(shù)(30個(gè)細(xì)胞以上的集落算作一個(gè)克隆)。比較HSP70干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與否的A549細(xì)胞在TRAIL處理后的克隆形成能力，計(jì)算下調(diào)HSP70表達(dá)后細(xì)胞對(duì)TRAIL的藥物敏感度的增加倍數(shù)。藥物敏感度增加倍數(shù)計(jì)算公式如下Al=(psiHSP70轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形成的克隆數(shù)-TRAIL和psiHSP70聯(lián)合處理后的細(xì)胞形成的克隆數(shù))/psiHSP70轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形成的克隆數(shù)A2=(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成的克隆數(shù)-TRAIL單獨(dú)處理后的細(xì)胞克隆數(shù))/未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成的克隆數(shù)藥物敏感度增加倍數(shù)=A1/A23、分析HSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞受體凋亡通路和線粒體凋亡通路上關(guān)鍵蛋白的影響將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘,然后離心并定量,在加入上樣緩沖液后，做樣,用caspase-8、caspase_3、caspase-9、PARP、Bcl-2、Bax、Bid、Bad、cytochrome c 的特異性抗體進(jìn)行 western blot 技術(shù)分析各蛋白的表達(dá)變化情況4、分析HSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后A549細(xì)胞TRAIL的受體蛋白DR4和DR5的表達(dá)變化將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，一部分細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR技術(shù)分析細(xì)胞中DR4和DR5的mRNA水平；另外一部分細(xì)胞加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后離心并定量，在加入上樣緩沖液后，做樣，用DR4和DR5的特異性抗體進(jìn)行western blot技術(shù)分析DR4和DR5的蛋白水平5、分析HSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)NF- κ B信號(hào)通路的影響將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到Α549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的 細(xì)胞，用細(xì)胞核制備試劑盒(上海將來(lái)試劑有限公司)制備細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白，然后分別加入上樣緩沖液后，做樣，用NF- κ Bp65,1 κ Ba ,GAPDH和Lamin B的特異性抗體進(jìn)行western blot技術(shù)分析各蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)變化情況。6、分析HSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)c_FLIP_L蛋白表達(dá)水平的影響將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后離心并定量，在加入上樣緩沖液后，做樣，用c-FLIP-L的特異性抗體進(jìn)行western blot技術(shù)分析蛋白的表達(dá)變化情況。7、分析HSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)p53和磷酸化p53蛋白表達(dá)水平的影響將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后離心并定量，在加入上樣緩沖液后，做樣，用p53和磷酸化p53 (81位蘇氨酸位點(diǎn))的特異性抗體進(jìn)行western blot技術(shù)分析蛋白的表達(dá)變化情況。8、分析HSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路的影響將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后離心并定量，在加入上樣緩沖液后，做樣，用c-JUN、ph0Sph0-C-JUN、JNK、phospho-JNK的特異性抗體進(jìn)行western blot技術(shù)分析蛋白的表達(dá)變化情況。9、聯(lián)合應(yīng)用HSP70干擾質(zhì)?；蛑委熍cTRAIL藥物治療的抗腫瘤效率分析(I)裸鼠A549實(shí)體瘤皮下模型的建立將A549細(xì)胞用PBS懸浮至濃度為5 X IO6個(gè)/ml，然后每只裸鼠右側(cè)背部皮下經(jīng)皮下注射ΙΟΟμ L(5X IO5細(xì)胞)，注意觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，大約在一周左右，原位腫瘤大小生長(zhǎng)至約125mm3時(shí)，根據(jù)治療方法的不同將小鼠分成六組，每組8只，開(kāi)始治療。六組的治療方式分別為1)空白對(duì)照組(不做任何治療);2)siRNA pRNT-U6. I空載質(zhì)粒對(duì)照(psiLUC)注射治療；3) TRAIL藥物治療；4)HSP70干擾質(zhì)粒(psiHSP70)注射治療；5) siRNA pRNT_U6. I空載質(zhì)粒(psiLUC)對(duì)照+TRAIL聯(lián)合治療；6) HSP70干擾質(zhì)粒(psiHSP70) +TRAIL聯(lián)合治療。干擾質(zhì)?；蛑委煼绞矫扛?天治療一次，一共治療3次。具體方法是將混合好的干擾質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合物直接注射到腫瘤組織中，首次治療是注射20 μ I (5μ I HSP70干擾質(zhì)粒(I μ g/μ 1)，5 1 GenEscort Reagent 轉(zhuǎn)染試劑(I μ g/μ I), 10 μ I PBS)混合物，后兩次治療是注射 40 μ I (10 μ I HSP70 干擾質(zhì)粒(I μ g/ μ I )，10 μ I GenEscort Reagent 轉(zhuǎn)染試劑(I μ g/ μ I )，20 μ I PBS)混合物。首次干擾質(zhì)?；蛑委熀箝_(kāi)始TRAIL腹腔注射治療，每天注射一次，每次注射100 μ g, 一共治療14天。(2)實(shí)體瘤中干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率鑒定待腫瘤大小生長(zhǎng)至約125mm3，開(kāi)始在瘤體內(nèi)注射psiLUC (空載干擾質(zhì)粒)和轉(zhuǎn)染試劑的混合物，在注射后的第0、1、2、3、4、5天，取腫瘤組織切片，熒光顯微鏡下直接觀察轉(zhuǎn)染效率(3)腫瘤生長(zhǎng)曲線分析從開(kāi)始分組治療，每?jī)商鞙y(cè)量腫瘤大小，并按下列公式計(jì)算腫瘤體積
O.5236XLI X (L2)2,其中LI為腫瘤長(zhǎng)軸，L2為腫瘤短軸。開(kāi)始治療后第17天,處死小鼠。并通過(guò)回歸方程計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)曲線。
(4)腫瘤組織內(nèi)DR4和DR5的表達(dá)水平分析在腫瘤治療后的第15天取腫瘤組織，加入Trizol，勻漿后提取RNA，用DR4和DR5特異性的引物進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，分析腫瘤組織中DR4和DR5的mRNA水平。DR4 特異性引物為5’ -CCGCGGCCACACCCAGCAAAGT-3’ 和5，-GCAGCAGGACCCCGACGACGACA-3，；DR5 特異性引物為5’ -GTGGGGACCCTGAGCGTGTG-3’ 和5’-CTCCAAGGCATCCAGCAGGGTGTG-3’實(shí)施例二以RNA干擾技術(shù)下調(diào)腫瘤細(xì)胞或組織中HSP27的表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤藥物TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，治療小鼠A549實(shí)體瘤模型為實(shí)施例I、HSP27干擾質(zhì)粒的構(gòu)建HSP27干擾質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建方法同實(shí)施例一所述。由Gensicript公司軟件設(shè)計(jì)出的用于 HSP27 RNA 干擾的片段如下5’ -GGATCCCGTCTCATCGGATTTTGCAGTTGATATCCGCTGCAAAATCCGATGAGACTTTTTTCCAAAAGC-3’，由申能博彩生物科技有限公司合成的兩條片段序列為5’-GATCCCGTCTCATCGGATTTTGCAGTTGATATCCGCTGCAAAATCCGATGAGACTTTTTTCCAAA-3’ 和5’-AGCTTTTGGAAAAAAGTCTCATCGGATTTTGCAGCGGATATCAACTGCAAAATCCGATGAGACGG-3’ 。2、HSP27干擾質(zhì)粒的干擾效果及其與TRAIL聯(lián)用在細(xì)胞水平誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡能力的檢測(cè)(1)HSP27干擾質(zhì)粒干擾效果分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理方法同實(shí)施例一所述，分別進(jìn)行RT-PCT和western blot分析其干擾效果。RT-PCR所用特異性引物為HSP27 正義鏈5’-CGCGCTCAGCCGGCAACTCAG-3’ ；HSP27 反義鏈5’-CGGCAGCAGGGGTGGGCATCC-3’ ；GAPDH 正義鏈5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’ ；GAPDH 反義鏈5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’ ；(2)HSP27干擾與TRAIL聯(lián)用在細(xì)胞水平誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡能力的檢測(cè)A，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法同實(shí)施例一所述。B, TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法同實(shí)施例一所述。(3)HSP27干擾與TRAIL聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞克隆形成能力的影響分析克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSP27干擾質(zhì)粒前后對(duì)TRAIL的藥物敏感性。方法同實(shí)施例一所述。
3、分析HSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞受體凋亡通路和線粒體凋亡通路上關(guān)鍵蛋白的影響將HSP27干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘,然后離心并定量,在加入上樣緩沖液后，做樣,用caspase-8、caspase_3、caspase-9、PARP、Bcl_2、Bax、Bid、Bad、cytochromec 的特異性抗體進(jìn)行 western blot 技術(shù)分析各蛋白的表達(dá)變化情況。4、分析HSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后A549細(xì)胞TRAIL的受體蛋白DR4和DR5的表達(dá)變化將HSP27干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，一部分細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR技術(shù)分析細(xì)胞中DR4和DR5的mRNA水平；另外一部分細(xì)胞加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后離心并定量，在加入上樣緩沖液后，做樣，用DR4和DR5的特異性抗 體進(jìn)行western blot技術(shù)分析DR4和DR5的蛋白水平。5、分析HSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)NF- κ B信號(hào)通路的影響將HSP27干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到Α549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，用細(xì)胞核制備試劑盒(上海將來(lái)試劑有限公司)制備細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白，然后分別加入上樣緩沖液后，做樣，用NF- κ Bp65, I κ B a , GAPDH和Lamin B的特異性抗體進(jìn)行westernblot技術(shù)分析各蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)變化情況。6、分析HSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)c-FLIP-L蛋白表達(dá)水平的影響將HSP27干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后離心并定量，在加入上樣緩沖液后，做樣，用c-FLIP-L的特異性抗體進(jìn)行western blot技術(shù)分析蛋白的表達(dá)變化情況。7、分析HSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)p53和磷酸化p53蛋白表達(dá)水平的影響將HSP27干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后離心并定量，在加入上樣緩沖液后，做樣，用p53和磷酸化p53 (81位蘇氨酸位點(diǎn))的特異性抗體進(jìn)行western blot技術(shù)分析蛋白的表達(dá)變化情況。8、分析HSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路的影響將HSP27干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后離心并定量，在加入上樣緩沖液后，做樣，用c-JUN、ph0Sph0-C-JUN、JNK、phospho-JNK的特異性抗體進(jìn)行western blot技術(shù)分析蛋白的表達(dá)變化情況。9、聯(lián)合應(yīng)用HSP27干擾質(zhì)?；蛑委熍cTRAIL藥物治療的抗腫瘤效率分析(I)裸鼠A549實(shí)體瘤皮下模型的建立
將A549細(xì)胞用PBS懸浮至濃度為5X IO6個(gè)/ml，然后每只裸鼠右側(cè)背部皮下經(jīng)皮下注射ΙΟΟμ L(5X105cell)，注意觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，大約在一周左右，原位腫瘤大小生長(zhǎng)至約125mm3時(shí)，根據(jù)治療方法的不同將小鼠分成六組，每組8只，開(kāi)始治療。六組的治療方式分別為1)對(duì)照組(不做任何治療)；2) siRNA pRNT-U6. I空載質(zhì)粒對(duì)照(psiLUC)注射治療；3)TRAIL藥物治療；4)HSP27干擾質(zhì)粒(psiHSP27)注射治療；5)siRNA pRNT_U6. I空載質(zhì)粒(psiLUC)+TRAIL聯(lián)合治療；6) HSP27干擾質(zhì)粒(psiHSP27)+TRAIL聯(lián)合治療。干擾質(zhì)?；蛑委煼绞矫扛?天治療一次，一共治療3次。具體方法是將混合好的干擾質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合物直接注射到腫瘤組織中，首次治療是注射20 μ I (5 μ I干擾質(zhì)粒(I μ g/μ 1),5μ I GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑(I μ g/μ I )，10 μ I PBS)混合物，后兩次治療是注射 40 μ I (10 μ I 干擾質(zhì)粒(I μ g/μ I), 10 μ I GenEscort Reagent 轉(zhuǎn)染試劑(I μ g/μ I )，20μ1 PBS)混合物。首次干擾質(zhì)?；蛑委熀箝_(kāi)始TRAIL腹腔注射治療，每天注射一次，每次注射100 g，一共治療14天。(2)實(shí)體瘤中干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率鑒定方法同實(shí)施例一所述。(3)腫瘤生長(zhǎng)曲線分析方法同實(shí)施例一所述。 (4)腫瘤組織內(nèi)DR4和DR5的表達(dá)水平分析在腫瘤治療后的第15天取腫瘤組織，加入Trizol，勻漿后提取RNA，用DR4和DR5特異性的引物進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，分析腫瘤組織中DR4和DR5的mRNA水平。實(shí)施例三HSP70干擾與TRAIL聯(lián)用在細(xì)胞水平誘導(dǎo)多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NSCLC (A549，SW1573和H460)凋亡能力的檢測(cè)(流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡)將HSP70干擾質(zhì)粒通過(guò)GenEscort Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到A549, SW1573和H460細(xì)胞中，24小時(shí)后加入TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18小時(shí)后收獲處理后的細(xì)胞，重懸于100 μ I的sample buffer中，一邊振蕩一邊滴加預(yù)冷的70%乙醇lml,4°C固定過(guò)夜。然后3000rpm離心5分鐘，吸去上清，加入Iml PI染色液，混勻后室溫避光放置30分鐘以上，在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。使用cellquest軟件采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。實(shí)施例四在肺癌原位腫瘤模型上聯(lián)合應(yīng)用HSP70、HSP27低表達(dá)治療與TRAIL藥物治療的抗腫瘤效率分析I、裸鼠A549實(shí)體瘤原位模型的建立裸鼠，6-7周齡，雌性。將帶有熒光素酶的A549-luc-c8細(xì)胞用PBS懸浮至濃度為7X IO7個(gè)/ml，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定活性后，將30 μ I細(xì)胞懸液和30 μ I基質(zhì)膠(Matrigel)混勻，在快凝固之前以胰島素注射針將混懸液共60μ I沿裸鼠左肩胛線第6肋間緩慢穿刺進(jìn)針約8mm后向肺內(nèi)注射，每只實(shí)驗(yàn)裸鼠接種細(xì)胞數(shù)約2Χ106個(gè)。接種后，采用冷泉港公司Caliper小動(dòng)物活體成像儀觀察肺部腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，接種兩周后，根據(jù)治療方法的不同將小鼠分成六組，每組8只，開(kāi)始治療。六組的治療方式分別為1)對(duì)照組(不做任何治療)；2) TRAL藥物治療；3) HSP27干擾質(zhì)粒(psiHSP27)注射治療；4) HSP70干擾質(zhì)粒(psiHSP70)注射治療；5) HSP27干擾質(zhì)粒(psiHSP27) +TRAIL聯(lián)合治療；6) HSP70干擾質(zhì)粒(psiHSP70)+TRAIL聯(lián)合治療。干擾質(zhì)粒基因治療方式每隔5天治療一次，一共治療3次。具體方法是將混合好的干擾質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合物直接注射到腫瘤組織中，每次注射 20 μ I (5 μ I HSP70 或 HSP27 干擾質(zhì)粒(lyg/μ 1)，5μ IGenEscort Reagent 轉(zhuǎn)染試劑(1μδ/μ1),10μ1 PBS)混合物。首次干擾質(zhì)粒基因治療后開(kāi)始TRAIL腹腔注射治療，每天注射一次，每次注射100 μ gg, 一共治療21天。2、腫瘤生長(zhǎng)曲線分析從腫瘤細(xì)胞移植后開(kāi)始，每周用小動(dòng)物活體成像儀觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，測(cè)量熒光素酶的活性(每秒的光子數(shù))，并通過(guò)回歸方程計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)曲線。3、荷瘤小鼠生存率分析從腫瘤細(xì)胞移植后開(kāi)始，每日監(jiān)控小鼠存活情況直至腫瘤細(xì)胞移植后的第75天。上述發(fā)明實(shí)施例充分顯示本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了下調(diào)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性、并增強(qiáng)抗腫瘤藥物的抗腫瘤治療效果。利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)了 A549腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP70的mRNA與蛋白水平的表達(dá)(圖I)，在低劑量(40ng/μ I)TRAIL誘導(dǎo)后，流式細(xì)胞儀和TUNEL凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了下調(diào)A549腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)增 強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，增加了細(xì)胞的凋亡率(圖2)。并且，在40ι^/μ1 TRAIL誘導(dǎo)下，細(xì)胞凋亡率與轉(zhuǎn)染的psiHSP70干擾質(zhì)粒量呈劑量依賴關(guān)系(圖2)。同樣地，在轉(zhuǎn)染一定量的psiHSP70 (OAyg)后，細(xì)胞凋亡率與TRAIL的用量呈劑量依賴關(guān)系(圖2)。克隆形成實(shí)驗(yàn)表明psiHSP70與TRAIL聯(lián)合處理顯著抑制了 A549細(xì)胞的克隆形成能力(圖2)，HSP70的表達(dá)下調(diào)使A549細(xì)胞對(duì)TRAIL的藥物敏感度增加了 52. 5倍(圖2)。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了下調(diào)HSP27的表達(dá)、數(shù)量及活性可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性。利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)了 A549腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP27的mRNA與蛋白水平的表達(dá)(圖3)，在低劑量(40ng/ μ I )TRAIL誘導(dǎo)后，流式細(xì)胞儀和TUNEL凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)下調(diào)A549腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，增加了細(xì)胞的凋亡率(圖4)。并且，在40ng/l·! I TRAIL誘導(dǎo)下，細(xì)胞凋亡率與轉(zhuǎn)染的psiHSP27干擾質(zhì)粒量呈劑量依賴關(guān)系(圖4)，同樣地，在轉(zhuǎn)染一定量的psiHSP27 (O. 5 μ g)后，細(xì)胞凋亡率與TRAIL的用量呈劑量依賴關(guān)系(圖4)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)表明psiHSP27與TRAIL聯(lián)合處理顯著抑制了 A549細(xì)胞的克隆形成能力(圖4)，HSP27的表達(dá)下調(diào)使A549細(xì)胞對(duì)TRAIL的藥物敏感度增加了 47. 5倍(圖4)。由上可見(jiàn)，在細(xì)胞水平下調(diào)HSP27的表達(dá)、數(shù)量及活性可以產(chǎn)生與HSP70相似的增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡敏感性的效果。因此，下調(diào)HSP70與HSP27的表達(dá)、數(shù)量及活性都有可能作為一種增加腫瘤組織或細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡敏感性的方法。本發(fā)明通過(guò)Western blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)與HSP27相比，下調(diào)A549腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性后，用TRAIL誘導(dǎo)激活了 caspase家族蛋白(caspase-8、caspase-9、caspase_3)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)和PARP的剪切,增加了 Bcl_2家族促凋亡蛋白Bax、Bad、t-Bid的表達(dá)，下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(圖5)，并促進(jìn)了細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。與HSP27相比，RNA干擾技術(shù)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性后激活了NF-κ B信號(hào)通路，從而增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性。對(duì)于HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性下調(diào)的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)I κ Ba和NF-κ B p65的蛋白表達(dá)水平下降，細(xì)胞核內(nèi)NF-κ Bρ65的蛋白表達(dá)水平增加(圖5)，從而證明NF-κ B ρ65發(fā)生了從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，從而在細(xì)胞核中發(fā)生轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。與HSP27相比，RNA干擾技術(shù)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性后顯著降低了細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白質(zhì)c-FLIP-L的表達(dá)(圖5)，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性。
與HSP27相比，RNA干擾技術(shù)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性后顯著增加了細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子P53的表達(dá)和磷酸化水平(81位蘇氨酸位點(diǎn)的磷酸化)，導(dǎo)致p53蛋白質(zhì)的活化(圖5)。p53可以激活凋亡信號(hào)蛋白質(zhì)DR4/5的表達(dá)、Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性。與HSP27相比，RNA干擾技術(shù)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性后顯著增加了細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-JUN的表達(dá)及其磷酸化、JNK的磷酸化，導(dǎo)致c-JUN和JNK的激活(圖5)。c-JUN和JNK的激活可以激活p53蛋白質(zhì)和Bid、t-Bid等的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白c-FLIP-L的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性。進(jìn)一步地,通過(guò)Western blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)在TRAIL誘導(dǎo)下，與HSP27相比較，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性后，細(xì)胞內(nèi)TRAIL的受體蛋白DR4和DR5mRNA的表達(dá)水平增加(圖6),蛋白表達(dá)水平增加(圖6)。通過(guò)Western blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)下調(diào)A549腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)、數(shù)量及活性后用TRAIL誘導(dǎo)激活了 caspase家族蛋白(caspase-8、caspase9、caspase-3)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)和PARP的剪切(圖6),增加了 Bcl_2家族促凋亡蛋白 Bax、Bad、t-Bid的表達(dá)，下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(圖6)，并促進(jìn)了細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步地，通過(guò)Western blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)在TRAIL誘導(dǎo)下，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)、數(shù)量及活性后，細(xì)胞內(nèi)TRAIL的受體蛋白DR4和DR5mRNA的表達(dá)水平并沒(méi)有明顯增加(圖6)，蛋白表達(dá)水平也無(wú)明顯增加(圖6)。進(jìn)一步，將下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性治療方法與TRAIL聯(lián)用，在A549實(shí)體腫瘤模型上評(píng)價(jià)其抑瘤效果。首先考察了體內(nèi)干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，psiLUC質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑注射到實(shí)體瘤體內(nèi)后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)干擾質(zhì)?？稍诹鲶w內(nèi)抑制持續(xù)數(shù)天，轉(zhuǎn)染效率較高，保證了體內(nèi)基因治療的可行性。接下來(lái)考察了 psiHSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用的抑瘤效果，在第24天，psiHSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)合抑瘤率為64% (圖7)，顯示了明顯的抗腫瘤效果(與對(duì)照組相比P〈0. 05)。而psiHSP70干擾質(zhì)粒單獨(dú)治療組、TRAIL單組治療組抑瘤效果與對(duì)照組相比均不顯著(圖7)，因此，psiHSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL顯示了很好的協(xié)同治療效應(yīng)，顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。RT-PCR技術(shù)顯示在腫瘤治療后的第15天，psiHSP70干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)合治療導(dǎo)致腫瘤組織中TRAIL的受體DR4和DR5的表達(dá)水平增加(圖7)，從而增加腫瘤組織了對(duì)TRAIL的藥物敏感性，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到了腫瘤治療的目的。進(jìn)一步，再下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)、數(shù)量及活性治療方法與TRAIL聯(lián)用，在A549實(shí)體腫瘤模型上評(píng)價(jià)其抑瘤效果。在第24天，psiHSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)合抑瘤率為25%(圖8)，治療效果與對(duì)照組相比并不顯著，而TRAIL和psiHSP27單獨(dú)治療的抑瘤率分別為21%和41%(圖8)，治療效果與對(duì)照組相比也不顯著，說(shuō)明psiHSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)用沒(méi)有顯示明顯的協(xié)同治療效應(yīng)，沒(méi)能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。RT-PCR技術(shù)顯示在腫瘤治療后的第15天，psiHSP27干擾質(zhì)粒與TRAIL聯(lián)合治療組中DR4和DR5的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，沒(méi)有明顯的增加(圖8)，因此下調(diào)HSP27在體內(nèi)不能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的藥物敏感性，腫瘤組織對(duì)TRAIL藥物抵抗，不能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。進(jìn)一步，本發(fā)明在多種腫瘤細(xì)胞(A549，SW1573和H460上比較了下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性對(duì)腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性的影響，結(jié)果顯示，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性能夠在多種細(xì)胞內(nèi)大大增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的敏感性，使原來(lái)對(duì)細(xì)胞凋亡不敏感的腫瘤細(xì)胞變?yōu)閷?duì)細(xì)胞凋亡極其敏感(圖9)。進(jìn)一步，本發(fā)明在肺癌原位腫瘤模型上比較和驗(yàn)證了聯(lián)合應(yīng)用下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70或HSP27的表達(dá)、數(shù)量及活性與TRAIL藥物治療的抗腫瘤效果。結(jié)果顯示只有下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性與TRAIL聯(lián)合進(jìn)行治療才能產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效果、即顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性；將下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)、數(shù)量及活性與TRAIL聯(lián)合進(jìn)行治療則不具有這種效果。因此，這說(shuō)明這種顯著增強(qiáng)的腫瘤治療效果不是HSP類蛋白質(zhì)所共有的，而是HSP70所特有的；而且，這種效果不是僅從細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)就可以獲得、推斷或衍生的，因?yàn)镠SP27和HSP70在細(xì)胞 水平表現(xiàn)出相同的增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的敏感性。因此，并非下調(diào)所有熱休克蛋白的表達(dá)、數(shù)量或活性都能作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。進(jìn)一步，本發(fā)明在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平都證明通過(guò)下調(diào)腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量或活性能夠顯著增強(qiáng)NF- κ B的活性、顯著上調(diào)NF- κ B下游靶基因一死亡受體DR4和DR5的表達(dá)水平、增加JNK和c-Jun的磷酸化、促進(jìn)p53蛋白的活化、增加線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑促凋亡分子Bax等蛋白質(zhì)的表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白c-FLIP、Bcl-2等蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，從而達(dá)到顯著提高腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性、提高腫瘤組織和細(xì)胞凋亡及壞死，顯著抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)的效果。HSP70的這種特性不是HSP類蛋白質(zhì)所共有的，例如HSP27即使在細(xì)胞水平也沒(méi)有這種性質(zhì)。我們同時(shí)還針對(duì)來(lái)源于肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，也獲得了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法，其特征是通過(guò)常規(guī)的影響細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)、數(shù)量及活性的方法及手段達(dá)到通過(guò)抑制組織及細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)、數(shù)量及活性來(lái)增加組織及細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性，上述常規(guī)的影響細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)、數(shù)量及活性的方法及手段是指通過(guò)篩選HSP70轉(zhuǎn)錄的抑制劑抑制HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄的方法，利用RNA干擾技術(shù)和反義RNA技術(shù)降低HSP70 mRNA的數(shù)量的方法，利用HSP70蛋白質(zhì)合成抑制劑和通過(guò)加速HSP70蛋白質(zhì)的降解而減少HSP70蛋白質(zhì)數(shù)量的方法，利用HSP70的抑制劑抑制HSP70的功能及活性的方法。
2.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在調(diào)控組織及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-K B及活性中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在調(diào)控組織及細(xì)胞內(nèi)死亡受體DR4和DR5表達(dá)及活性中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在調(diào)控組織及細(xì)胞內(nèi)JNK和c-Jun的磷酸化及活性中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在調(diào)控組織及細(xì)胞內(nèi)P53蛋白及活性中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在調(diào)控組織及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑促凋亡分子Bax、Bid、t-Bid、capsase 3> capsase 8、capsase 9的表達(dá)和促細(xì)胞凋亡活性中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在調(diào)控組織及細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白C-FLIP和Bcl-2表達(dá)及活性中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在促細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在制備與細(xì)胞凋亡治療藥物聯(lián)合應(yīng)用的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在制備與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白TRAIL聯(lián)合應(yīng)用的藥物中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求I所述的一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0表達(dá)、數(shù)量及活性的方法及其應(yīng)用。利用本發(fā)明還能夠調(diào)控腫瘤組織及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及活性、死亡受體DR4和DR5表達(dá)及活性、JNK和c-Jun的磷酸化及活性、p53蛋白的表達(dá)及活性、促凋亡分子Bax、Bid、t-Bid、capsase3、capsase8、capsase9表達(dá)及其促細(xì)胞凋亡活性、抗凋亡蛋白c-FLIP和Bcl-2表達(dá)及活性，促進(jìn)腫瘤組織及細(xì)胞凋亡。本發(fā)明還涉及上述方法在制備與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)藥物聯(lián)合應(yīng)用的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102816792SQ20121029366
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者華子春, 莊紅芹 申請(qǐng)人:南京大學(xué)