土霉素，普羅帕酮和安乃近的抗腫瘤作用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及三種非臨床抗腫瘤藥物，被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用，主要是能夠顯著抑制肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。要解決的技術(shù)問(wèn)題：利用肺腺癌A549細(xì)胞和子宮頸癌Hela細(xì)胞篩選一些臨床用藥，以得到具有具有抗腫瘤作用的非臨床抗腫瘤藥物。解決該問(wèn)題的技術(shù)方案的要點(diǎn)：應(yīng)用飽和濃度的藥物處理肺腺癌A549細(xì)胞和子宮頸癌Hela細(xì)胞48h，通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化。對(duì)有抑制作用的藥物，再進(jìn)行細(xì)胞生存率和LDH活性檢測(cè)，Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡。主要用途：發(fā)現(xiàn)顯著抑制肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的非臨床抗腫瘤藥物，用于肺癌或者子宮頸癌患者的臨床治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】土霉素，普羅帕酮和安乃近的抗腫瘤作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及三種藥物的抗腫瘤作用的新功能。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及三種非臨床抗腫瘤藥物，被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用，主要是能夠顯著抑制肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。
【背景技術(shù)】
[0002]臨床試驗(yàn)是新藥研制的最后一環(huán)，它需要花費(fèi)巨資資金。老藥新用，特別是發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐應(yīng)用的“老藥”具有新用途的意義十分巨大，其價(jià)值絕不低于發(fā)現(xiàn)一種新藥。目前幾乎沒(méi)有一種藥物能達(dá)到完全治愈肺癌或者宮頸癌等癌癥患者的功能，因此，尋找一種有效的、特異的、毒副作用小的新型抗腫瘤藥物是至關(guān)重要的。
[0003]很多老藥的新用途都是臨床醫(yī)生在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的，具有較大的偶然性。如果有意識(shí)，有計(jì)劃地檢測(cè)一些臨床用藥的新用途，就可能更快地，更多地發(fā)現(xiàn)它們的新用途，應(yīng)用于臨床，會(huì)緩解甚至解除患者的病痛，會(huì)產(chǎn)生很大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。這是一種有效的和節(jié)儉的發(fā)現(xiàn)新藥的途徑。
[0004]土霉素(oxytetracycline),普羅帕酮(propafenone)和安乃近(metamizol ；dipyrone)等藥物都是非臨床抗腫瘤藥物，利用肺腺癌A549細(xì)胞和子宮頸癌Hela細(xì)胞篩選這些臨床用藥，可能發(fā)現(xiàn)它們抗腫瘤作用的新用途。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]在本發(fā)明中在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)土霉素，普羅帕酮和安乃近這些非臨床抗腫瘤藥物，具有抗腫瘤作用。具體說(shuō)，土霉素，普羅帕酮和安乃近都能夠顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，而只有普羅帕酮能夠顯 著抑制子宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。
[0006]土霉素，普羅帕酮和安乃近對(duì)肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞生存率的抑制作用。使用濃度為0.005g/L至0.2g/L的土霉素，普羅帕酮或安乃近，分別處理肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞48h，應(yīng)用SRB方法檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，普羅帕酮能夠以濃度依賴(lài)的方式顯著抑制子宮頸癌Hela細(xì)胞的生存率，而土霉素和安乃近抑制作用不顯著(圖1A)。這三種藥物都能夠以濃度依賴(lài)的方式顯著抑制肺癌A549細(xì)胞的生存率(圖1B)。通過(guò)測(cè)到的細(xì)胞生存率，計(jì)算半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(IC5tl),結(jié)果在表1中。
[0007]土霉素，普羅帕酮和安乃近對(duì)肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞形態(tài)的影響。當(dāng)使用濃度大于0.014g/L的普羅帕酮處理子宮頸癌Hela細(xì)胞48h后，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察，與對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)細(xì)胞變圓，破碎等現(xiàn)象。當(dāng)使用濃度分別為0.1，
0.02，or 0.lg/L的土霉素，普羅帕酮和安乃近處理肺癌A549細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，也出現(xiàn)細(xì)胞變圓，破碎等現(xiàn)象(圖2)。
[0008]土霉素，普羅帕酮和安乃近對(duì)肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞LDH活性的影響。分別使用濃度為0.lg/L，0.02g/L or 0.lg/L的土霉素，普羅帕酮和安乃近處理A549細(xì)胞或者Hela細(xì)胞48h，以濃度為0.1%的DMSO處理組作為對(duì)照組，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組的LDH值。通過(guò)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的LDH值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，結(jié)果顯示各組間無(wú)顯著性差異，表明這些藥物抑制這些腫瘤細(xì)胞的增殖，不是通過(guò)化學(xué)刺激等促進(jìn)細(xì)胞壞死的途徑發(fā)揮作用的(圖3)。
[0009]土霉素，普羅帕酮和安乃近誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡。當(dāng)使用濃度為0.014g/L或者更高的普羅帕酮處理Hela細(xì)胞48h后，應(yīng)用Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，普羅帕酮能夠顯著促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡(圖4)。說(shuō)明普羅帕酮主要是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制Hela細(xì)胞增殖的作用。當(dāng)使用濃度為0.014g/L的普羅帕酮，或者濃度為0.lg/L 土霉素和安乃近處理A549細(xì)胞48h后，應(yīng)用Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，土霉素和安乃近都能夠顯著促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡，而普羅帕酮不能夠顯著促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡。說(shuō)明土霉素和安乃近主要是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制A549細(xì)胞增殖的作用，而普羅帕酮不是主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期等途徑發(fā)揮抑制A549細(xì)胞增殖 的作用。
[0010]本發(fā)明使醫(yī)療界首次認(rèn)識(shí)到，土霉素，普羅帕酮和安乃近，這三種藥物都能夠以濃度依賴(lài)的方式顯著抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖。普羅帕酮能夠以濃度依賴(lài)的方式顯著抑制子宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。
[0011]本發(fā)明的有益結(jié)果是，臨床肺癌患者進(jìn)行常規(guī)抗腫瘤藥物治療的同時(shí)，服用土霉素，普羅帕酮和安乃近，可以在一定程度上抑制腫瘤的進(jìn)展，緩解患者的病情。臨床子宮頸癌患者進(jìn)行常規(guī)抗腫瘤藥物治療的同時(shí)，服用普羅帕酮所允許的最高劑量，可以在一定程度上抑制腫瘤的進(jìn)展，緩解患者的病情?？赡軙?huì)產(chǎn)生很大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
[0012]本發(fā)明可能促使化學(xué)家對(duì)土霉素，普羅帕酮和安乃近結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，研制出更有效的抗腫瘤藥物。
[0013]本發(fā)明會(huì)使更多的醫(yī)療衛(wèi)生工作者認(rèn)識(shí)到，有計(jì)劃地檢測(cè)一些臨床用藥的新用途，就可能更快地，更多地發(fā)現(xiàn)它們的新用途，這是一種有效的和節(jié)儉的發(fā)現(xiàn)新藥的途徑。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是藥物對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞生存率的影響。A:應(yīng)用土霉素(O)，普羅帕酮(P)，安乃近(M)或者0.1% DMSO處理Hela細(xì)胞48h。土霉素(ο)和安乃近(M)使用濃度為0.2g/L。普羅帕酮(P)使用從0.005g/L至0.02g/L的不同濃度。B:應(yīng)用土霉素(0)，普羅帕酮(P)，安乃近(M)或者0.1% DMSO處理A549細(xì)胞48h。土霉素(ο)使用濃度分別為 0.15g/L，0.lg/L 或 0.05g/L ;普羅帕酮(p)濃度分別為 0.03g/L，0.02g/L 或 0.01g/L。安乃近(M)使用濃度分別為0.2，0.1或0.05g/L。SRB法檢測(cè)細(xì)胞存活率(*p < 0.05，**p< 0.0I vs.對(duì)照)。
[0015]表1是土霉素，普羅帕酮和安乃近分別處理A549細(xì)胞或Hela細(xì)胞48h后半數(shù)生長(zhǎng)抑制率(IC5tl)值(g/L)。
[0016]圖2是藥物處理48h對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞形態(tài)的影響(200倍)。a_e =Hela細(xì)胞:A549細(xì)胞。A和f是對(duì)照，細(xì)胞經(jīng)過(guò)DMSO 0.1% (v/v)處理。b:土霉素的濃度為0.2g/L ；c:安乃近的濃度為0.2g/L ；d, e:普羅帕酮的濃度為0.012或0.014g/L。g和h:土霉素的濃度分別為0.1或0.15g/L。i和j:普羅帕酮和安乃近的濃度分別為0.02或
0.lg/L。[0017]圖3是藥物處理對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞LDH活性的影響。A:普羅帕酮(p)或
0.1 % DMSO處理Hela細(xì)胞48h。普羅帕酮(p)的使用濃度分別為0.012g/L或0.014g/L。B: 土霉素(O)，普羅帕酮(p)，安乃近(M)或0.1% DMSO處理A549細(xì)胞48h。土霉素(O)，普羅帕酮(P)，安乃近(M)的使用濃度分別為0.lg/L, 0.02g/L或0.lg/L。(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)
[0018]圖4是藥物處理對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞凋亡的影響。A:細(xì)胞凋亡形態(tài)圖；B和C:細(xì)胞凋亡比率。藥物或者0.1 % DMSO處理細(xì)胞48h，利用Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡。A:a-e =Hela細(xì)胞；f-j:A549細(xì)胞。a和f是對(duì)照。b:土霉素(ο)使用濃度為0.2g/L ；c:安乃近(M)使用濃度為0.2g/L ；d, e:普羅帕酮(P)使用濃度分別為0.012g/L或0.014g/Lo g和h:土霉素(ο)使用濃度分別為0.lg/L或0.15g/L。1:普羅帕酮(p)使用濃度分別為0.02g/L。j:安乃近(M)使用濃度為0.lg/L。B:與A部分中a_e對(duì)應(yīng)的Hela細(xì)胞凋亡比率。C:與A部分中f，g，i和j對(duì)應(yīng)的A549細(xì)胞凋亡比率。數(shù)據(jù)來(lái)源于3次不同的實(shí)驗(yàn)(*p < 0.05)。 【具體實(shí)施方式】
[0019]對(duì)臨床肺癌患者進(jìn)行常規(guī)抗腫瘤藥物治療的同時(shí)，服用土霉素，普羅帕酮和安乃近，可以在一定程度上抑制腫瘤的進(jìn)展，緩解患者的病情。臨床子宮頸癌患者進(jìn)行常規(guī)抗腫瘤藥物治療的同時(shí)，服用普羅帕酮所允許的最高劑量，可以在一定程度上抑制腫瘤的進(jìn)展，緩解患者的病情。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)現(xiàn)非臨床抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用的方法，主要是發(fā)現(xiàn)三種非臨床抗腫瘤藥物能夠顯著抑制肺癌A549細(xì)胞或者子宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。其特征在于利用肺腺癌A549細(xì)胞和子宮頸癌Hela細(xì)胞篩選一些臨床用藥，以得到具有具有抗腫瘤作用的非臨床抗腫瘤藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)容，其特征在于三種非臨床抗腫瘤藥物是土霉素(oxytetracycline),普羅帕酮(propafenone)和安乃近(metamizol)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)容，其特征在于土霉素，普羅帕酮和安乃近都能夠顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖；普羅帕酮能夠顯著抑制子宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)容，其特征在于利用顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量，初步篩選過(guò)具有抗腫瘤作用的臨床藥物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)容,其特征在于通過(guò)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞生存率和LDH活性的檢測(cè)，以及H0echst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分析所研究臨床藥物抗腫瘤作用的強(qiáng)弱和初步機(jī)制。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)容，其特征在于本方法利用肺腺癌A549細(xì)胞和子宮頸癌Hela細(xì)胞主動(dòng)地篩選一些臨床用藥，而不是通過(guò)臨床實(shí)踐被動(dòng)地發(fā)現(xiàn)老藥的新用途。
【文檔編號(hào)】A61K31/65GK103536607SQ201210251287
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月10日
【發(fā)明者】邵金輝 申請(qǐng)人:邵金輝