2-O-α-L-鼠李糖-4,6,4′-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的醫(yī)藥用途的制作方法

專利名稱：2-O-α-L-鼠李糖-4,6,4′-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
熱休克蛋白90(Heat shock protein，HSP90)，又名熱激蛋白90，大量存在于真核細(xì)胞中，是一類ATP依賴的分子伴侶，在維持構(gòu)型穩(wěn)定、保持活性和一些蛋白的降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用(Pearl LH, Prodromou C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annu Rev Biochem，2006，75 :271-294.)。HSP90 在胞漿內(nèi)主要以同源二聚體的形式存在。越來(lái)越多的證據(jù)表明，HSP90 二聚體在多種炎癥模型中具有促炎活性(Yeo M，et al. Blockage of HSP 90modulates Helicobacterpylori-induced IL_8 productions through the inactivation of transcriptionalfactors of AP-I and NF- κ B. Biochem Biophys Res Commun 2004;320:816-824;Murata M，et al. Heat shock protein 90 is required for increased DNA bindingactivity of activator protein-1, a heterodimer of Fos/JunD， in rheumatoidsynovial cells under inflammatory stimuli. Int J Mol Med2005 ; 15 (4) :649-653;Hsu HY, et al. Geldanamycin interferes with the 90—kDa heat shock protein，affecting lipopoIysaccharide-mediated interleukin-1 expression and apoptosiswithin macrophages. Mol Pharmacol 2007 ；71 (I) :344-356.)。HSP90 的多種客戶蛋白是在炎癥的信號(hào)通路中起重要作用的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，包括TAKl、Akt、IKK等(XinYu Liu, et al. HSP90 is required for TAKlstability but not for its activationin the pro-inflammatory signaling pathway. FEBS Lett. 2008 ；582 (29) :4023-4031;Sato S，et al. Modulation of Akt kinase activity by binding to HSP90. Proc NatlAcad Sci USA. 2000 ;97 (20) :10832-10837.)。其中 IKK 活化 NF-κ B 的作用可以被 HSP90抑制劑解除，表明HSP90是IKK活化NF-K B所必需的(Broemer M，eat I. Requirementof Hsp90activity for IkB kinase (IKK)biosynthesis and for constitutive andinducible IKK and NF-κ B activation. Oncogene. 2004 ；23(31) :5378-5386.)。NF-κ B是多種類型細(xì)胞中所表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子家族，是調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答系統(tǒng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥及膿毒癥中起到至關(guān)重要的作用。抑制NF-κ B活性，已成為治療炎癥及膿毒癥的新焦點(diǎn)。研究表明，HSP90抑制劑17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)具有明顯抗膿毒血癥活性。Chatterjee A發(fā)現(xiàn)17-AAG可以延長(zhǎng)LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥鼠存活時(shí)間，抑制炎癥反應(yīng)，減輕肺損傷(Chatterjee A，et al. Heat shock protein90 inhibitors prolong survival, attenuate inflammation, and reduce lung injuryin murine sepsis. Am J Respir Crit Care Med. 2007 ; 176 (7) :667-675.)，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，17-AAG發(fā)揮作用是通過(guò)抑制HSP90 N末端ATP酶活性實(shí)現(xiàn)的。N末端是ATP/ADP 的結(jié)合位點(diǎn)，與 HSP90 的功能關(guān)系密切(Prodromou C, Pearl LH. Structure andfunctional relationships of Hsp90. Curr Cancer Drug Targets,2003,3 :301-323.)。ATP/ADP結(jié)合部位起著構(gòu)象轉(zhuǎn)化區(qū)的作用，調(diào)節(jié)HSP90參與的多分子伴侶復(fù)合物的裝配。HSP90是通過(guò)形成多分子伴侶復(fù)合物來(lái)穩(wěn)定客戶蛋白的構(gòu)象的，若能夠抑制HSP90與促炎因子形成復(fù)合物使其構(gòu)象不穩(wěn)定，則能夠達(dá)到抗炎目的。此外，HSP90的客戶蛋白還包括 Raf-I、突 變型 BRaf、IGF-IR、Her2、C-Met,C-Kit、突變型EGFR等，在腫瘤的發(fā)展變化過(guò)程中，這些效應(yīng)蛋白均過(guò)度表達(dá)(PicardD. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and regulation. Cell Mol LifeSci，2002 ；59(10) :1640-1648.)。一系列研究表明，17-AAG在臨床前試驗(yàn)中對(duì)乳腺癌、骨髓瘤、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。目前，17-AAG作為一類新藥已經(jīng)進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)階段。綜上，設(shè)計(jì)或?qū)ふ乙訦SP90為作用靶點(diǎn)的藥物，對(duì)炎癥、膿毒血癥、以及腫瘤等疾病的防治，具有積極意義。另一方面，系列親和色譜(YamamotoK, Yamazaki A, Mikio Takeuchi M. Aversatile method of identifying specific binding proteins on affinity resins.Anal Biochem,2006, (352) :15-23.)是一種不受藥物溶解性、配基-蛋白復(fù)合物解離速度的影響，適合于水溶解性較差的化合物的尋找藥物作用靶點(diǎn)的分離純化方法。其原理是配基兩次與柱材上的結(jié)合蛋白作用，對(duì)比兩次洗脫液中蛋白條帶差異，確定特異性結(jié)合蛋白(圖I)。目前，已經(jīng)利用該法找到了 FK506的靶蛋白FKBP12、苯磺酰胺基的靶蛋白CA2、氨甲喋呤的靶蛋白二氫葉酸還原酶。是一種用于識(shí)別活性成分靶蛋白的常用方法之一。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，是一種指基于分子對(duì)接的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法，可利用從已建立的大規(guī)?；衔锏娜S結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)幾十到幾百萬(wàn)個(gè)化合物中搜尋與靶標(biāo)生物大分子活性部位或結(jié)合部位相匹配的化合物，也可利用分子對(duì)接技術(shù)佐證小分子與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了 2-0-a-L-鼠李糖-4，6，4'-三羥基二苯甲酮(以下簡(jiǎn)寫為THBP)作為HSP90抑制劑的用途，其可用于制備治療或預(yù)防與HSP90相關(guān)的疾病，如炎癥藥物。發(fā)明人利用系列親和色譜技術(shù)，識(shí)別2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮在人單核細(xì)胞株THP-I細(xì)胞中的特異性結(jié)合的蛋白(圖2)，并通過(guò)質(zhì)譜鑒定和蛋白免疫印跡技術(shù)鑒定該蛋白為HSP90。隨后利用計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接軟件G0LD，采用TOB code :3IED模板，初步確定THBP與HSP90的結(jié)合位點(diǎn)位于HSP90的N-末端(圖3，4)。在此基礎(chǔ)上，依據(jù)HSP90抑制劑的活性，采用角叉菜膠致小鼠足趾腫脹和脂多糖(LPS)致小鼠急性肺損傷兩個(gè)模型，證實(shí)THBP與HSP90抑制劑17-AAG體內(nèi)給藥具有類似活性，提示可作為新類型的HSP90抑制劑，用于防治HSP90介導(dǎo)的炎癥、膿毒血癥、腫瘤等重大疾病，具有廣闊的應(yīng)用前景。以下是具體

發(fā)明內(nèi)容
I基于系列親和色譜技術(shù)識(shí)別HSP90為THBP特異性結(jié)合蛋白實(shí)驗(yàn)材料Epoxy-activated sepharoseTM6B(GE Healthcare),氫氧化鈉(南京化學(xué)試劑有限公司，AR)，甲醇(江蘇漢邦科技有限公司，CR)，A8600-4000乙腈(Roe ScientificInc.)，高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO);青霉素，鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司);胰蛋白酶(南京生興生物技術(shù)有限公司)；新生牛血清(民海生物)；細(xì)胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)；亮肽素、抑肽酶、胰蛋白酶抑制劑(AMERESC0);溴酚藍(lán)(上海生工)；β-巰基乙醇(南京大治生物技術(shù)有限公司)；其他試劑均購(gòu)自南京化學(xué)試劑廠。THP-I細(xì)胞株(人白血病單核細(xì)胞株)，購(gòu)自 中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所。電子分析天平Mettler_ToledoInstr. (Shanghai) Ltd, DSHZ-300 多用途恒溫水浴振蕩器(江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，HP-Ol真空泵(江蘇漢邦科技有限公司)，Z-323K冷凍離心機(jī)(HERMLE，德國(guó))。實(shí)驗(yàn)方法精密稱取3· 53mg THBP 與 O. 0 Epoxy-activated sepharose 6B (EAS-6B)柱材進(jìn)行水浴震蕩反應(yīng)，溫度40°C，水浴振蕩20h，轉(zhuǎn)速110r/min，即得以THBP為配基的親和介質(zhì)。測(cè)定其偶聯(lián)率為39%。親和介質(zhì)取出后用pH8. O的IM乙醇胺封閉液浸泡過(guò)夜，并用高濃度pH4. O, pH8. O緩沖鹽交替3次沖洗待用。取制備好的THBP-EAS-6B柱材60 μ I與人白血病單核細(xì)胞THP-I細(xì)胞裂解液稀釋至Iml含量3mg進(jìn)行孵育，4°C條件下緩慢攪動(dòng)4h，瞬時(shí)離心，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，再另加入THBP-EAS-6B 60 μ 1，同上操作。取兩次孵育的柱材部分用定量緩沖液洗滌，加入變性劑煮沸5min，瞬時(shí)離心，分別得到上清液X，Y用于10% SDS-P AGE電泳，硝酸銀染色，對(duì)得到的凝膠進(jìn)行掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2所示，通過(guò)第一次與第二次特異性結(jié)合條帶的灰度值差異性分析，位于85KD與100KD之間的條帶，第一次特異性結(jié)合蛋白條帶的灰度值明顯大于第二次孵育的條帶的灰度值，推斷條帶為THBP的特異性結(jié)合條帶，通過(guò)質(zhì)譜鑒定和蛋白免疫印跡技術(shù)鑒定該蛋白為HSP90(圖3)。2基于計(jì)算機(jī)虛擬分析技術(shù)佐證THBP和HSP90的相互作用實(shí)驗(yàn)方法使用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的晶體模板TOB code 3IED,采用GOLD對(duì)接程序?qū)嵤┓肿訉?duì)接。模板TOB code :3IED中的自帶小分子的三維坐標(biāo)被用于定義活性區(qū)域，活性位點(diǎn)半徑為10A,范德華力和氫鍵相互作用的退火參數(shù)分別為4和2.5A,其他參數(shù)保持默認(rèn)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有文獻(xiàn)表明，許多HSP90抑制劑在N-末端區(qū)域與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合(圖4)，N-末端區(qū)域是重要的抑制劑結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果如圖5所示，初步確定THBP與HSP90的結(jié)合位點(diǎn)位于HSP90的N-末端，THBP位于HSP90的N-末端的空腔內(nèi)，與空腔契合較好。表明THBP與HSP90空腔契合較好，能作為HSP90潛在的抑制劑。3 THBP作為HSP90抑制劑的體內(nèi)活性驗(yàn)證3. I THBP不同劑量對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足趾腫脹的影響實(shí)驗(yàn)方法ICR小鼠50只，雄性，體重20±2g，隨機(jī)分為5組，即模型組、THBP I. 25mg/kg,5mg/kg,20mg/kg三組、陽(yáng)性對(duì)照組地塞米松(DEX,5mg/kg)。模型組灌胃給予相應(yīng)體積純凈水，其他各組灌胃給予相應(yīng)藥物，給藥后I小時(shí)足底注射4%角叉菜膠，用螺旋測(cè)微儀測(cè)量各組小鼠注射角叉菜膠后的1、2、3、5、8小時(shí)的足厚，并計(jì)算腫脹度。腫脹度(％)=(致炎前足厚一致炎后足厚)X 100% /致炎前足厚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表I可見(jiàn)，THBP 1.25、5、20mg/kg能抑制角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹。與對(duì)照組相比，在致炎第l、2、3、5、8h時(shí)，THBP I. 25mg/kg作用存在顯著或極顯著性差異；在致炎第I、2、8h時(shí)，THBP 5mg/kg作用存在顯著性差異或極顯著性差異，在致炎第I、2、3、5、8h時(shí)， THBP 20mg/kg作用存在顯著性差異或極顯著性差異。表I THBP對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(l±s，n=10)
劑g ...................................................................................................................腫脹度(%)............................................................................................................
"_(mg/kg)_l_h_2h__3h__5h_8h_
模型 I 26.08±4.97 27.26±6XI5 23/77±6^89 20.80t7.46 15.58±6.52 THBP 1.25 19.82土5.06* 18.67±.98** 18.38±3.16* 15.03±2.85* 10.25士 3.02*
5.0018.84±4.83** 19.49±5.20** 18.58±4.80 15.57±4.08 10.21 士 3.43*
20.0018.69士5.05** 19.35±4.09** 16.88±4.05* 14.42±3.23* 9.45±3.57* DEX 5.00 18.64±3.53** 16.21±4.18** 13.02 士5.37** 10.39±3.52** 4.54士 3.23***P < 0. 05，林P < 0. 01與模型組比較3. 2 THBP與17-AAG單劑量對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足趾腫脹的影響實(shí)驗(yàn)方法ICR小鼠40只，雄性，體重20±2g，隨機(jī)分為4組，即模型組、THBP I. 25mg/kg組、17-AAG組、陽(yáng)性對(duì)照DEX 1.25mg/kg組。各組給予相應(yīng)藥物后采用同上的方法進(jìn)行活性觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果由表2可見(jiàn)，THBP I. 25mg/kg能抑制角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹，且在致炎第l、5、8h時(shí)，與模型組相比存在顯著性差異；17-AAG I. 25mg/kg也能夠抑制足腫脹，且在致炎第8h時(shí)，與模型組作用存在顯著性差異。其中在致炎第Ih時(shí)，17-AAG與THBP組相比存在顯著性差異(P < O. 05)，提示即THBP比17-AAG起效較快。表2 THBP和17-AAG對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(}±s，n=10)
~~mZ\ 劑量腫脹度(％)
一_(mg/kg)_Ui_2h_3h_5h_8h_
^2438±5l2 2095± 88 Τ24±4Λ02 士 4.94
THBP 1.25 19.88 士5.10* 20.45土5.62 16.43士 S.64 12.98 士4.66* 9.25土 5.23*
17-AAG 1.25 24.44±5.07 21.48i4.34 16.57土4.62 14.44±5.02 9.34土 5.62* DEX 5.00 18,50士 7,41* 17,66 土5.64* 12.07土 4.91** 9.90±4.80** 5.30±3.91***Ρ < O. 05，林P < O. 01與空白對(duì)照組比較3. 3 THBP對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的影響實(shí)驗(yàn)方法ICR小鼠50只，雄性，體重20±2g，隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、THBP 5mg/kg, 17-AAG 5mg/kg組、陽(yáng)性對(duì)照DEX 3mg/kg組。除空白組、模型組灌胃給予相應(yīng)體積O. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液各組灌胃給予相應(yīng)藥物，Ih后除空白對(duì)照外每只小鼠尾靜脈注射30mg/kg的LPS無(wú)菌生理鹽水溶液。8h后處死小鼠，取右肺稱取濕重。將右肺置于60°C烘箱24h后稱取干重。記錄并計(jì)算肺干濕比。肺干濕比=右肺濕重/右肺干重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可見(jiàn)，模型組與空白組相比，肺濕比明顯增加，存在顯著性差異，提示模型小鼠出現(xiàn)明顯肺水腫。THBP與17-AAG 5mg/kg均可明顯降低小鼠急性肺損傷引發(fā)的肺水腫，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，與模型組相比，具有極顯著性差異。提示THBP與HSP90抑制劑類似，具有明顯抗肺損傷的活性。表3 THBP對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的影響(文±s, n=5)
權(quán)利要求
1.2-0- a -L-鼠李糖-4，6，4'-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的用途。其中2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮為圖I結(jié)構(gòu)化合物。
2.權(quán)利要求I的用途，2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮可用于制備治療炎癥藥物的用途。
3.權(quán)利要求I的用途，2-0-a-L-鼠李糖_4，6，4'-三羥基二苯甲酮可用于制備治療肺損傷及膿毒血癥的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的醫(yī)藥用途，其可用于制備治療或預(yù)防與熱休克蛋白90相關(guān)的疾病的藥物。具體為熱休克蛋白90抑制劑2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羥基二苯甲酮在防治急性炎癥、肺損傷或膿毒血癥的用途。
文檔編號(hào)A61P11/00GK102961391SQ20121015127
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者寇俊萍, 余伯陽(yáng), 鹿思思, 呂燕妮, 劉倩 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)