專利名稱：一種明膠納米球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于明膠球制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及ー種納米級、形態(tài)規(guī)則、尺寸均一、 分散度好的明膠納米球的制備方法。
背景技術(shù)：
明膠是膠原變性后形成的天然高分子，由于其具有良好的生物降解能力和生物相容性而被廣泛用于醫(yī)療和制藥行業(yè)。隨著生物材料科學(xué)的不斷發(fā)展，納米級明膠球以其具有比表面積大、小尺寸、無毒、無抗原性等特點(diǎn)而成為倍受青睞的藥物載體。當(dāng)藥物與明膠復(fù)合被制成載藥明膠納米球后，隨著納米球的穩(wěn)定降解，可以達(dá)到緩釋或控釋藥物的效果。 特殊的明膠納米球在體內(nèi)還可以達(dá)到靶向分布的作用。作為基因載體，明膠納米球還可以攜帯基因進(jìn)入細(xì)胞，從而對腫瘤等疾病進(jìn)行特異性治療。明膠納米球在未來的制藥領(lǐng)域中將具有廣泛的應(yīng)用前景。作為藥物和基因的載體，影響明膠納米球性能的因素主要包括明膠球的尺寸、分散程度和球形。它們不但決定明膠納米球的降解時間、藥物釋放特性，同時還決定明膠球能否進(jìn)入細(xì)胞。由于明膠溶液粘度大，在制備明膠納米球的過程中易發(fā)生球與球相互粘連甚至融合，從而使球的尺寸變大、相互粘連或球形不規(guī)則。這進(jìn)ー步導(dǎo)致明膠納米球釋放藥物的速度不穩(wěn)定，而且較大的或相互粘連的明膠納米球在結(jié)合基因后無法進(jìn)入細(xì)胞。目前制備明膠球的方法主要有乳化-凝聚法、單凝聚法和噴霧法。其中乳化-凝聚法利用油相乳化明膠溶液，過程相對繁復(fù)，且產(chǎn)物中易留有油相雜質(zhì)，制備出的明膠球大小不均。而噴霧法制備明膠球時要求的溫度較高，且往往制備出的明膠球尺寸相對較大，是制備微米級明膠球的常用方法。單凝聚法是最常用的制備納米級明膠球的方法。但利用該法制備明膠納米球時，由于明膠球在水相中不穩(wěn)定，制得的明膠納米球常存在粘連嚴(yán)重和球形不規(guī)則等問題。二次單凝聚法(two-step desolvation)以單凝聚法為基礎(chǔ),選取大分子量的明膠為材料制備明膠納米球，使得形成的明膠球在粘連和球形方面得到了一定程度的改善，但尺寸不均，球與球粘連、融合仍是明膠納米球制備過程中的技術(shù)難題。這使目前制備的明膠納米球在載藥與載基因方面的應(yīng)用受到了極大的限制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服明膠納米球制備技術(shù)的不足而在二次單凝聚法基礎(chǔ)上對明膠納米球制備方法提出的進(jìn)ー步改進(jìn)和創(chuàng)新，從而提供了一種制備納米級、形態(tài)規(guī)則、 尺寸均一、分散度好的明膠球的方法。這種明膠納米球可以作為藥物的載體，達(dá)到緩釋藥物或向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染基因的目的。本發(fā)明提出的制備明膠納米球的新方法，包括以下步驟I)取0. I Ig明膠加入到IOml水中，加熱溶解制備成明膠水溶液，向該明膠水溶液中加入IOml丙酮，獲得沉淀的明膠；2)用IOml溶液溶解沉淀的明膠，并將反應(yīng)體系的pH值調(diào)整為7. 0 9. 0 ;
3)在超聲和冰水浴條件下用20ml 80ml丙酮乳化步驟2)的明膠溶液，得到乳化體系；4)向上述乳化體系中加入IOOiU 400iU質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊ニ醛，繼續(xù)超聲和冰水浴3 5分鐘，然后將溶液固化；5)最后將固化后的溶液離心，用丙酮在超聲下清洗沉淀3 5次，烘干后得到明膠納米球。上述方法中，步驟I)中所用明膠為A型明膠，其等電點(diǎn)為7 9;步驟2)中的溶液是水或者是藥物活性物質(zhì)的水溶液；步驟3)中超聲的功率密度為0. 3w/cm2 0. 5w/ cm2，丙酮乳化明膠溶液是將明膠溶液逐滴加入到溫度為-20°C 10°C的丙酮中；步驟4)是在_20°C 10°C條件下固化Ih 48h ;步驟5)中的離心條件為9000r/min 13000r/min ； 是在50°C 60°C條件下烘干，從而得到明膠納米球。藥物活性物質(zhì)的水溶液可以是脫氧核糖核酸、肽、蛋白質(zhì)中的ー種，或兩種，或三種溶解于水后形成的藥物水溶液，濃度在I X 10_12g/ml I X 10_2g/ml范圍內(nèi)。其中脫氧核糖核酸可以是具有治療作用的脫氧核糖核酸片段，也可以是脫氧核糖核酸與載體形成的復(fù)合物，如質(zhì)粒、脫氧核糖核酸脂質(zhì)體復(fù)合物等。脫氧核糖核酸與明膠納米球的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)脫氧核糖核酸編碼的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到基因治療的目的。肽可以是具有治療作用的寡肽或多肽，例如胸腺肽、腦腺肽。蛋白質(zhì)可以是具有治療作用的簡單蛋白質(zhì)或結(jié)合蛋白質(zhì)，例如球蛋白、糖蛋白。肽和蛋白質(zhì)類藥物可以在體內(nèi)環(huán)境中隨著明膠納米球的不斷降解而被緩慢釋放，從而延長藥物的作用時間，減少給藥次數(shù)。藥物活性物質(zhì)的水溶液還可以是具有治療作用的無機(jī)物、有機(jī)物或各自相應(yīng)的鹽的水溶液，濃度在lXlO.g/ ml lXlO—ig/ml范圍內(nèi)。無機(jī)物及其相應(yīng)的鹽可以是無機(jī)化合物或絡(luò)合物，如氯化鉀、順鉬(Cl2H6N2Pt)15有機(jī)物及其相應(yīng)的鹽例如唑來膦酸，唑來膦酸鈉，辛伐他汀(C25H38O5)15上述藥物活性物質(zhì)還可以通過側(cè)鏈，吸附力，共價健或離子健結(jié)合到明膠納米球表面。例如首先在明膠納米球表面連接帶正電的多聚こ烯亞胺，形成側(cè)鏈后再連接脫氧核糖核酸。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)在明膠溶液乳化前，將其pH值調(diào)整為7.0 9.0范圍內(nèi)，即明膠溶液的等電點(diǎn)附近，有效消除或降低了明膠分子本身所帯電荷對球形和球粘連的影響；(2)與單凝聚法中將乳化劑加入到明膠溶液中不同，本發(fā)明中明膠溶液乳化采用反向乳化的方法，即將明膠溶液緩慢滴加到低溫的乳化劑中，這使乳化劑中的明膠溶液能及時且良好乳化；(3)采用低溫的乳化劑使明膠溶液乳化成球后可以快速凝固，從而避免球與球融合導(dǎo)致的球形不規(guī)則和尺寸變大；(4)乳化過程采用超聲乳化的方法，超聲均勻作用于每個納米球，使球與球之間產(chǎn)生相對運(yùn)動，從而使制備出的納米球更趨分散，球形更加規(guī)則；(5)可任意改變明膠納米球中的藥物含量，進(jìn)而制備出載藥量不同的明膠納米球。本發(fā)明所述方法制備的明膠納米球?yàn)槲ⅫS色粉末，通過掃描電鏡和粒度儀檢測發(fā)現(xiàn)明膠納米球的直徑在50 350nm范圍內(nèi)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，所制得的明膠納米球大小相對均一，分散性好，球形規(guī)則。通過本發(fā)明所制備的明膠納米球可作為藥物和基因載體用于藥物緩釋和細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)染，經(jīng)特殊修飾后還可以用于藥物或基因的靶向釋放。作為藥物載體，該方法制備出的明膠納米球可更穩(wěn)定的緩釋藥物。作為基因載體，該方法制備出的明膠納米球?qū)⒏欣诩?xì)胞吞噬和向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染基因。
圖I :實(shí)施例I制備的平均粒徑為210nm的明膠納米球掃描電鏡圖；如圖顯示，明膠納米球大小相對均一，分散良好，球形規(guī)則。圖2 :實(shí)施例2制備的平均粒徑為200nm的明膠納米球掃描電鏡圖；如圖顯示，明膠納米球大小相對均一，分散良好，球形規(guī)則。圖3 :實(shí)施例3制備的平均粒徑為140nm的明膠納米球掃描電鏡圖；如圖顯示，明膠納米球大小相對均一，分散良好，球形規(guī)則。圖4 :實(shí)施例5制備的平均粒徑為180nm的唑來膦酸明膠納米球掃描電鏡圖。如圖顯示，唑來膦酸明膠納米球大小相對均一，分散良好，球形規(guī)則。圖5 :實(shí)施例5制備的平均粒徑為180nm的唑來膦酸明膠納米球的緩釋曲線。如圖顯示，隨著明膠納米球的溶解，唑來膦酸釋放平穩(wěn)，無突釋現(xiàn)象。明膠納米球于32天時完全溶解并將唑來膦酸完全釋放。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步的闡述，而不是要以此對本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例I :取IOOmg A型明膠(購于sigma公司，膠凍強(qiáng)度175Bloom)加入到IOml水中， 60°C下溶解制備成明膠水溶液。向明膠水溶液中快速傾倒入IOml丙酮，去除上層懸濁液， 取沉淀的明膠，將沉淀的明膠再次用IOml水溶解。用濃度均為lmol/L的氫氧化鈉和鹽酸溶液將反應(yīng)體系的PH值調(diào)整為7. O。取溫度為-20°C的丙酮20ml，在超聲和冰水浴條件下將明膠溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化體系。超聲功率密度為0. 3w/cm2。然后向乳化體系中加入100 u I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊ニ醛，繼續(xù)超聲和冰水浴3分鐘后將溶液移至_20°C 條件下固化I小時，9000r/min離心,去上清后,用丙酮在超聲下清洗沉淀3次,在50°C烘箱內(nèi)烘干，從而得到明膠納米球42mg。實(shí)施例2 取IOOOmg A型明膠加入到IOml水中，60°C下溶解制備成明膠水溶液。向明膠水溶液中快速傾倒入IOml丙酮，去除上層懸濁液，取沉淀的明膠，將沉淀的明膠再次用IOml 水溶解。用濃度均為lmol/L的氫氧化鈉和鹽酸溶液將明膠溶液的pH值調(diào)整為9. O。取溫度為10°C的丙酮80ml，在超聲和冰水浴條件下將明膠溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化體系。超聲功率密度為0. 5w/cm2。向乳化體系中加入400 ill質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊ニ醛，繼續(xù)超聲冰水浴5分鐘后將溶液移至10°C條件下固化48小吋，13000r/min離心，去上清后， 用丙酮在超聲下清洗沉淀5次，在60°C烘箱內(nèi)烘干，從而得到明膠納米球486mg。實(shí)施例3 取500mg A型明膠加入到IOml水中，60°C下溶解制備成明膠水溶液。向明膠水溶液中快速傾倒入IOml丙酮，去除上層懸濁液，取沉淀的明膠，將沉淀的明膠再次用IOml水溶解。用濃度均為lmol/L的氫氧化鈉和鹽酸溶液將明膠溶液的pH值調(diào)整為7. 8。取溫度為0°C的丙酮40ml，在超聲和冰水浴條件下將明膠溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化體系。超聲功率密度為0. 4w/cm2。向乳化體系中加入200 ill質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊ニ醛，繼續(xù)超聲冰水浴4分鐘后將溶液移至(TC條件下固化24小吋，10000r/min離心，去上清后，用丙酮在超聲下清洗沉淀4次，在60°C烘箱內(nèi)烘干，從而得到明膠納米球223mg。實(shí)施例4 取800mg A型明膠加入到IOml水中，60°C下溶解制備成明膠水溶液。向明膠水溶液中快速傾倒入IOml丙酮，去除上層懸濁液，取沉淀的明膠，將沉淀的明膠再次用IOml 水溶解。用濃度均為lmol/L的氫氧化鈉和鹽酸溶液將明膠溶液的pH值調(diào)整為8. 2。取溫度為_5°C的丙酮60ml，在超聲和冰水浴條件下將明膠溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化體系。超聲功率密度為0. 5w/cm2。向乳化體系中加入300 ill質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊ニ醛，繼續(xù)超聲冰水浴4分鐘后將溶液移至0°C條件下固化3小吋，9000r/min離心，去上清后，用丙酮在超聲下清洗沉淀5次，在60°C烘箱內(nèi)烘干，從而得到明膠納米球349mg。實(shí)施例5:取500mg A型明膠加入到IOml水中，60°C下溶解制備成明膠水溶液，向明膠水溶液中迅速加入IOml丙酮,使部分明膠沉淀。將沉淀的明膠再次用IOml濃度為lmg/ml的唑來膦酸(C5HltlN2O7P2 H2O)水溶液溶解。用濃度均為lmol/L的氫氧化鈉和鹽酸溶液將明膠溶液的PH值調(diào)整為8. 5。取溫度為_5°C的丙酮40ml。在超聲和冰水浴條件下將明膠溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化體系。超聲功率密度為0. 4w/cm2。向乳化體系中加入200 ill 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊ニ醛，繼續(xù)超聲冰水浴5分鐘。將溶液移至_20°C條件下固化3小吋， 9000r/min離心，去上清后，用丙酮在超聲下清洗沉淀3次，在60°C烘箱內(nèi)烘干，從而得到唑來膦酸明膠納米球212mg。
權(quán)利要求
1.一種明膠納米球的制備方法，其步驟如下1)取0.I Ig明膠加入到IOml水中，加熱溶解制備成明膠水溶液，向該明膠水溶液中加入IOml丙酮，獲得沉淀的明膠；2)用IOml溶液溶解沉淀的明膠，并將反應(yīng)體系的pH值調(diào)整為7.0 9. 0 ;3)在超聲和冰水浴條件下用20ml 80ml丙酮乳化步驟2)的明膠溶液，得到乳化體系;4)向上述乳化體系中加入100ill 400 u I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊ニ醛，繼續(xù)超聲和冰水浴3 5分鐘，然后將溶液固化；5)最后將固化后的溶液離心，用丙酮在超聲下清洗沉淀3 5次，烘干后得到明膠納米球。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在干步驟I)中所用明膠為A型明膠，其等電點(diǎn)為7 9。
3.如權(quán)利要求I所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在干步驟2)中的溶液是水溶液或者是藥物活性物質(zhì)的水溶液。
4.如權(quán)利要求3所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在于藥物活性物質(zhì)的水溶液是脫氧核糖核酸、肽、蛋白質(zhì)中的ー種，或兩種，或三種溶解于水后形成的藥物水溶液， 濃度在 I X l(T12g/ml I X l(T2g/ml 范圍內(nèi)。
5.如權(quán)利要求3所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在于藥物活性物質(zhì)的水溶液是具有治療作用的無機(jī)物、有機(jī)物或各自相應(yīng)的鹽的水溶液，濃度在lXlO.g/ml I X KT1gAil 范圍內(nèi)。
6.如權(quán)利要求I所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在干步驟3)中超聲的功率密度為 0. 3w/cm2 0. 5w/cm2。
7.如權(quán)利要求I所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在干步驟3)中丙酮乳化明膠溶液是將明膠溶液逐滴加入到溫度為-20°C 10°C的丙酮中。
8.如權(quán)利要求I所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在于步驟4)所述的固化是在-20°C 10°C條件下固化Ih 48h。
9.如權(quán)利要求I所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在干步驟5)中的離心條件為 9000r/min 13000r/min。
10.如權(quán)利要求I所述的ー種明膠納米球的制備方法，其特征在干步驟5)中的烘干溫度為50°C 60°C。
全文摘要
本發(fā)明屬于明膠球制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種納米級、形態(tài)規(guī)則、尺寸均一、分散度好的明膠納米球的制備方法。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，是通過調(diào)整溶液pH值、明膠溶液反向滴加、低溫超聲乳化等方法，控制明膠球的尺寸，減少明膠球之間的粘連和融合，使制備出的明膠納米球球形良好，球與球之間更趨分散。該方法操作簡單，所制備的明膠納米球?yàn)槲ⅫS色粉末，直徑在50～350nm范圍內(nèi)。作為藥物載體，該方法制備出的明膠納米球可更穩(wěn)定的緩釋藥物。作為基因載體，該方法制備出的明膠納米球更有利于細(xì)胞吞噬和向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染基因。
文檔編號A61K47/42GK102604128SQ20121011512
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者倪世磊, 孫宏晨, 孫海珠, 張愷, 楊柏, 金翔宇 申請人:吉林大學(xué)