專利名稱：癌毒方在制備調(diào)控肝癌細(xì)胞TLRs／NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域的細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)，具體地說是涉及癌毒方藥物的新用途，即在制備調(diào)控肝癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物中的應(yīng)用。背景技術(shù)：
肝癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的重 大疾病之一，是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來死亡率增加了 41. 17%，其發(fā)病率和死亡率還正在逐年升高。肝癌具有發(fā)現(xiàn)晚、發(fā)展快、治療難、預(yù)后差等特點，被稱為“癌中之王”，由于其早期癥狀隱匿，多數(shù)患者就診時已屬中晚期，能手術(shù)切除者甚少，即使手術(shù)切除，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)60%以上，小肝癌復(fù)發(fā)率也高達(dá)40%-50%。西醫(yī)治療肝癌以直接對抗某一病理環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，而許多患者或為彌漫性肝癌、或伴有腹水、腎功能不全，難以接受手術(shù)、肝動脈栓塞化療、冷凍等治療。以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)治療肝癌則是對機體整體調(diào)節(jié)，發(fā)揮多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點的綜合作用，無論是在抑制、殺傷癌細(xì)胞，調(diào)節(jié)機體免疫功能，還是改善癥狀、提高生存質(zhì)量、延長生命上都顯示出獨特的優(yōu)勢。長期以來，中醫(yī)藥在治療肝癌方面取得了一定的臨床療效，尤其以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)形成的中藥復(fù)方治療肝癌更能充分發(fā)揮辨證論治和對機體整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，中醫(yī)藥抗肝癌作用越來越得到國際社會的關(guān)注和承認(rèn)，但中醫(yī)藥治療肝癌存在的核心問題是其作用機理不清，尤其是對創(chuàng)新性理論指導(dǎo)下形成的名老中醫(yī)抗肝癌效驗方的現(xiàn)代機制研究還不夠。我國著名中醫(yī)藥專家周仲瑛教授根據(jù)近六十年的臨床實踐，提出了“癌毒”學(xué)說，他認(rèn)為癌毒是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，是在腫瘤發(fā)病過程中體內(nèi)產(chǎn)生的一種特殊的病理因素，癌毒是腫瘤患者在正虛的基礎(chǔ)上，因體內(nèi)邪盛而生毒，癌毒與痰濁、瘀血、濕濁、熱毒等病理因素同時膠結(jié)存在、互為因果，亦可兼夾轉(zhuǎn)化、共同為病。癌毒一旦形成，阻滯體內(nèi)，則病變乖戾，一方面大量耗傷人體氣血津液，一方面導(dǎo)致臟腑氣血功能失調(diào),誘生痰濁、瘀血、濕濁、熱毒等多種病理因素，并耗氣傷陰，發(fā)生各種復(fù)雜證候，表現(xiàn)出邪毒囂張、難以消除、易于傳變、病情篤重、病勢兇險、正氣虛敗、預(yù)后極差等證候特點。癌毒方正是在“癌毒”理論指導(dǎo)下確立的中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的基本方。本方主要由白花蛇舌草、僵蠶、太子參、麥冬、山慈菇、蜈蚣、八月扎等組成，全方共奏清熱化痰、祛瘀散結(jié)、消癌解毒之功效，在臨床上治療惡性腫瘤患者顯示出很好的療效。在繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，如何將其有效驗方進(jìn)一步總結(jié)與驗證，是名老中醫(yī)傳承工作一項重要的課題。本研究以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株作為研究對象，探討癌毒方的抗肝癌作用機制。近年來，隨著Toll樣受體(TLRs)的發(fā)現(xiàn)及其豐富生物學(xué)功能的進(jìn)一步揭示，以及Toll樣受體/核因子-KB (TLRs / NF-kB)信號通路的部分闡明，為探討中醫(yī)藥抗癌機制開啟了新的思路與方法。本研究以TLRs / NF-K B通路為切入點進(jìn)行癌毒方抗癌機制研究。TLRs是新近發(fā)現(xiàn)的存在于生物機體中的一大類非常重要的模式識別受體(PRR)，可表達(dá)于多種免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞，機體多種免疫防御反應(yīng)(包括腫瘤免疫)均需要不同TLRs的參與。根據(jù)TLRs的信號傳遞是否包含髓樣分化因子88 (MyD88)，TLRs信號通路又分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性兩種途徑，再通過一系列反應(yīng),激活核因子-K B(NF-k B)，激活的NF-κ B進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控多種重要的細(xì)胞因子、粘附分子和趨化因子的表達(dá)，在機體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化及凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮重要的作用。目前研究比較多的是TLRs / NF-κ B通路對炎癥性疾病、自身免疫性疾病、肝臟疾病、哮喘、冠狀動脈粥樣硬化等的影響。近年來，人們發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞表面也表達(dá)TLRs，它們可被存在于局部的配體激活，刺激腫瘤細(xì)胞分泌過量腫瘤相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子，這些因子可刺激腫瘤細(xì)胞生長、血管和淋巴管生成、腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移、導(dǎo)致T細(xì)胞和NK細(xì)胞功能失調(diào)等，即腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的TLRs可能與腫瘤細(xì)胞生長、免疫逃逸及化療耐藥相關(guān)。如在人類部分黑色素瘤細(xì)胞中，透明質(zhì)烷碎片能夠通過TLR4誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子和MMP，這些物質(zhì)恰能促進(jìn)腫瘤生長，而產(chǎn)生的MMP又能溶解細(xì)胞間質(zhì)產(chǎn)生透明質(zhì)烷，這種正反饋調(diào)節(jié)形成惡性循環(huán)，加速腫瘤惡化；Kelly等研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌能通過TLR4-MyD88通路激活NF-κ B，誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤生長，同時在試驗中還發(fā)現(xiàn)卵巢癌可能通過TLR4-MyD88-NF- κ B通路抵抗抗腫瘤藥物紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡。 研究表明，TLRs / NF-KB通路有雙重作用，既可能通過增強宿主免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，又可能起保護(hù)腫瘤細(xì)胞，逃脫免疫監(jiān)視的作用。一些研究發(fā)現(xiàn)中藥可通過影響免疫細(xì)胞中TLRs / NF-κ B通路而發(fā)揮抗腫瘤作用，而中藥直接對腫瘤細(xì)胞此通路影響的研究，目前國內(nèi)外未見報導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供癌毒方在制備調(diào)控肝癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株為材料，觀察癌毒方的抗肝癌作用機制，本研究以TLRs / NF-κ B通路作為新靶點，從細(xì)胞因子表達(dá)的源頭TLRs入手，觀察癌毒方對肝癌模型鼠細(xì)胞TLRs/NF- κ B通路關(guān)鍵環(huán)節(jié)TLR4、NF- κ B、髓樣分化因子88 (MyD88)的影響探討抗癌作用機制。具體實驗如下
I材料與方法 含藥血清制備
將家兔分為中藥組和對照組，每組3只。中藥組分別以低、中、高劑量消癌解毒中藥灌胃，對照組以生理鹽水灌胃，各組每日I次連續(xù)3d，于最后一次灌胃后2h無菌取血，離心分離血清，用O. 2um微孔濾膜抽濾滅菌，經(jīng)56°C、30 min滅活以去除血清中補體，為含藥血清，置-20°C保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞培養(yǎng)及分組
人SMMC-7721肝癌細(xì)胞株在含10%新生小牛血清的DMEM/High培養(yǎng)液中，37°C，5% 二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，細(xì)胞復(fù)蘇時每天換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長滿單層細(xì)胞瓶后，以O(shè). 25%胰蛋白酶消化傳代I 2min后，待倒置顯微鏡下細(xì)胞圓縮時，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培養(yǎng)液終止消化，以彎頭滴管輕輕吹下貼壁生長細(xì)胞，吹打均勻后分至新細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加培養(yǎng)液，放入37°C，5% 二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)；分為空白對照組、空白血清+激動劑組、空白+阻斷劑組、低濃度含藥血清組、低+激動劑組、低+阻斷劑組、中濃度含藥血清組、中+激動劑組、中+阻斷劑組、高濃度含藥血清組、高+激動劑組、高+阻斷劑組12組。法觀測
MTT篩選藥物濃度的預(yù)實驗將LPS終濃度設(shè)定為2. 5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml 五個濃度梯度，0)284 終濃度設(shè)定為 O. 25ug/ml、0. 5ug/ml、lug/ml、2ug/ml、4ug/ml五個濃度梯度，分別于第12、24、48、72h進(jìn)行四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)實驗，計算增殖率。在無菌條件下，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁生長滿的人SMMC-7721肝癌細(xì)胞株以O(shè). 25%胰蛋白酶消化，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培養(yǎng)液終止消化，以彎頭滴管輕輕吹下貼壁生長細(xì)胞，吹打成均勻的單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為lX104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，陰性空白對照組每孔加入180ul細(xì)胞懸液+20ul過濾純水，實驗組中LPS及⑶284組加入不同 濃度的藥物(終濃度擴大10倍之濃度)，每組每種濃度設(shè)6個復(fù)孔，加藥后分別培養(yǎng)12、24、48、72h，之后，加入20ul/孔濃度為5mg/ml的MTT，培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入150ul的DMSO,輕輕震蕩約IOmin使其完全溶解，酶標(biāo)儀檢測490nm波長處的OD值，計算抑制率，細(xì)胞生長抑制率(IR) = (1_用藥組OD/對照組OD) X 100%，本實驗重復(fù)四次。初步確定LPS終濃度40ng/ml，⑶284終濃度4ug/ml作用24h時細(xì)胞增殖抑制率測定并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著差異(P〈0. 05)。正式MTT實驗分為激動劑組和阻斷劑組，每組分別設(shè)陰性空白對照組，在無菌條件下，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁生長滿的人SMMC-7721肝癌細(xì)胞株以O(shè). 25%胰蛋白酶消化，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培養(yǎng)液終止消化，以彎頭滴管輕輕吹下貼壁生長細(xì)胞，吹打成均勻的單細(xì)胞懸液，分裝至IOml尖底離心管，離心1000轉(zhuǎn)X6min，棄上清液后加入單培，將細(xì)胞濃度調(diào)整為IX 104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，陰性空白對照組及低、中、高濃度含藥血清組每孔加入160ul細(xì)胞懸液+20ul PBS+20ul空白、低、中、高濃度含藥血清，實驗組中LPS及⑶284組加入不同濃度的藥物(終濃度擴大10倍之濃度)160ul細(xì)胞懸液+20ulLPS或⑶284+20ul空白、低、中、高濃度含藥血清，每組每種濃度設(shè)6個復(fù)孔，加藥后分別培養(yǎng)24h，之后酶標(biāo)儀檢測490nm波長處的OD值，計算抑制率，細(xì)胞生長抑制率(IR)=(I-用藥組OD/對照組OD) X 100%,本實驗重復(fù)三次。法檢測癌毒方對TLR4、MyD88及NF- κ B蛋白表達(dá)的影響
蛋白免疫印跡雜交(Western Blot、WB)是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜(blot)上，然后通過一抗/ 二抗復(fù)合物對靶蛋白進(jìn)行特異性檢測的方法。其中的步驟包括蛋白樣本提取制備，蛋白定量，電泳，轉(zhuǎn)膜與顯色。依據(jù)MTT篩選藥物濃度的預(yù)實驗、正式試驗及流式細(xì)胞術(shù)(單、雙染)，取LPS終濃度40ng/ml，CD284終濃度4ug/ml及最佳藥物作用時間為24h，制定WB方案為陰性空白對照組、空白血清+激動劑組、空白+阻斷劑組、低+激動劑組、中+激動劑組、中+阻斷劑組、高+激動劑組、高+阻斷劑組8組。經(jīng)過蛋白樣本提取制備，Western Blotting,①SDS-PAG的制備,②樣本準(zhǔn)備和上樣電泳，將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為70ug，并于95-100°C 5min后冰上冷卻上樣。電泳條件濃縮膠恒壓60V約20min，分離膠80V約80min。③濕電轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備取出凝膠，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。準(zhǔn)備濾紙及NC膜，分別置入轉(zhuǎn)移緩沖液及去離子水中。濕電轉(zhuǎn)移平放底部電極(陽極)，在上面分別放置濾紙、NC膜、凝膠和濾紙，排除各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上。按恒流200mA通電，電轉(zhuǎn)移lh。④封閉，NC膜在5%脫脂奶粉封閉液中封閉(室溫，2h)，棄去封閉液，不洗。⑤抗體與靶蛋白結(jié)合，按約O. lml/cm2的量加入封閉液和適量一抗NFKB-P65 (1:1000), TLR2/TLR4/TRAF6 (1:500) 搖床搖蕩孵育(4°C，過夜)。PBST 漂洗濾膜4次，每次lOmin。將膜與HRP結(jié)合的二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔，二抗用封閉液稀釋)(1:5000)室溫下?lián)u蕩孵育2h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次lOmin。⑥顯影和圖像分析，按O. lml/cm2顯影液計算用量，將顯影液加于NC膜上，室溫放置lmin。用保鮮膜將膜包好(盡量避免氣泡)。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光，洗片機中顯影、洗像。調(diào)整曝光時間，直至出現(xiàn)最佳條帶。統(tǒng)計學(xué)方法
實驗數(shù)據(jù)以 ±s表示，采用SPSSI7. O統(tǒng)計軟件，根據(jù)方差齊性采用單因素方差分析和q檢驗比較各組間差異，以P〈0. 05或P〈0. 01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果
在信號通路阻斷劑、激動劑存在的情況下，觀察癌毒方對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的抑制作用如表1、2所示
表I MTT結(jié)果(I)
權(quán)利要求
1.癌毒方在制備調(diào)控肝癌細(xì)胞TLRs / NF-K B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌毒方制藥中調(diào)控肝癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的用途。癌毒方依據(jù)國醫(yī)大師周仲瑛教授癌毒理論，由蛇舌草3-20g；僵蠶3-10g；蜈蚣1-3條；八月扎3-12g；太子參3-15g；麥冬3-12g；山慈菇3-10g制成，全方以驅(qū)邪消癌解毒為主，輔以扶正，經(jīng)臨床應(yīng)用，顯示出較好的抗腫瘤療效。本發(fā)明以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721為材料，觀察該方體外抗癌作用，結(jié)果表明:癌毒方具有良好的抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的作用，該方與TLRs/NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的阻斷劑CD284有協(xié)同作用，能阻斷TLR4表達(dá)，抑制下游NF-кB蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
文檔編號A61P35/00GK102652802SQ20121011401
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者吳勉華, 周紅光, 李棟, 王明艷, 程海波, 陳海彬 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)