一種免疫增強(qiáng)劑及制備的制作方法

專利名稱：一種免疫增強(qiáng)劑及制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種免疫增強(qiáng)劑肽及其制備方法，尤其涉及ー種人工設(shè)計(jì)的通用T輔助細(xì)胞表位肽作為免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用及其制備方法。
背景技術(shù)：
表位(epitope)又稱抗原決定簇,是指免疫應(yīng)答中被特異的效應(yīng)分子或T、B淋巴細(xì)胞識別的抗原分子上的特定結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。T細(xì)胞表位是指在特異性免疫應(yīng)答中，抗原經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞處理后，由MHC分子向T細(xì)胞表面抗原受體(TCR)遞呈的線性肽段，是人為規(guī)定的存在于抗原分子上的被T細(xì)胞所識別的抗原決定簇。T淋巴細(xì)胞識別抗原遞呈細(xì)胞遞呈的抗原肽分子后，開始活化増殖，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。T淋巴細(xì)胞表位在特異性免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。 T淋巴細(xì)胞表位又分為與⑶8T細(xì)胞識別的CTL (與MHCI類分子結(jié)合)表位和OT4T細(xì)胞識別的Th (與MHCII類分子結(jié)合)表位。由于抗原所加工的部位以及MHC分子本質(zhì)的不同，使得CD4T和CD8T細(xì)胞的抗原識別存在著差異。外源性蛋白抗原由抗原遞呈細(xì)胞酶解后多與MHC II類分子結(jié)合，遞呈給CD4T細(xì)胞；而內(nèi)源性抗原多以靶細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞，于細(xì)胞內(nèi)酶解后，與MHCI類分子結(jié)合，遞呈給CD8T細(xì)胞。CTL抗原表位來自細(xì)胞內(nèi)寄生的病毒、細(xì)菌、原蟲以及腫瘤等抗原，這些抗原在細(xì)胞內(nèi)核糖體上合成后，運(yùn)送到巨大多功能蛋白酶體(LMP)分解成小肽后，被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，并進(jìn)行一定的修剪，最終形成T細(xì)胞表位，進(jìn)入MHC I類分子的凹槽，運(yùn)送到細(xì)胞膜上，再與CD8CTL細(xì)胞上TCR結(jié)合，介導(dǎo)T細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答。而Th抗原表位多來自于細(xì)胞外的抗原，細(xì)胞外源性抗原首先要被APC捕獲，送到溶酶體中，將其裂解成一定片段后，在DM分子幫助下，消除由Ii鏈引導(dǎo)進(jìn)入溶酶體的MHCII類分子上的CLIP，使得片段中的T細(xì)胞表位結(jié)合到MHCII類分子凹槽中，然后再運(yùn)送到膜上，由MHC II類分子提呈蛤OT4Th細(xì)胞，激活Th細(xì)胞以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體?；罨腡h細(xì)胞還產(chǎn)生ー些細(xì)胞因子，介導(dǎo)NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于Th細(xì)胞表位在特異性免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，所以在新型疫苗研制中Th表位選取至關(guān)重要。目前，基因工程亞單位疫苗和合成肽疫苗的弱免疫原性與MHCII類分子的限制性有夫。免疫學(xué)研究表明，大多數(shù)的疫苗抗原為T細(xì)胞依賴性抗原，這類抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體需要T輔助細(xì)胞的參與。首先，抗原被抗原提呈細(xì)胞攝取后在細(xì)胞吞噬小體內(nèi)被消化處理，產(chǎn)生的T輔助細(xì)胞表位與MHCII類抗原結(jié)合轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面，然后提呈給T輔助細(xì)胞，刺激T輔助細(xì)胞產(chǎn)生IL-2等細(xì)胞因子，促進(jìn)漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。因此，T輔助細(xì)胞表位在抗體的產(chǎn)生中起著重要的作用，只有當(dāng)T輔助細(xì)胞表位與機(jī)體MHCII相適應(yīng)時抗原才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。進(jìn)ー步的研究發(fā)現(xiàn)，外源性通用T輔助細(xì)胞表位與ー些免疫原性較弱的抗原結(jié)合后，可使其免疫原性明顯增強(qiáng)，與ー些無免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合后可使其產(chǎn)生免疫反應(yīng)，表明通用T輔助細(xì)胞表位能克服機(jī)體MHC-II分子的限制性。研究Th細(xì)胞表位通常的策略是，根據(jù)抗原蛋白的氨基酸序列隨機(jī)合成或連續(xù)合成一個或幾個重疊氨基酸的一系列肽段，是通過淋巴細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)確定可以被T細(xì)胞識別的肽段。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是，鑒定的Th細(xì)胞表位較可靠，且能發(fā)現(xiàn)ー些不符合多肽結(jié)合基序(motif)的MHC結(jié)合抗原肽。缺點(diǎn)是盲目性大，浪費(fèi)人力和物力。此外，由于MHC分子高度的多態(tài)性也可能造成漏檢，因此，在合成肽段之前，如果對其與MHC分子結(jié)合的可能性進(jìn)行預(yù)測，先篩選出最有可能的ー些抗原片段，這樣不僅可減少工作量、節(jié)省花費(fèi)，而且還能提高實(shí)驗(yàn)的成功率。在經(jīng)費(fèi)有限的情況下，它成為確定Th細(xì)胞表位的首選方法。隨著分子生物和分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是計(jì)算機(jī)科學(xué)在生物醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，Th細(xì)胞表位研究方法也在不斷更新。借助于計(jì)算機(jī)編制預(yù)測T細(xì)胞表位的軟件，能較精確地預(yù)測與MHC分子結(jié)合的肽，然后再經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這已成為目前研究Th細(xì)胞表位的常用方法并得到廣泛應(yīng)用，取得了重要進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的是提供ー種免疫增強(qiáng)劑肽，具體是ー種可以提高半抗原或者抗原免疫原性的人工通用T輔助細(xì)胞表位肽。同時，本發(fā)明提供了上述免疫增強(qiáng)劑肽的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。本發(fā)明在上述T細(xì)胞表位研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測設(shè)計(jì)了大量候選的T輔助細(xì)胞表位，進(jìn)而通過大量T細(xì)胞表位功能試驗(yàn)進(jìn)行篩選，得到了兩條以小反芻獸疫病毒為來源的T輔助細(xì)胞表位肽。再進(jìn)ー步結(jié)合多肽的親疏水性、ニ級結(jié)構(gòu)和帶電荷等情況對序列進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)，得到了兩條人工設(shè)計(jì)的T輔助細(xì)胞表位肽。本發(fā)明提供ー種免疫增強(qiáng)劑，其特征在于該免疫增強(qiáng)劑為人工設(shè)計(jì)的通用T輔助細(xì)胞表位肽，具有如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明提供了上述免疫增強(qiáng)劑肽在提高半抗原或者弱抗原免疫效果中的用途。本發(fā)明提供了上述免疫增強(qiáng)劑肽的制備方法，主要包括以下步驟(I)免疫增強(qiáng)劑肽的化學(xué)合成；(2)免疫增強(qiáng)劑肽的的裂解、沉淀；(3)高壓液相色譜分離純化免疫增強(qiáng)劑肽；上述免疫增強(qiáng)劑肽的制備方法，免疫增強(qiáng)劑肽的化學(xué)合成其特征在干，是以氨基樹脂和9芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸為原料，逐步接上氨基酸，每步接肽反應(yīng)后用こ酰咪唑封閉未反應(yīng)的活性氨基端，主要包括如下步驟(a)FMOC基團(tuán)脫除用含15% -35%六氫吡啶的ニ甲基甲酰氨(DMF)溶液在20-26°C條件反應(yīng)20-40分鐘脫除氨基上保護(hù)的FMOC基團(tuán)，氮?dú)獯蹈?，ニ甲基甲酰?DMF)洗滌樹脂；(b)接肽反應(yīng)加入I-羥基苯丙三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、ニ異丙基こ胺(DIEA)與FMOC保護(hù)的氨基酸在20_28°C條件反應(yīng)
0.5-2. 5小時，氮?dú)獯蹈?，ニ甲基甲酰?DMF)洗滌樹脂；(c)封閉反應(yīng)使用I. 5% -3. 5%的こ酰咪唑在20-26°C條件反應(yīng)15-30分鐘。上述免疫增強(qiáng)劑肽的制備方法，其中所述多肽抗原裂解所用試劑為三氟こ酸(TFA)/ 苯酚(Phenol)/H20 = 90/8/2，裂解時間為 1-3 小時。
本發(fā)明利用生物信息學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)手段，篩選得到兩條以小反芻獸疫病毒和分歧桿菌為來源的人工T輔助細(xì)胞表位。該表位肽可以作為免疫增強(qiáng)劑，顯著提高半抗原或者抗原的免疫效果。同時，該免疫增強(qiáng)劑肽質(zhì)量穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟(jì)，具有良好的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步的說明。實(shí)施例I.免疫增強(qiáng)劑肽固相化學(xué)合成本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑肽的制備可使用全自動多肽合成儀運(yùn)用經(jīng)典固相化學(xué)合成法，采用的是FMOC保護(hù)氨基酸，固相載體采用的是氨基樹脂。生產(chǎn)過程通常分為免疫增強(qiáng)劑肽的固相合成、免疫增強(qiáng)劑肽的裂解、免疫增強(qiáng)劑肽純化與除菌保存。具體步驟如下I. I免疫增強(qiáng)劑肽固相合成 I. I. I合成原料的準(zhǔn)備合成肽序列如SEQID NO :1、SEQ ID NO 2 所示。依據(jù)上述免疫增強(qiáng)劑肽的序列以及合成規(guī)模準(zhǔn)備合適的保護(hù)氨基酸，加入到相應(yīng)的氨基酸瓶中。同樣按要求稱量氨基樹脂，放入反應(yīng)腔，將上下蓋子擰紫，貼標(biāo)簽，記錄所合成肽的名稱，反應(yīng)腔的皮重及所稱樹脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制合成試劑包括DMF、AIM(己酰咪唑)、PIP (哌啶)、甲醇等放置到相對應(yīng)的試劑瓶中。1.1.2合成儀狀態(tài)的檢測檢查合成儀器是否正常運(yùn)行，開機(jī)后，運(yùn)行自檢程序，儀器自檢各項(xiàng)指標(biāo)是否正常。另外檢查氮?dú)馐欠癯渥?，系統(tǒng)表壓是否正常。合成前應(yīng)對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進(jìn)行測定。發(fā)送測試程序到合成儀，進(jìn)行測量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)上下閥門壓力，直至達(dá)到要求。
瓶號測試程序測試標(biāo)準(zhǔn)范圍Piperidine III. 0-1. 2ml
AIM5E1.0-1.2ml■
MeOH9D3. 5-4. Oml■
DIC8S0.45-0. 55g ■
DMF10 A2.6-2.8ml■I. I. 3免疫增強(qiáng)劑肽的合成開始在合成儀的程序中將要合成的氨基酸序列與合成方法發(fā)送到合成儀上。編輯合成肽的序列，保存。檢查合成方法是否正確，序列是否為所存名字，設(shè)定合成循環(huán)；確定后保存，然后運(yùn)行程序。I. I. 4免疫增強(qiáng)劑肽的合成如上述的免疫增強(qiáng)劑肽序列，合成的時候是從C端開始至N端，依照設(shè)定的程序，依次不斷地重復(fù)如下合成步驟(I)脫除FMOC保護(hù)基團(tuán)使用含25%六氫吡啶的DMF溶液在25°C條件反應(yīng)30分鐘脫除氨基上保護(hù)的FMOC基團(tuán)；
(2)洗滌樹脂氮?dú)獯蹈蓸渲?，用DMF洗滌樹脂5次；(3)接肽反應(yīng)加入HOBT, HBTU, DIEA與FMOC保護(hù)的氨基酸在25°C條件反應(yīng)I. 5小時，氮?dú)獯蹈蓸渲缓驞MF洗滌樹脂；(4)洗滌樹脂氮?dú)獯蹈蓸渲褂肈MF洗滌樹脂5次；(5)封閉反應(yīng)使用2. 5%的こ酰咪唑在25°C條件反應(yīng)30分鐘，將未反應(yīng)活性氨基封閉；(6)免疫增強(qiáng)劑肽合成后處理合成結(jié)束后從多肽合成儀上取下反應(yīng)器，再用甲醇洗滌肽樹脂5次，后在通風(fēng)廚內(nèi)吹干，然后將多肽樹脂轉(zhuǎn)移至棕色瓶內(nèi)，放入_20°C冰箱內(nèi)，封ロ膜密封備用。I. 2、免疫增強(qiáng)劑肽的裂解及鑒定I. 2. I、免疫增強(qiáng)劑肽的裂解按照比例(TFA/Phenol/H20 = 90/8/2)配制裂解液，然后從冰箱內(nèi)取出合成好多肽樹脂，放入圓底燒瓶內(nèi)，在通風(fēng)廚內(nèi)向燒瓶內(nèi)加入配制好的裂解液和磁攪拌子，然后穩(wěn)定地放置在磁力攪拌器上，室溫下持續(xù)攪拌2小時到反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，使用帶冷阱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀持續(xù)蒸發(fā)80分鐘除去粗產(chǎn)品中的TFA。然后用ニ甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后將混合在一起的樹脂用砂心漏斗過濾出來，既得到多肽抗原。I. 2. 2、免疫增強(qiáng)劑肽的鑒定免疫增強(qiáng)劑肽合成完畢后用基質(zhì)輔助激光解吸飛試時間質(zhì)譜法(MALDL-T0F)和反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)進(jìn)行定性定量分析。I. 3、免疫增強(qiáng)劑肽的分離純化免疫增強(qiáng)劑肽的分離純化采用高壓液相色譜法，色譜條件是色譜柱ODS C18 (柱規(guī) 19mmX250mmX5ii , 300A,Hypersil);流動相 A(0. 5% TFA/H20)，流動相 B (0. 5% TFA/ 乙腈)；梯度洗脫條件為30min內(nèi)從10% B變化到50% B ;檢測波長216nm ;流速為I. OmL/min ;進(jìn)樣量:20ul。實(shí)施例II免疫增強(qiáng)劑肽的安全性試驗(yàn)按照上述實(shí)施例合成如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2所示氨基酸序列免疫增強(qiáng)劑肽，按照肽含量為30ug/ml。每種肽用體重350 450g的豚鼠10只，每只皮下注射2ml ;用體重18 22g的小鼠10只，每只皮下注射0.5ml。連續(xù)觀察7日，判定是否出現(xiàn)因注射免疫增強(qiáng)劑肽引起的死亡或明顯的局部不良反應(yīng)或全身反應(yīng)。觀察結(jié)果見表2。表2 :免疫增強(qiáng)劑肽對豚鼠與小鼠的安全性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種免疫增強(qiáng)劑，其特征在于該免疫增強(qiáng)劑為人工設(shè)計(jì)的通用T輔助細(xì)胞表位肽，具有如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I所述的免疫增強(qiáng)劑在提高半抗原或者弱抗原免疫效果中的用途。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求I中所述的免疫增強(qiáng)劑的制備方法，主要包括以下步驟 (1)免疫增強(qiáng)劑肽的化學(xué)合成； (2)免疫增強(qiáng)劑肽的的裂解、沉淀； (3)高壓液相色譜分離純化免疫增強(qiáng)劑肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述免疫增強(qiáng)劑肽的制備方法，免疫增強(qiáng)劑肽的化學(xué)合成其特征在于，是以氨基樹脂和9芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸為原料，逐步接上氨基酸，每步接肽反應(yīng)后用乙酰咪唑封閉未反應(yīng)的活性氨基端，主要包括如下步驟 (a)FMOC基團(tuán)脫除用含15% -30%六氫吡啶的二甲基甲酰氨(DMF)溶液在20-26°C條件反應(yīng)20-40分鐘脫除氨基上保護(hù)的FMOC基團(tuán)，氮?dú)獯蹈桑谆柞０?DMF)洗滌樹脂； (b)接肽反應(yīng)加入I-羥基苯丙三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、二異丙基乙胺(DIEA)與FMOC保護(hù)的氨基酸在20-28 °C條件反應(yīng)·0.5-2. 5小時，氮?dú)獯蹈?，二甲基甲酰?DMF)洗滌樹脂； (c)封閉反應(yīng)使用I.5% -3. 3%的乙酰咪唑在20-26°C條件反應(yīng)15-30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述免疫增強(qiáng)劑肽的制備方法，其中所述多肽抗原裂解所用試劑為三氟乙酸(TFA)/苯酚(Phenol)/H20 = 90/8/2，裂解時間為1-3小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種免疫增強(qiáng)劑及其制備方法，該免疫增強(qiáng)劑為人工設(shè)計(jì)的通用T輔助細(xì)胞表位肽。具有如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，可以通過化學(xué)合成的方法制備。該免疫增強(qiáng)劑安全性好、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低廉，可以顯著提高半抗原或者弱抗原的免疫效果。
文檔編號A61P37/04GK102659931SQ20121011396
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者邵國虎, 陶鈺 申請人:邵國虎, 陶鈺